Name: 一次培養マウス腸クロム親和性細胞のセル全体を電気生理学 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 学ぶマウス腸クロム親和性細胞の一次培養と細胞全体電気生理学的手法。単一細胞レベルでEC細胞の興奮性と管腔刺激応答を詳細に解析し、消化管生理とホルモン放出メカニズムの理解を深める革新的技術です。

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著者は、行政支援のため夫人リンゼイ バズビーとメイヨー クリニック部門のエンジニア リング設計と文化料理挿入の 3 D プリントから氏ロバート感じてありがとうございます。この作品は、AB と NIH 消化器 (NIH P30DK084567) と 2015 アメリカ消化器病協会研究学者賞 (AGA RSA) における細胞シグナル伝達の NIH K08 AB (DK106456)、パイロット、メイヨー クリニックから AB に可能性の助成金によって支えられました。GF (DK52766) に R01。

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<li>Raghupathi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+unique+release+kinetics+of+serotonin+from+guinea-pig+and+human+enterochromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Identification of unique release kinetics of serotonin from guinea-pig and human enterochromaffin cells.</a> The Journal of Physiology. 591, Pt 23 5959-5975 (2013).</li>
<li>Nozawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPA1+regulates+gastrointestinal+motility+through+serotonin+release+from+enterochromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">TRPA1 regulates gastrointestinal motility through serotonin release from enterochromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3408-3413 (2009).</li>
<li>Reimann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+functional+role+of+voltage+gated+cation+conductances+in+the+glucagon-like+peptide-1+secreting+GLUTag+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line.</a> The Journal of Physiology. 563, Pt 1 161-175 (2005).</li>
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完全に EC 細胞機能を理解すると、全細胞電気生理学のための細胞を生成する高品質培養法が必要です。消化管上皮初代培養は、低い生存のため従来難しかった。この交絡要因を緩和する、現在メソッドは、数日間存続が可能な小規模または大規模な腸から単数形の EC 細胞の培養を生成します。
次が電気生理学に合うように文化の質の向上にとって重要なことが分かった: (1) 粘膜を反転ではなく剥離 (2) 文化メディアに消化メディアと FBS に BSA の少量を追加する、(3) を下げることで、コラゲナーゼ XI の濃度、(4) 期間と数を増やす機械攪拌の強度と ROCK 阻害剤と、培養 (6) 低濃度で細胞外マトリックスをめっき (5) 単一細胞の健康を調整します。
同様に、次の適応されたパッチを固定しながら全体のセルを取得するため重要な: (1) (2) させる EC 無血清細胞外の溶液で文化とすすぐ細胞、少なくとも 4 時間のため細胞外の溶液に立つ (3)電極のようないずれかを転用過ごした失敗したシールからのそれら-次の EC のセルは、(...

