Name: ネクロトーシス MLKL を介した細胞膜破壊の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 学ぶ ネクロトーシスにおけるMLKL媒介細胞膜破壊の解析手法。ライブセル顕微鏡、走査型電子顕微鏡、NMR脂質結合アッセイを用いて、細胞死メカニズムを詳細に解明する実験プロトコルを提供します。

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<ol><li>Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+in+development%2C+inflammation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Necroptosis in development, inflammation and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).</li>
<li>Kaiser, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIP3+mediates+the+embryonic+lethality+of+caspase-8-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice.</a> Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).</li>
<li>Murphy, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pseudokinase+MLKL+mediates+necroptosis+via+a+molecular+switch+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism.</a> Immunity. 39 (3), 443-453 (2013).</li>
<li>Oberst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+activity+of+the+caspase-8-FLIP%28L%29+complex+inhibits+RIPK3-dependent+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis.</a> Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+complementation+between+FADD+and+RIP1+in+embryos+and+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes.</a> Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.</a> Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).</li>
<li>Dondelinger, Y., Hulpiau, P., Saeys, Y., Bertrand, M. J. M., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionary+perspective+on+the+necroptotic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">An evolutionary perspective on the necroptotic pathway.</a> Trends in Cell Biology. 26 (10), 721-732 (2016).</li>
<li>Newton, K., Manning, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26865533">Necroptosis and Inflammation.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 743-763 (2016).</li>
<li>Kaiser, W. J., Upton, J. W., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23773332">Viral modulation of programmed necrosis.</a> Current Opinion in Virology. 3 (3), 296-306 (2013).</li>
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<li>Kearney, C. J., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Inflammatory+Perspective+on+Necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">An Inflammatory Perspective on Necroptosis.</a> Molecular Cell. 65 (6), 965-973 (2017).</li>
<li>Pasparakis, M., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25592536">Necroptosis and its role in inflammation.</a> Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).</li>
<li>Sun, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+kind+of+cell+suicide%3A+mechanisms+and+functions+of+programmed+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis.</a> Trends in Biochemical Sciences. 39 (12), 587-593 (2014).</li>
<li>Grootjans, S., Vanden Berghe, T., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+and+execution+mechanisms+of+necroptosis%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Initiation and execution mechanisms of necroptosis: an overview.</a> Cell Death & Differentiation. 24 (7), 1184-1195 (2017).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+MLKL+causes+necrotic+membrane+disruption+upon+phosphorylation+by+RIP3%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3.</a> Molecular Cell. 54 (1), 133-146 (2014).</li>
<li>Cai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+translocation+of+trimerized+MLKL+protein+is+required+for+TNF-induced+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 55-65 (2014).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+to+plasma+membrane+leads+to+necrotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death.</a> Cell Research. 24 (1), 105-121 (2014).</li>
<li>Dillon, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPK1+blocks+early+postnatal+lethality+mediated+by+caspase-8+and+RIPK3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3.</a> Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).</li>
