ラット皮質運動野の微小電極注入による機能的障害を評価するためにテスト行動の齧歯動物

この方法は、デバイスの埋め込みが長期的な運動機能に影響を与えるかどうかなど、神経工学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、エンドポイント組織型とは対照的に、継続的な行動により、研究の過程全体を通じて運動機能のリアルタイムかつ全体的な測定が可能になることです。この手順を開始するには、感染を防ぐためにセファロスポリン抗生物質を皮下注射し、疼痛管理のために非ステロイド性抗炎症薬を動物に注射します。

次に、動物の目に眼軟膏を塗り、乾燥を防ぎます。小動物の爪切りを使用して足の爪を切り、手術後の創傷治癒中に動物が縫合糸を引っ掻くのを防ぎます。その後、動物の頭部の切開部にブピバカインの皮下注射を局所鎮痛剤として投与する。

手術中に頭が動かないように、イヤーバーを使用して動物を定位固定装置フレームに取り付けます。次に、動物の内部温度を維持するために、動物の下に循環水加熱パッドを置きます。その後、ベタジン溶液とイソプロパノールスクラブを交互に使用して手術部位をこすります。.

次に、施設のプロトコルに従ってつま先をつまむことを行い、動物が手術面の下にあることを確認します。移植のために動物を準備するために、頭蓋骨を露出させるために正中線に沿って約1インチの切開を行います。綿の先端のアプリケーターを使用して骨膜を鈍く取り除き、ガーゼを使用して出血を止めます。

次に、ワニ口クリップまたは止血器を使用して周囲の組織を引っ込めます。頭蓋骨を洗浄した後、露出した頭蓋骨にシアノアクリレートベースの組織接着剤を数滴塗布して、後のステップで歯科用セメントの接着を改善します。選択した半球で、骨に傷を作ることにより、前足の動きに対応する運動皮質の領域をマークします。

1.75ミリメートルの丸みを帯びた先端の歯科用ドリルを使用して頭蓋骨の一部を取り除き、早すぎたり深すぎたりしないように特に注意してください。ドリルは、過熱を避けるために断続的に頭蓋骨に適用する必要があります。生理食塩水と軽い吸引を使用して、頭蓋骨から骨の破片を取り除きます。

穴あけ中に硬膜を傷つけないように注意してください。次に、細いロンジャーまたは湾曲したマイクロ鉗子を使用して、残りの骨を取り除きます。その後、細くフックされた45度の硬膜ピックを使用して硬膜を反射させます。

綿の先端のアプリケーターと生理食塩水を使用して、脳の表面に直接触れないように注意しながら、出血をきれいにします。運動皮質に微小電極を挿入するには、電極のシャンクがぶつからないように注意しながら、滅菌した微小電極を定位固定装置フレームのユニバーサルホルダーに慎重に取り付けます。ヘッドステージインターフェースコネクタが電極のホルダーにしっかりと保持されていることを確認してください。

定位固定装置フレーム上のマイクロマニピュレーターを使用して、電極の先端を開頭術の上に慎重に配置します。電極を脳内に約2ミリメートル静かに下げます。可能な限り、目に見える血管系を避けるように注意してください。

ここで示されているように、手動/手による挿入の場合、マイクロ鉗子を使用してシリコンの非機能的なダミー微小電極を挿入します。電極が所定の位置に配置されたら、コネクタをユニバーサルホルダーから慎重に解放し、挿入アームを引っ込めます。電極の周囲からの出血は、綿の先端のアプリケーターと生理食塩水を使用して慎重に清掃します。

その後、シリコンエラストマーを使用して、埋め込まれた電極の周りの開頭術を密閉します。次に、歯科用セメントを使用して電極を頭蓋骨に固定します。セメントが完全に乾いたら、切開部の端をセメントヘッドキャップの前面と背面で合わせ、縫合して閉じます。

機能しないインプラントの場合、切開部全体を閉じてしまうことがあります。オープンフィールドグリッドテストを開始するには、動物をテスターの反対側を向いてグリッドの中央に置きます。ビデオを録画しながら、動物が3分間自由に走るのを待ちます。