胃腸の (GI) 上皮は、いくつかの細胞の種類から成る多様なコミュニティです。Enteroendocrine 細胞を構成するほぼすべての上皮細胞の 1%、(EC) クロム親和細胞 enteroendocrine 細胞人口1の最大。最近の研究では、enteroendocrine2と EC3,4細胞が電気的興奮を示します。主な EC 細胞電気生理学を理解することに興味を持っております。したがって、本研究の目的は、全細胞の電気生理学のために最適化されたプライマリ EC 細胞培養を確立するだった。
生産 5-HT (例えばQGP 15BON6:KRJ 17) を分泌すると電気生理学5,8を調べるに使用されている行は、通常から生成されます既存の EC 細胞不死化腫瘍組織。これらの細胞から得られる情報は貴重な5,8一次電池電気生理学の研究が EC 細胞生理学を正しく理解する必要です。一次の EC 細胞の電気生理学には、分離と上皮文化の低い生存率によって制限されており、単一の上皮細胞の培養が必要です。
本論文で示した培養法は、Tph1 CFP9、この研究で使用されるのような蛍光に分類された EC 細胞を持つトランスジェニック マウスに依存します。メソッドの最適化混合プライマリ上皮文化を開発した単一細胞の電気生理学32,10 。以前の方法酵素消化のトリプシン EDTA/プラス コラゲナーゼ A または EDTA と DTT の組み合わせ、特に特定し文化11モルモットおよびラット EC 細胞12密度勾配を使用します。もっと最近、腸 organoids が生成され、機械的に電気生理学的記録4中断します。セロトニン Rt-qpcr 分析実験をリリースし、生理、使用できる時間がかかる organoid 世代、EC 細胞を識別するために密度勾配の成功に依存して、これらのメソッドを使用してカルチャが適していて、トリプシンと EDTA の細胞の破壊的な効果。対照的に、ここで説明されているプロトコルは、酵素、力学的処理を向上し、培養条件を最適化、シングルと健全な EC 細胞電気生理学に必要な高い携帯電話規格に適合を生成するための手順を合理化します。
このメソッドは、プライマリ EC 細胞不死化文化よりもむしろ混合文化の仕事をしたいし、単一細胞の電気生理学を調査する科学者の役に立つでしょう。ただし、並べ替えまたは長期的な文化サバイバル過去 72 時間を必要とする必要がありますセル人口の勉強はあまり適して証明するかもしれない。

<table><tbody><tr><td>100 mm x 15 mm 培養皿</td><td>Corning (Falcon)</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清ピペット</td><td>Corning (Falcon)&nbsp;</td><td></td><td></td>357551</tr><tr><td>50mLコニカル</td><td>コーニング(ファルコン)&nbsp;</td><td></td><td></td>352098</tr><tr><td>15 mL コニカル</td><td>コーニング (ファルコン)&nbsp;</td><td></td><td></td>352097</tr><tr><td>1,000 mL バリアピペットチップ</td><td>Thermo Scientific (Art)</td><td>2079E</td><td>無菌状態を保つ</td></tr><tr><td>MatTek ガラス底皿</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>無菌</td></tr><tr><td>マイクロ解剖鉗子 - 非常に細かく、超長尺ポイント</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>SB12630M</td><td></td></tr><tr><td>外科用ハサミ - シャープ</td><td>Nasco</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>マイクロダイセクションはさみ</td><td>Nasco</td><td>SB46568M</td><td></td></tr><tr><td>Monoject Hypo Needle, 21 G x 1" A, 100/BX</td><td>Covidien</td><td>8881250172</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice</td><td>Jackson</td><td>Stock # 028366</td><td>4-7週齢の雄または雌マウスを使用</td></tr><tr><td>Microfil 非金属シリンジ針 (34 ゲージ、67 mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm "M" Laboratory Film</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R6101</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 mL syringe with regular luer tip</td><td>Monoject</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 mL シリンジ レギュラールアーチップ付き</td><td>Monoject</td><td></td><td></td></tr><tr><td>電気生理学 装置</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>データ収集システム (daq)</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>シグナルコンディショナー</td><td>Molecular Devices</td><td>CyberAmp 320</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.6</td><td></td></tr></tbody></table>

一次培養マウス腸クロム親和性細胞のセル全体を電気生理学

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

腸クロム親和性 (EC) 胃腸の (GI) 粘膜上皮細胞 enteroendocrine 細胞の最も大きい subpopulation を構成します。専門にされた感覚的な細胞として EC 細胞内腔刺激を感知し、セロトニン (5-hyroxytryptamine、5 HT) リリース イベントに変換します。ただし、文化と特定することは困難であるために、これらの細胞の電気生理学はよくわかっていません。この論文概要主な EC 細胞培養の手法は、単一細胞の電気生理学の最適化されています。このプロトコルでは、電圧と電流クランプ モードでセル全体を電気生理学の高品質の録音を取得するアプローチを進める混合の初代培養マウス EC 細胞を識別するために遺伝子組換えシアン蛍光蛋白質 (CFP) 記者を利用しています。

