蛍光レポーターの pH 依存性を用いたフローサイトメトリー流 mt 桂馬によって Mitophagy の高感度測定

この手順の全体的な目標は、フローサイトメトリーを使用して細胞のマイトファジー活性を測定するための高感度な技術を提供することです。ここでは、この方法が、ミトコンドリアのアンカプラーであるCCCPによる治療後のHeLa細胞マイトファジーの劇的な増加を評価するために成功したことを示しています。この技術により、マイトファージの活性を非常に迅速かつ容易に測定することができます。

この手法の主な利点は、追加の染色なしで生細胞内のマイトファージ活性を高感度に測定できることです。したがって、この技術は、最終的にはマイトファージのメカニズムと生理学的役割を理解するのに役立ちます。その手順を実演するのは、私の研究室のオム・ジヒョンとキム・ヨンヨンです。

この手順は、ミトコンドリアを標的とするKeima レンチウイルスであるmt-Keimaを調製することから始めます。まず、ポリ-L-リジンをコーティングした培養皿にHEK293T細胞を播種し、組織培養インキュベーターで摂氏37度で1日培養します。翌日、メーカーの指示に従って、トランスフェクション試薬を使用して、mt-Keima lentiviral DNAとパッケージングDNaseでHEK293T細胞をトランスフェクションします。

トランスフェクションを8時間行った後、トランスフェクション培地を取り出し、8ミリリットルの新鮮な培地を加えます。48時間後にウイルス粒子を含む培地を回収し、遠心分離により細胞の破片を除去します。次に、0.45マイクロメートルのシリンジフィルターでウイルス含有培地をろ過します。

mt-Keima lentivirusを採取する前日にHeLa-Parkin細胞を60mm培養皿に載せ、4ミリリットルの増殖培地を用いてインキュベーター内で37°Cで1日培養します。翌日、増殖培地を取り出し、mt-Keimaウイルス培地を1mm加え、さらに3マイクロリットルのポリブレンストック溶液を含む増殖培地を2ミリリットル加え、CO2インキュベーターで1日細胞をインキュベートします。感染後24時間でウイルス培地を除去し、細胞をPBSで2回洗浄し、4ミリリットルの増殖培地を加えます。

感染していない細胞を除去するには、ピューロマイシン1マイクロリットルあたり2マイクログラムで細胞を2日間処理します。10マイクロモルCCCPを含む新鮮な培地を調製します。培養培地を取り出し、CCCPを含む4ミリリットルの新鮮増殖培地を加えます。

細胞を摂氏37度でCO2インキュベーターで6時間インキュベートします。増殖培地を取り出し、細胞をPBSで一度洗浄します。トリプシンEDTA溶液で処理することにより、細胞を剥離します。

遠心分離により細胞を回収し、1ミリリットルのPBSに再懸濁します。細胞をFACSチューブに移し、氷の上に置きます。フローサイトメトリーの場合は、フローサイトメーターの電源を入れ、解析ソフトウェアを起動します。

新しい実験を生成し、パラメーターウィンドウで紫色レーザーにBV605を、黄緑色レーザーにPE-CF594を選択します。まず、mt-Keima lentivirusに感染していない細胞の対照サンプルを実行します。前方散乱光と側面散乱曲線のプロットでは、多角形のアイコンを使用して、生細胞の周囲にゲートを描き、死んだ細胞と細胞の破片を排除します。

次に、mt-Keima lentivirusに感染したHeLa-Parkin細胞を泳動します。BV605対側方散乱計のドットプロットでは、mt-Keimaを発現するHeLa-Parkin細胞とmt-Keimaを発現しない対照細胞が明確に区別されるように電圧を調整してください。次に、PE-CF594とサイドスキャターのドットプロットで、mt-Keimaを発現するHeLa-Parkin細胞と制御細胞が明確に区別されるように電圧を調整します。

次に、BV605とPE-CF594のドットプロットで、ポリゴンアイコンを使用してゲートを描画してmt-Keima陽性細胞集団を選択します。次に、BV605 と PE-CF594 のドットプロットをもう 1 つ作成し、mt-Keima ゲートセルのみを表示します。このドットプロットでは、未処理のmt-Keima陽性細胞の周囲にゲートを描きます。

このゲートはローゲートと呼ばれます。次に、低いゲートの上の領域を含む別のゲートを描画します。このゲートは、マイトファジー活性の高い細胞が含まれているため、ハイゲートと呼ばれます。

次に、[Show Population Hierarchy] メニューを選択します。[Percent of Parent] の値は、mt-Keima 陽性集団のうち、ハイゲート内のセルの割合を表します。次に、各サンプルを実行し、mt-Keima 停止ゲートで少なくとも 10,000 個のイベントを記録します。

mt-Keimaを発現する未処理のHeLa細胞のフローサイトメトリー解析では、マイトファジーレベルが低いことが示されました。CCCP処理は、ハイゲートのマイトファジー細胞の劇的な増加を誘発しました。マイトファジー細胞の割合は、CCCP治療の6時間後に10倍以上増加しました。

このCCCP治療によるマイトファジーの増加は、バフィロマイシンAとの併用治療により完全に解消されました。mito-Keimaを発現する細胞の準備が整うと、フローサイトメトリーを用いたマイトファージ測定は、適切に準備されていれば1時間以内に行うことができます。フローサイトメトリーによる正確なマイトファージ解析のためには、正しいハイゲートとローゲートを設定することが重要です。新しい種類の細胞を解析する際には、HeLa細胞などのよく知られた細胞をコントロールとして用いる必要があります。

さらに、マイトファージは、ミトコンドリアタンパク質の減少やミトコンドリアDNAの減少などの追加の特性によって完全に確認する必要があることを覚えておくことが重要です。この手法は、さまざまな細胞タイプに適用できます。このビデオを見れば、フローサイトメトリーによるマイトファージの解析方法について十分に理解できるはずです。