<li>Rickard, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPK1+regulates+RIPK3-MLKL-driven+systemic+inflammation+and+emergency+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis.</a> Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).</li>
<li>Kaiser, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+3-mediated+necrosis+via+TRIF%2C+RIP3%2C+and+MLKL%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).</li>
<li>Upton, J. W., Kaiser, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAI+Another+Way%3A+Necroptotic+Control+of+Viral+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection.</a> Cell Host & Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).</li>
<li>Tanzer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+signalling+is+tuned+by+phosphorylation+of+MLKL+residues+outside+the+pseudokinase+domain+activation+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Necroptosis signalling is tuned by phosphorylation of MLKL residues outside the pseudokinase domain activation loop.</a> Biochemical Journal. 471 (2), 255-265 (2015).</li>
<li>Quarato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Engagement+of+Distinct+MLKL+Phosphatidylinositol-Binding+Sites+Executes+Necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Sequential Engagement of Distinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding Sites Executes Necroptosis.</a> Molecular Cell. 61 (4), 589-601 (2016).</li>
<li>Davies, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brace+helices+of+MLKL+mediate+interdomain+communication+and+oligomerisation+to+regulate+cell+death+by+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis.</a> Cell Death & Differentiation. , (2018).</li>
<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plug+release+mechanism+for+membrane+permeation+by+MLKL%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL.</a> Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).</li>
<li>Dondelinger, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLKL+compromises+plasma+membrane+integrity+by+binding+to+phosphatidylinositol+phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates.</a> Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).</li>
<li>Llambi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BOK+Is+a+Non-canonical+BCL-2+Family+Effector+of+Apoptosis+Regulated+by+ER-Associated+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation.</a> Cell. 165 (2), 421-433 (2016).</li>
<li>Malkani, N., Schmid, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+secrets+of+fluorescent+proteins%3A+distinct+bleaching+in+various+mounting+fluids+and+photoactivation+of+cyan+fluorescent+proteins+at+YFP-excitation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation.</a> PLoS One. 6 (4), 18586(2011).</li>
<li>Perez, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+workflow+for+the+automatic+segmentation+of+organelles+in+electron+microscopy+image+stacks%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126(2014).</li>
<li>Walton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lead+aspartate%2C+an+en+bloc+contrast+stain+particularly+useful+for+ultrastructural+enzymology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).</li>
<li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), 329(2004).</li>
<li>Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((15N+and+13C-+SOFAST-HMQC+editing+enhances+3D-NOESY+sensitivity+in+highly+deuterated%2C+selectively+%5B1H%2C13C%5D-labeled+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).</li>
<li>Keller, R. <a target="_blank" href="http://cara.nmr-software.org/downloads/3-85600-112-3.pdf">The computer aided resonance assignment tutorial.</a> Cantina Verlag. , (2004).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+sequence+determinants+control+human+and+mouse+receptor+interacting+protein+3+%28RIP3%29+and+mixed+lineage+kinase+domain-like+%28MLKL%29+interaction+in+necroptotic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).</li>
<li>Tanzer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+divergence+of+the+necroptosis+effector+MLKL%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL.</a> Cell Death & Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).</li>
</ol>

