人間の脂肪のための Microphysiologic プラットフォーム: 白色脂肪組織に挟まれた

この画期的な方法により、脂肪生物学の研究のために、初めて、生体外で脂肪を生き生きと健康に保つことができました。この技術の主な利点は、組織が培養中で8週間にわたって安定なままであり、周囲の天然の脂肪間質支持細胞を含む脂肪微小環境を再現することです。まず、組織培養プレートでASCを約80%のコンフルエント度で播種します。

所望のSWATの各ウェルについて、PNIPAAmコーティングされた組織培養プラスチックプレート上に、1つの従来の組織培養ウェルと対応するサイズの1つのウェルを播種する。ASCを完全培地で摂氏37度、CO25%に6〜8日間保持し、2日ごとに培地を交換します。SWAT播種の24時間前に、ゼラチン溶液の漏れを防ぐために、SWAT播種装置の各プランジャーのプランジャーディスクの縁を少なくとも2回ラボテープで包みます。

エタノール消毒されたバイオセーフティキャビネットで、空のキャップなしの15ミリリットルのコニカルチューブが入った15ミリリットルのコニカルチューブラックと、70%エタノールで包まれた各テープラッププランジャーにスプレーし、消毒しながら各プランジャーを空のチューブに入れます。約6.3グラムの金属ワッシャーをスプレーし、フック付きの鉗子と一緒にラックに置きます。次に、キャビネットサッシを閉じ、UVライトをオンにして、播種装置材料の一晩の乾燥と滅菌を促進します。

細胞が100%の密度に達し、縞模様を示したら、0.75グラムのゼラチン粉末を10ミリリットルのHBSSに加えます。そして、溶液のpHを100マイクロリットルの水酸化ナトリウムとバランスを取ります。ゼラチンを摂氏75度の水浴に加え、粉末が溶液に溶解するまで5分ごとにチューブを激しく振ってください。

均質なゼラチン溶液をシリンジフィルターで濾し、ゼラチンをプランジャーに塗布します。プランジャーのテープで留められたエッジは、ゼラチンが固化している間、型として機能します。ゼラチンが固まったら、テープを広げ、フック状の鉗子を使用してプランジャーの外縁からゼラチンを取り除き、プランジャーの中央に残っているゼラチンが完全に水平になるように注意して、ASCシートとの接触を最大化します。

ゼラチンがすべてのプランジャーから除去されたら、金属ワッシャーを使用して各プランジャーをPNIPAAmコーティングされたASCプレートに優しく適用し、プランジャーの重量を量ります。室温で1.5時間のインキュベート後、プレートをさらに1.5時間氷水浴に移し、PNIPAAmコーティングされたプレート表面からの細胞シートの解離を完了します。次に、PNIPAAmコーティングされたプレートの底を清掃して、非滅菌水を取り除きます。

ヒト脂肪組織を受領したら、播種する培養物ごとに1.5ミリリットルの微量遠心チューブ1本にコールドセル培養液を添加します。そして、脂肪組織の大部分を滅菌PBSで3回洗浄し、洗浄の合間にできるだけ多くのPBSを除去します。最後の洗浄後、鉗子と滅菌カミソリを使用して組織を粗くミンチにし、溶液が白い脂肪組織の個々のセグメントをできるだけ少なくして濃厚な液体の粘稠度になるまで、できるだけ多くの血管系と筋膜を取り除きます。

適切な組織の一貫性に達したら、改造したP1000マイクロピペットチップを使用して、適切な量のミンチ組織を事前に準備した各1.5ミリリットルチューブに移し、ミンチ組織をチューブ内の培地と短時間混合します。次に、各ASC培養液の培地を1容量の白色脂肪組織溶液と交換し、ゼラチンプランジャーをベースASCプレート上の白色脂肪組織混合物に穏やかに移します。PNIPAAmコーティングされたプレートの単層を顕微鏡で調べて細胞の剥離を確認し、プレートをバイオセーフティキャビネット内の摂氏37〜40度のヒートブロックの表面に移動します。

次に、2〜3ミリリットルの温めた培地を加えて、細胞をインキュベートし、ゼラチンの融解を促進します。30分後、プランジャーをプレート表面から静かに取り外し、培養物を適切なプレート蓋で覆い、プレートを細胞培養インキュベーターに入れます。ゼラチンが完全に液化したら、吸引して細胞培養培地をインスリン、デキサメタゾン、および抗生物質を添加した適切な量のフェノールレッドフリーM199培地に置き換えます。

7.5週間の培養で、SWATクラスターは単層上の所定の位置に固定されたままで、個々の脂肪細胞にわずかな形態学的変化が観察されるだけです。培養2週間での単房性脂肪細胞クラスターの透明なナイル赤色染色は、細胞がアーティファクト、嚢胞、または死んだ脂肪細胞ではなく、実際に無傷の膜を持つ脂肪細胞であることを示しています。53日齢のSWATのヨウ化プロピジウム染色と51日齢のSWAT培養物のオイルレッドO染色により、脂肪細胞が進行した時点でも生存能力を維持することが確認されました。

免疫細胞化学は、SWAT内の成熟脂肪細胞マーカーの適切な期待されるタンパク質発現と局在を示し、定量的PCRは転写レベルでの主要な脂肪細胞遺伝子の発現を示しています。バジル内分泌機能の評価は、ELISAによって検出されたSWAT培養物からのバジルレプチン分泌を示しており、グリセロール放出も化学刺激に応答して誘導することができる。SWAT培養脂肪細胞の異種移植は、移植後10日で、マウス脂肪細胞マーカーではなくヒトの染色である脂肪沈着物がはっきりと見え、容易に回復することが明らかになります。

このテクニックは、一度マスターすれば、適切に行えば約5時間で完了することができます。細胞死を最小限に抑えるために、一次組織を迅速に処理することを忘れないことが重要です。この手順に続いて、リアルタイム定量PCR、免疫染色、機能アッセイなどの他の方法を実行して、脂肪細胞がさまざまな薬物や毒素にどのように反応するかについての追加の質問に答えることができます。

このビデオを見た後、脂肪研究のための安定した信頼性の高いプラットフォームとしてSWAT文化を実行する方法をよく理解しているはずです。一次ヒト組織を扱う作業は危険な場合があり、この手順を実行する際には、適切なPPEを着用したり、バイオセーフティキャビネットの下で組織を取り扱うなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。