文化: トランスジェニック Tph1 CFP モデルから作られた一次マウス上皮細胞は、4 時間後料理に接続し、24 に 72 h 間生理学実験の準備が整いました。培養条件が最適化されていない、大きな塊、浮遊細胞の残骸、破損した膜および EC 細胞 (図 1A) で CFP 微弱の上皮細胞培養が成っていた。電気生理学のために最適化されている文化は単一細胞の小さな塊から成っていた。健康な EC 細胞は明るい CFP の蛍光によって容易に識別され、積極的な洗浄 (図 1B) 後皿にまだ付いていた。
電気生理学: ROCK 阻害剤 (50 の文化からの 102 の試みのうち 27 全体細胞) とコ...

(EC) 腸クロム親和性細胞は、消化管上皮細胞の小さなサブセットを構成します。EC 細胞は電気的興奮性、まだ養殖と EC 細胞を識別する難しさは、生理学的研究を限られているセロトニンを解放します。ここで紹介した方法は、電気生理学によって初代培養モデル単一の EC 細胞の検査を受けやすいを確立します。

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

この方法は、腸内神経科学や消化管生理学の主要な質問に答える助けになります, 例えば, 腸内のロマフィン細胞の興奮性のメカニズムと発光刺激に応答, そして、消化管ホルモン放出のメカニズムは何ですか?この技術の主な利点は、電気生理学のような単細胞技術を用いて、腸内ロマンフィン細胞を詳細に研究できることです。この手順を実証することは、これらの技術を開発した優れた技術者であるケイトリン・ナットソンとピーター・ストレージの共同執筆者です。この手順を開始するには、抽出された腸管セグメントの内腔に氷冷PBSで満たされた6ミリリットルの注射針を入れる。マイクロディセクション鉗子を使用し、注射針の周りの腸をクランプして密封し、管腔を通してPBSの6ミリリットルを静かに洗い流して、便体を洗い流します。次に、管腔を通して微小解剖鉗子をそっと織り、腸壁をつまみ、組織を鉗子の先端に近い後退させることによって腸組織を反転させる。この手順を繰り返して、セグメントが外側を向いている状態でセグメントが裏返しにします。マイクロディセクションはさみを使用して、組織セグメントを1センチメートルに切断します。その後、組織セグメントを5ミリリットルのビーカーに移し、5ミリリットルの無菌PBSを充填した。続いて、組織片を液化した一貫性にミンチする。みじん切り組織と15ミリリットルの氷冷PBSを清潔な50ミリリットルのチューブに移します。移管ピペットで2回トリチュレートします。組織が落ち着くのを待ちます。その後、PBS上清を15ミリリットル除去し、新鮮なPBSに交換します。PBSがクリアになるまで、このプロセスを3回繰り返します。最初の消化のために、水浴から、10ミリリットルの予熱消化培地を含む50ミリリットルのチューブの1つを取り出す。次に、250マイクロリットルのPBSコラゲターゼ溶液を細かく入れた腸片をチューブに加える。最後に、消化培地およびPBSコラゲターゼ溶液にひき肉組織片を添加した。その後、サンプルを水浴に37°Cで5分間入れます。10ミリリットルの血清ピペットで組織をゆっくりと一度に拍動し、組織片を短時間落ち着かせる。上清の10ミリリットルを除去するために移管ピペットを使用してください。2回目の消化のために、PBSコラゲレーターーゼ溶液250マイクロリットルを組織に加え、摂氏37度の水浴に入れます。その後、10ミリリットルの血清ピペットで溶液をゆっくりと一度に飽和させる。その後、上清の10ミリリットルを除去します。3回目の消化のために、チューブにPBSコラゲザーゼ溶液の250マイクロリットルを加えます。37°Cの水浴に10分間入れます。その後、消化器1と2よりも高い強度で毎分2〜3回チューブを振ります。その後、10ミリリットルの血清ピペットで組織を上下にゆっくりとピペットし、組織片を短時間落