膜破断24の推定死刑執行人として MLKL に関与する、我々 を組み合わせた技術のためのプロトコルを提供します。MLKL を介したネクロトーシスを調節する制御ネットワークを解読する、に加えてこれらのテクニックがない独立して使用できる他適切な生物学的システムを特徴付けるため。実質的に言えば、これらのテクニックは、中-低スループット探索ツールです。
我々 は日常的に NBB140の住セルイメージ投射を使用している-2xFV-金星-ネクロトーシスとネクロトーシス変異と小分子化学を使用して MLKL の規制を機械論的に解剖する他の MLKL 構造による仲介プローブ。特に、我々 や他のグループを示している人間、NBB の最小限の領域を含む MLKL のマウス構成ことができますひとネクロトーシスとマウス細胞株を仲介します。1 つは MLKL を介したネクロトーシスを支配する注意点は TNF、smac 模倣およびカスパーゼ阻害の組み合わせによって上流の刺激時に観察される種間の交差反応を防ぐこ...

ネクロトーシスの遺伝的要素を識別する生理・疾患1,2,3,4,の5ネクロトーシスの含意をテストするための動物モデルの使用を促進しています。RIPK3 または MLKL のノックアウト マウスは、そのネクロトーシスは人生3,6の必須ではないことを示唆開発および大人の恒常性で最小限の含意を持っていた。さらに、特定の種は動物7,8ネクロトーシスの非本質的な役割をサポート、RIPK3 または MLKL のいずれかの遺伝子を含まない。その一方で、研究室に誘導される様々 な病態とノックアウト動物モデルに挑戦、炎症、免疫、ウイルス感染9,10,ネクロトーシスの重要な役割が明らかに11,12。
ネクロトーシスは異なる免疫センサー信号によっていくつかの方法で実行されるすべての RIPK31,13,14の活性化に繋がる。アクティブな RIPK3 化順番 MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 をアクティブにし、、11,12,13,14,15,16,17,18。ほとんどが勉強した、おそらく最も複雑な方法は、RIPK3 の活性化につながる死受容体血管を結紮を分割するか apoptosis かネクロトーシス1を誘導するシグナル伝達複合体の下流の組成に基づくです。ネクロトーシスはすさまじいが好まれている RIPK1 を介したシグナル伝達機構と RIPK319,20の関与の結果です。この結果は、カスパーゼ 8、ベイでネクロトーシスを保持ネクロトーシスの推定される内因性阻害剤の薬理学的抑制遺伝的削除に簡単に優先されます。RIPK1 に結合し、RIPK3 がアクティブになります。ネクロトーシスをアクティブにする別の方法は、従事し、TIR ドメインを含むアダプター誘導インターフェロン-β (TRIF)21を介して RIPK3 をアクティブにする Toll 様受容体 TLR3/TLR4 シグナル伝達を介してです。まだネクロトーシスで死ぬことの別の方法は、直接従事し、RIPK322をアクティブに DNA センサー台の活性化です。
MLKL N 末端ヘリックス バンドル (NB) ドメインと規制ブレース地域3によってリンクされている C 末端 pseudokinase ドメイン (psKD) から成る細胞内蛋白質であります。正常細胞の MLKL はどこ RIPK314と非アクティブな複合体であると考えられる細胞質にあります。ネクロトーシスの活性化は、psKD、および NB とブレースの3,15,23で可能性のある追加のサイトの活発化のループの MLKL の RIPK3 のリン酸化をトリガーします。リン酸化は、RIPK314から解離による MLKL の構造変化を誘導します。不十分な理解の構造変化は、psKD24からブレースを解放します。2 本のヘリックスが含まれ、ブレースは、C ターミナル螺旋形25推定三量体に MLKL の重合を仲介します。ブレースの N 末端ヘリックスは、膜透過24,26のために不可欠である NB ドメインを阻害します。分離、NB ドメインは細胞膜透過とネクロトーシス16,24,27を誘導するために十分です。NB の pro necroptotic 活性は、マウス胚性線維芽細胞 (mlkl-/- MEFs) MLKL 欠損で再構成されました。NB は優先的に従事するリン脂質ホスファチジルイノシトール 4, 5 二リン酸 (PIP2) 脂質結合ドメインです。ブレース重合が PIP2極性基24NB の弱い相互作用を介して細胞膜と MLKL の採用を促進する前記 MLKL の活性化の段階的な機構を提案する.膜では、NB は、PIP2のため非アクティブな MLKL 内のブレースによってマスクされます追加の高親和性結合サイトの規制の露出を経る。全体的にみて、PIP2と NB の複数の相互作用は、これらのイベントの分子メカニズムが解明されていないが膜の破断につながる不安定します。
ここで我々 はネクロトーシス24の死刑執行人として MLKL の機能を特徴付けるために使用する特定のメソッドを示しています。特に、我々 は MLKL, NB, ブレース (NBB) ブレース阻害によって規制されており膜破裂とネクロトーシスを誘発する強制二量体化してアクティブになることができますの最も最小限のドメインに焦点を当てます。強制薬物誘発性 FKBP を介した二量体化住セルイメージ投射とネクロトーシスになる細胞の電子顕微鏡観察のために結合した発現システムについて述べる。さらに、NBB フォスファチジルイノシトール (PIPs) との相互作用の in vitro NMR 分析を示す.