動物がテストを終えたら、グリッドから取り外し、二酸化塩素ベースの滅菌剤でグリッドを完全に清掃します。ビデオ追跡ソフトウェアを使用して、交差したグリッドラインの数、移動した総距離、および動物の最大速度を総運動機能の指標として分析します。ラダーテストの場合、手術前のベースラインスコアを記録する前に、1週間のトレーニングが必要です。

その後、動物を一時的な清潔な保持ケージに移して、はしごのテストを開始します。はしごを2つのケージに橋を架けるように設置します。はしごのスタートエンドは清潔なケージに置かれ、フィニッシュエンドは動物のホームケージに置かれ、ランを完了するためのモチベーションとして機能します。

はしごテストの撮影に使用するビデオカメラを三脚に取り付け、はしごの中央を横木の高さ付近に配置します。ビデオカメラが作動している状態で、動物をはしごのスタートラインに保持し、前足が最初の段に触れるようにします。ラットが自分のペースではしごを渡るのを待ちます。

動物の足が最初の段に触れた瞬間から、最後から3番目の段のフィニッシュラインまでの経過時間によって、動物が渡る時間が決まります。動物がはしごの上で向きを変えたり、20秒間動かない場合は、動物が失敗したと考えてください。失敗した各ランにペナルティスコア時間を割り当て、手術前のテスト中に記録された最も遅いパフォーマンスによってペナルティタイムを決定します。

各動物がテスト日に5回はしごを渡るようにし、各実行の間に約1分間の休憩を取ります。細かい運動機能の指標として、1日あたり最速の3回の実行を平均化します。さらに、ビデオ追跡ソフトウェアを使用して、各前足が横木から滑り落ちた回数を記録します。

握力テストの場合は、握力計をカウンターの端に置き、グリップハンドルバーを床に伸ばします。次に、動物が尻尾の付け根で動物を保持しながら、両方の前足でハンドルバーをつかむようにします。動物が各足でしっかりと握ったら、ゆっくりと安定した力で尾の付け根でメーターから引き離します。

動物が加えた最大握力を握力計で記録します。各動物を試験日ごとに3回、各試験の間に約2分間の休憩を挟んで試験します。細かい運動機能の指標として、3つの試行のそれぞれからの最大握力出力を記録し、平均化します。

対照群と移植群との間のオープンフィールドグリッド性能の有意差は、回復期間後の試験の最初の1週間でのみ見られました。残りの研究では、パフォーマンスに差はなく、長期的な粗大運動機能障害はなかった。回復後のテストの最初の週を除けば、コントロール動物は移植された動物よりも大幅に速くはしごを渡ります。

移植された動物は、手術前のはしごの交差速度を維持することができず、細かい運動機能の欠損の可能性を示しています。これは、インプラントを受けた脳の領域と相関する移植された動物における右足の滑りの発生の増加によってさらに支持されます。対照動物は、研究の過程で、移植された動物と比較して有意に高い握力の結果を達成することがよくありました。

さらに、移植された動物の成績は、回復直後はベースライン性能よりも大幅に低下しますが、時間の経過とともに改善され、ベースライン性能に戻りました。ここに示されているのは、ラダー性能と、血液脳関門透過性のマーカーである免疫グロブリンG蛍光強度との相関関係です。相関係数は0.901で、非常に強い相関関係が示されました。

この技術を習得すると、1回の試験セッションにつき動物あたり約30分で実行できます。この手順を試みるときは、環境変数が動物を目の前のタスクからそらす可能性があるため、環境変数を減らすことが重要です。この手順に続いて、埋め込まれたマイクロエレクトロニクスに対する細胞または組織の応答を調査するために、免疫組織化学または他の光イメージング技術を含む他の方法を実施することができる。

このビデオを見れば、デバイスの埋め込みや一次運動皮質の損傷から生じる可能性のある粗大運動障害と微細運動障害に対して、迅速でシンプルかつ再現性のあるアッセイを行う方法について十分に理解できるはずです。