緑色蛍光タンパク質タグと 4', 6-Diamidino-2-phenylindole線虫の染色によるタンパク質細胞内局在を検出

この方法は、細胞生物学など、C.elegans分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、核染色、GFP、および細胞内局在変化のシグナルを同時に迅速かつ効率的に取得できることです。まず、標的遺伝子の翻訳構築物と一致する染色体外アレイを生成します。

あるいは、C.elegans研究の公開リソースであるCaenorhabditis Genetic Centerからそのような系統を入手してください。または、以前に公開された研究所から。線虫をガンマ線に曝露して染色体外系統をゲノムに組み込んだ後、安定して発現した系統を選択し、各動物がGFPやローラーなどのマーカータンパク質を発現するようにします。

放射線中に生成された突然変異を除去するには、少なくとも2回線を越えます。得られたトランスジェニックラインを使用して、ストレス下でのタンパク質発現パターンの変化を検出します。次に、テキストプロトコルに従ってNGMワームプレートを調製した後、OP50クローンをストリークし、細菌を液体LBブロスで一晩培養します。

NGMプレートに液体OP50培養液を播種し、プレートを摂氏37度のインキュベーターで一晩インキュベートして、ワームの食料源としてバクテリアの芝生を成長させます。プレートを室温で少なくとも30分間冷却してから使用してください。トランスジェニック系統を飢餓状態にすることなく、少なくとも2世代にわたって熱ストレスアッセイの前に

8〜10匹の若くて妊娠した成虫を新しいワームプレートに選びます。その後、約3〜5時間卵を産ませ、すべての成虫を皿から取り出します。ワームを同期させるには、卵を孵化させ、幼虫を約48時間成長させて、4番目の幼虫、またはL4ステージまで成長させます。

それは、半月形の構造である外陰部によって識別できます。次に、プレートをL4幼虫と摂氏35度で2〜5時間インキュベートすることにより、線虫に熱ストレスを与えます。温度を正確に測定するために、インキュベーターに温度計を含めます。

スライドガラスの中央に10マイクロリットルのM9をピペットで挟みます。次に、熱ショックを受けたワームを選び、それらをバッファーの液滴に移します。または、M9を使用してプレートからワームを洗い流します。

次に、サンプルを室温で重力1000倍で1分間遠心分離します。上清を捨ててから、ワームをスライドガラスに加えます。解剖顕微鏡で、軟組織を使用して余分な液体を排出します。

次に、顕微鏡下で、10マイクロリットルの95%アルコールを線虫に加え、観察を続けます。エタノールが乾いた直後に、エタノールの追加をさらに2回繰り返します。これは、解剖顕微鏡下で動物からエタノールが蒸発するプロセスにとって重要です。

エタノールが動物から外れたら、すぐに次のステップに進みます。ワームに10マイクロリットルのDAPIを追加します。すぐにカバースリップを貼り、透明なマニキュアジェルでスライドを密封します。

マニキュアを約10分間固めた後、蛍光顕微鏡で動物を観察します。アセトンで動物を固定するには、M9を使用して熱ショックを受けたプレートを洗い流し、室温で1000倍の重力でサンプルを遠心分離します。上清を捨て、1ミリリットルの蒸留水を使用してペレットを洗います。

上清を取り除いた後、400マイクロリットルの30%アセトンを加え、サンプルを15分間インキュベートします。次に、室温で重力1000倍でチューブを1分間遠心分離します。上清を捨てた後、500マイクロリットルの蒸留水を使用して動物を2回洗います。

ペレットに200マイクロリットルのDAPIを加え、またはチューブに全線虫量の4倍を加え、サンプルを15分間インキュベートします。サンプルを遠心分離し、上清を捨てます。次に、500マイクロリットルの蒸留水を使用してペレットを2回洗浄してから、前と同じようにマウントしてイメージングします。

イメージングを行うには、UV光源と蛍光顕微鏡の電源を入れます。次に、顕微鏡に接続されたコンピューターの電源を入れます。スライドを蛍光顕微鏡にロードします。

10倍の対物レンズを使用して、ワームの位置を特定します。次に、倍率を400倍に上げて、試料に焦点を合わせます。次に、顕微鏡に付属のソフトウェアを開きます。

「Acquisition」をクリックし、「Camera」をクリックして、顕微鏡に接続されているカメラを選択します。同じ [Acquisition] で [Multidimensional Acquisition] をクリックします。これにより、新しい Multidimensional Acquisition ナビゲーション ウィンドウが開きます。

マルチチャンネルボタンをクリックすると、使用可能なすべてのチャンネルが表示されます。青、緑、DICを選択して試料を観察します。[Multidimensional Acquisition (多次元集録)] ナビゲーション ウィンドウで、青色の DAPI、緑色の GFP、灰色の DIC チャネルをオンのままにし、赤色の Rhodamine や白色の Brightfield などの他のチャネルを右クリックして閉じます。

各チャンネルの露光時間を測定するには、青いDAPIチャンネルを左クリックして選択し、「測定」をクリックして自動露光時間でライブ画像を撮影します。ライブイメージウィンドウの左側で、必要に応じて露出時間を手動で調整し、[OK]をクリックします。GFP チャンネルと DIC チャンネルの露光時間を同様の方法で設定します。多次元取得ナビゲーションウィンドウで、「開始」をクリックすると、3つの異なるチャネルで3つの画像が設定された露光時間で順

ファイルを保存するには、メインメニューで[ファイル]、[名前を付けて保存]の順にクリックします。ファイル名とフォルダを入力します。ファイルをデフォルトのファイル形式として保存して、後で参照できるように詳細なイメージング情報を保持します。ファイルを他の形式でエクスポートするには、[ファイル] の [エクスポート] をクリックします。

ファイル名とフォルダを設定します。「プロジェクトフォルダを作成する」にチェックを入れて、データをより適切に整理します。ドロップダウンメニューから目的のファイルタイプを選択したら、[開始]をクリックしてエクスポートします。

C.elegansには、exl-1とexc-4の2つの塩化物細胞内チャネルタンパク質相同体があります。最近の研究では、exl-1が動物のストレス管理を調節することが示されました。ここでは、トランスレーショナルexl-1 GFPコンストラクトを動物ゲノムに組み込み、緑色蛍光exl-1を安定して発現するトランスジェニック系統を作製しました。

熱ストレス下では、exl-1 GFPは強いGFPシグナルが核と重なると、腸管領域の核に蓄積します。exl-1の細胞内局在を確認するために、エタノール固定動物とアセトン固定動物の両方でDAPI染色を行いました。どちらの方法も動物体内の核が明確であることを示し、GFP信号とDAPI信号が重なり合うことで、exl-1 GFPが実際に腸領域の核に蓄積したことが確認されています。

このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば1時間で完了します。このビデオを見れば、C.elegansのストレス下でGFPシグナルとタンパク質核移行を保存するためのクイック固定を行う方法についてよく理解できるはずです。