<table><tbody><tr><td>Cloning and cell line generation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pRetroX-TRE3G</td><td>Clontech</td><td>631188</td><td></td></tr><tr><td>Tet-On transactivator plasmid</td><td></td><td></td><td>Llambi et al., 2016</td></tr><tr><td>Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/-</td><td></td><td></td><td>Dillon et al., 2014</td></tr><tr><td>Blasticidin S Hydrochloride</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP2647100 CAS#3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td>細胞死定量化および生細胞顕微鏡</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ドキシサイクリン</td><td>Clontech</td><td>631311 CAS# 24390-14-5</td><td></td></tr><tr><td>B/B ホモ二量化器 AP20187</td><td>宝</td><td>635059 CAS# 195514-80-8</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Syto16</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>S7578</td><td></td></tr><tr><td>NMR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 N 塩化アンモニウム</td><td>ケンブリッジ同位体研究所</td><td>NLM-467-10 CAS# 12125-02-9</td><td></td></tr><tr><td>重水素化</td><td>DTT ケンブリッジ同位体研究所</td><td>DLM-2622-1</td><td></td></tr><tr><td>酸化重水素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>617385-1 CAS#7789-20-0</td><td></td></tr><tr><td>n-ドデシル-&β;-D-マルトピラノシド</td><td>アナトレース</td><td>D310 CAS#69227-93-6</td><td></td></tr><tr><td>L-&α;-ホスファチジルイノシトール-4,5-ビスホスフェート(脳、ブタ)(アンモニウム塩)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840046X CAS#383907-42-4</td><td></td></tr><tr><td>1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホイノシトール(アンモニウム塩)(18:0 PI)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850143 CAS#849412-67-5</td><td></td></tr><tr><td>1,2-ジオレオイル-SN-グリセロ-3-ホスホ-(1'-ミオイノシトール) (アンモニウム塩) (18:1)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850149 CAS# 799268-53-4</td><td></td></tr><tr><td>Specialized Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte FLRまたはZOOM</td><td>Essen BioScience, Inc.</td><td></td><td>生細胞顕微鏡イメージング</td></tr><tr><td>Helios NanoLab 660 DualBeam&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Electron microscope</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR)</td><td>Essen BioScience, Inc.</td><td>http://www.essenbioscience.com</td><td>イメージング解析</td></tr><tr><td>FEI MAPS</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>https://www.fei.com/software/maps/</td> <td>EM解析</td></tr><tr><td>TopSpin v3.2</td><td>Bruker BioSpin</td><td>http://www.bruker.com</td><td>NMRデータ収集</td></tr><tr><td>CARA v1.9.1.7</td><td></td><td>http://cara.nmr.ch/&nbsp;</td><td>NMRデータ解析</td></tr><tr><td>Slidebook</td><td>3i (Intelligent Imaging Innovations)</td><td>https://www.intelligent-imaging.com/slidebook</td><td>共焦点顕微鏡</td></tr></tbody></table>

ネクロトーシス mlkl を介した細胞膜破壊の解析

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

ネクロトーシスはし、混合系統キナーゼのようなドメインの pseudokinase、MLKL の破裂や permeabilize 血しょう膜を活性化するタンパク質キナーゼ 3 (RIPK3) を相互作用する受容体の活性化によって引き起こされるプログラムされた細胞死経路.ネクロトーシスは自己免疫、感染症や心血管系疾患や脳卒中、神経変性、がんを含む複数の疾患に関連付けられている炎症経路です。ここでは、ネクロトーシス膜破裂の死刑執行人として MLKL を特徴付けるために使用できるプロトコルについて述べる。我々 はネクロトーシス従来および共焦点蛍光顕微鏡を用いた生細胞イメージングを用いた細胞およびプラズマへの細胞質から MLKL の再分配を一緒に明らかに電子顕微鏡を用いた固定細胞プロセスを視覚化します。血しょう膜の大きな穴の誘導の前に膜。MLKL を介したネクロトーシスの推定される変調器を識別するために脂質を用いた核磁気共鳴 (NMR) 分析体外を提案します。本法に基づき、特定定量的脂質結合の好みホスファチジルコリン イノシトールリン酸 (PIPs) 膜ターゲットとネクロトーシスに透過に必要な MLKL の重要なバインダーとしてします。

最小限切り捨てられた MLKL 構築、NBB140の発現誘導を介して可能にされている生きているセルの規制ネクロトーシス実行を可視化する-2xFV-金星。このコンス トラクターは、膜透過を誘導する能力を維持し、FKBP カセット (2xFV) Dim 誘起重合を介して活性化します。我々 を観察して生細胞顕微鏡イメージング、監視速度論的 (5 分ごと) 細胞不浸透性の緑色蛍光 DNA 結合色素 (図 6A) の取り込みによるネクロトーシスを定量化します。この誘導システムは非常に堅牢とmlkl-/- MEFs の完全なネクロトーシスは NBB140をエクスプレス Dox 虫の細胞の点心を介した重合時 ~ 1 h 内観察できる-2xFV-金星 (図 1A).我々 はこれらの条件を高速動力学ネクロトーシスと呼びま...

走査型電子顕微鏡および NMR による脂質結合ネクロトーシス従来および共焦点の生細胞顕微鏡イメージングなどの MLKL を介した膜破断の法を述べる。

ネクロトーシス MLKL を介した細胞膜破壊の解析

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

これらの方法は、膜転座や脂質結合の透過化などのネクロプトーシスにおける偽キナーゼ混合系統キナーゼドメイン様またはMLKLの役割に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。これらの技術の主な利点は、ネクロプトーシスにおける原形質膜破裂の執行者としてMLKLを直接関与させることです。生細胞イメージングは、特にMLKLを介したネクロプトーシスにおいて、細胞死研究の分野に革命をもたらしました。核磁気共鳴は、MLKLで実証されているように、タンパク質への脂質結合をモニタリングするための強力な技術です。まず、オリゴマー化カセットとVenusに融合したMLKLの死刑執行ドメインを発現するMLKLノックアウトマウス胚性線維芽細胞またはMEFを、1ミリリットルの補充DMEMに24ウェルプレートで5回10回10回プレーティングし、細胞培養インキュベーターで一晩インキュベートします。翌朝、ドキシサイクリンで細胞を12時間処理して導入遺伝子の発現を誘導し、続いてFK506結合タンパク質二量体化剤と膜不透過性緑色蛍光色素を添加した標準DMEMを添加してネクロプトーシスを誘導します。細胞死をモニターするには、プレートを哺乳類組織培養インキュベーターに収容された適切なイメージングユニットに置き、イメージングシステムソフトウェアを開きます。「スケジュール・カミング・カッシング・スキャン」タブを選択し、「物理レイアウト」タブでトレイ、容器、スキャン・タイプ、スキャン・パターンを選択します。「Properties」タブで「fast fluorescence」を選択し、「Timeline」ウィンドウをクリックし、取得の時点と頻度の合計数をクリックして、スキャン時間を追加します。次に、[適用]をクリックして画像取得を開始します。ネクロプトーシスを定量化するには、タスクペインを選択し、マウスカーソルを複数の画像の背景上に置いて、背景レベルより上の固定セグメンテーションしきい値で新しい分析をカウントするオブジェクトを設定します。次に、[プレビュー] を選択して現在の画像内の蛍光オブジェクトを調べ、必要に応じてしきい値レベルを調整します。閾値の慎重な選択は、プレート上のマルチウェルを観察し、ソフトウェアのプレビュー機能を使用して実行できます。プレート内のすべてのウェルに同じしきい値設定を使用することに注意してください。緑色の蛍光カウントを統合するには、[Launch New Analysis]タブで、分析する時間範囲とウェルを選択し、分析ジョブ名を入力します。次に、[OK]をクリックし、ジョブ名をダブルクリックして、適切なグラフ作成ソフトウェアプログラムでの追加分析のためにデータをエクスポートします。核磁気共鳴分光法またはNMRによるMLKLの脂質結合には、気密シリンジを使用して、目的のリン脂質1ミリリットルあたり1ミリグラムを個々のNMR滴定シリーズ用のクリーンなガラスバイアルに分注し、バイアルをアルゴンまたは窒素のガス流下に5〜30分間置きます。クロロホルムやメタノールなどの揮発性溶媒からの脂質分注は、溶媒の蒸発によるサンプル間の脂質濃度の不整合を最小限に抑えるために、ドライアイス上に保管された備蓄から迅速に行う必要があります。蒸発期間の終わりに、大きなピンセットを使用して、バイアルをブフナーフラスコの底に配置します。フラスコをゴム栓で密封し、真空ラインに接続されたプラスチックチューブを取り付けて、バイアルの内容物を穏やかな真空下で一晩排気し、残留有機物を取り除きます。翌朝、脂質膜を有する各ガラスバイアルに適切な実験濃度の界面活性剤を添加したNMR緩衝液を添加し、バイアルを最大30分間水浴中で超音波処理し、10分ごとに超音波処理を停止して脂質膜の可溶化を確認する。超音波処理の終わりに、バイアルを15分間冷却し、界面活性剤陽性NMR緩衝液中で脂質界面活性剤ミセルの段階希釈を行い、所望の濃度シリーズについて1:1混合物を超音波処理する。界面活性剤陰性NMRバッファーおよび界面活性剤陽性NMRバッファー中のタンパク質および添加剤のNMRサンプルをそれぞれ調製し、界面活性剤陽性バッファー中の各脂質希釈液にタンパク質および添加剤を添加します。次に、適切な量のサンプルを適切なサイズのNMRチューブに移し、サンプルをNMR装置にロードします。MLKLノックアウトMEFの完全なネクロプトーシスは、融合した導入遺伝子を発現するドキシサイクリンプレインキュベート細胞の二量体媒介オリゴマー化から1時間以内に観察できます。この高速動態ネクロプトーシスは、原形質膜破裂の推定執行人としてのMLKLの役割を支持し、その結果、細胞末梢の二量体と金星コードによる治療から1〜2分以内に血漿膜関連金星点が産生され、2〜3分以内に細胞が徐々に丸められます。高速ネクロプトーシス下では、細胞はオリゴマー化から5分以内に通常の細長い形状から丸みを帯びて膨潤し、10分で部分的に破裂し、20分で消失したサイトゾルで広範囲に解体されます。NMR分光法でモニターされたin vitro脂質結合実験では、脂質結合によるMLKL実行ドメインタンパク質の主要な構造変化が明らかになり、阻害ブレース領域が閉じたN-ヘリカルから開放型で天然変性のコンフォメーションに置換され、両方のコンフォーマーの混合物に関する残基ごとの情報が得られます。また、特定のサンプル中の閉配座異性体と開放配座異性体の割合をモニターすることもでき、MLKL実行ドメインとリン脂質との相互作用を裏付ける証拠を提供し、MLKLと原形質膜との直接的な関連性を示唆しています。したがって、この手順を使用して細胞死を定量しようとする際には、DNA結合色素が通常の遺伝的にコードする蛍光タンパク質よりも高い閾値蛍光を持っていることを知り、覚えておくことが重要です。このため、これらは並行して使用できます。また、ミセル脂質は温度に敏感であるため、NMRサンプルの温度を最適化する必要がある場合があることにも注意してください。したがって、この手順に続いて、全反射顕微鏡法や電気顕微鏡法などの他の手法を使用して、ネクロプトーシスを受けている細胞で細胞破裂がどのくらいの速さで起こるか、そして破裂が原形質膜のどこに局在しているかに対処することができます。さらに、マイクロスケールの熱泳動を実施して、ミセル脂質へのMLKL結合を直交的に検証できます。このビデオで説明されている技術は、ネクロプトーシスの分野の研究者が、原形質膜破裂の執行人としてのMLKLの役割を探求する道を開きました。クロロホルムでの作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは、手袋を着用したり、換気の良い場所で作業したりするなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

characterization-mlkl-mediated-plasma-membrane-rupture

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここでは、隣接する死細胞または死にかけている細胞との物理的相互作用によって生存細胞に誘発される細胞内シグナル伝達イベントを決定するためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、死細胞の食作用取り込みまたは可溶性メディエーターの放出とは対照的に、死細胞の受容体媒介認識によって誘発されるシグナル伝達イベントに焦点を当てています。...

隣接セル受けてアポトーシス細胞死との相互作用によって生細胞に誘導されるイベントを細胞内シグナルの同定

このプロトコルを記述する簡易分離し培養 6 7 日古い子犬、CGNs の損失のための効率的な伝達と機能の研究、益からプライマリ マウス脳顆粒ニューロン (CGNs) と nmda 刺激による神経毒性、モデリング法低カリウムによって誘導される細胞死、DNA...

神経細胞死とマウス プライマリ小脳顆粒ニューロンの変性をモデリング

蛍光顕微鏡を使用し、アクティブなカスパーゼ 1 のアダプター、ASC 染色細胞単位で炎症: NLRP3 インフラマソーム活性化の検出について述べる。乳酸脱水素酵素のリリースの試金である人口に基づいて pyroptotic 換散を検出する.

インフラマソーム活性化とマウス骨髄由来マクロファージにおける Pyroptotic の細胞死の検出

ここで細胞の蛍光イメージング解析による効率を再封止膜を測定する高スループット蛍光を用いた測定について述べる。この試金は、薬や哺乳類細胞における原形質膜を再シールするターゲット遺伝子をスクリーニングするために使用できます。...

哺乳類細胞における効率を再封止膜の高スループット測定

免疫蛍光染色中のチラミドシグナル増幅により、HSV-1感染後のZBP1誘発ネクロトーシス中のリン酸化RIPK3およびMLKLの高感度検出が可能になります。...

ヒト細胞におけるHSV-1感染後のRIPK3およびMLKLのZBP1依存性リン酸化の免疫蛍光染色のためのチラミドシグナル増幅

このプロトコルは、PMA 分化型 THP-1 マクロファージの LPS および ATP...

PMA分化型THP-1マクロファージのLPSおよびATP誘発死とその検証

このプロトコルは、リソソーム膜の完全性と酸性化の変化を検出する蛍光プローブを利用して、ネクロプトーシス中のリソソーム膜透過性をモニタリングするための生細胞イメージング法を説明しています。...

ネクロプトーシス中のリソソーム膜透過処理の生細胞イメージング

我々は内部全反射し、落射蛍光顕微鏡を用いて培養アストロサイトにおける膜とグローバルな細胞内カルシウム動態の近くで測定する方法について説明します。...

アストロサイトの細胞膜とグローバル細胞内カルシウム動態の近くの測定

規制エンドサイトーシスは、膜タンパク質の大部分の細胞表面発現レベルを制御します。ここでは、ドーパミントランスポーター（DAT）、ポリトープ膜​​タンパク質のエンドサイトーシス率を測定するために還元、膜非透過性ビオチン化試薬を利用する。メソッドは、ほとんどの細胞膜タンパク質のエンドサイトーシス率を測定するための直接的なアプローチを促進する。...

リバーシブルビオチン化によって原形質膜タンパク質エンドサイトーシス率を測定

このプロトコルは、フローサイトメトリーにより細胞質から細胞の形質膜へのGLUT4のトランスロケーションを定量化するために迅速なテクニックを説明します。...

フローサイトメトリーによる細胞膜へのGLUT4転の定量的測定

学ぶ ネクロトーシスにおけるMLKL媒介細胞膜破壊の解析手法。ライブセル顕微鏡、走査型電子顕微鏡、NMR脂質結合アッセイを用いて、細胞死メカニズムを詳細に解明する実験プロトコルを提供します。

ネクロトーシス MLKL を介した細胞膜破壊の解析

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