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JoVE Journal

Biology

生物学

KVチャネル機能不全は、心臓不整脈に関連付けられています。我々はKvをチャネルの補助サブユニットのノックアウトマウスからの心房と心室の心筋細胞を単離するための体系的なプロトコルを利用するような不整脈を引き起こす分子メカニズムを研究するために。隔離された心筋細胞は、その後すぐに携帯電気生理学的研究、生化学的または免疫蛍光法（IF）のアッセイのために使用することができます。...

マウス心房と心室の心筋細胞における分離とKvチャンネル録音

アルギニン·バソプレシン（AVP）は腎校長細胞による水の再吸収を促進を通じて体内の水分の恒常性の微調整を制御します。ここでは、AVP-媒介水再吸収の根底にある分子機構の解明に適した管細胞を集め初代ラット内側の延髄の栽培のためのプロトコルを提示します。...

管細胞の収集培養初代ラットインナー髄

腸神経系のニューロンおよびグリア成分を直接研究するための細胞培養プロトコルを実演します。成体マウスの筋神経叢から、電気生理学、免疫組織化学などにより個々のニューロンとグリアの機能を調べる能力を提供する、カバースリップ上のニューロン/グリア混合培養物。...

不定冠詞<em&gt;インビトロ</em成体マウスの筋層間神経叢から分離腸ニューロンとグリアの&gt;準備

このビデオは、in vitroマウスの結腸直腸神経製剤で単繊維電気生理学的記録を行うためのプロトコルを示しています。...

マウス大腸求心性終末の体外機能解析では、

8時間 - 身体から取り出されると、神経組織を大幅に6後の組織の最終的な劣化につながる、環境条件によって影響されます。密接に監視し、組織の細胞外の環境を調節する独特の培養方法を用いて、組織生存率を有意に&gt; 24時間延長することができます。...

電気生理学およびカルシウムイメージングのための急性神経組織の長期のインキュベーション

このプロトコルは、混合、マウス小腸の細胞の単離および培養を記載しています。これらの一次腸の培養物は、多くの技術を使用して、腸ペプチド分泌の根底にあるシグナル伝達経路の研究を可能にします。...

腸ホルモン分泌の研究と腸内分泌細胞の生細胞イメージングを対象ネズミ小腸の混合初代培養

本発明者らは、ラット尾部精巣上体からの一次解離上皮細胞の電気的特性を測定するために、細胞分離および全細胞パッチクランプ記録を組み合わせたプロトコルを提示する。このプロトコルは、副睾丸の生理的役割をさらに解明するために、初代副睾丸上皮細胞の機能的特性の調査を可能にする。...

精巣上体から分離した一次上皮細胞の全細胞パッチクランプ記録

2段階の酵素手順を用いたヒト尿膀胱標本からの単一の単一の単離されたデトルザス平滑筋細胞の調製方法を記載する。得られた生存可能なDSM細胞は、生理学的および薬理学的特性を明らかにするために記載されたアンホテリシン-Bパッチクランプ電気生理学を含む様々な単一細胞技術によって研究することができる。...

9-フェナントロル感受性カチオン電流の特性評価のための新たに分離されたヒトデトルサトール平滑筋細胞の調製と利用

マウス筋細胞の単離の方法論と、同時デジタル細胞幾何学的測定と蛍光光光測定を用いたサルコメア短縮トレースと同時に電圧またはカルシウムの痕跡を得る方法を提示する。...

単離マウス心室筋細胞の光学イメージング

このプロトコルは、ウシ副腎クロマフィン細胞における3つの融合モードを検出するための共焦点イメージング技術を記述する。これらの融合モードには、1)融合孔の開閉を伴う近接融着(キスアンドランとも呼ばれる)、2)融合孔の開口および開放された細孔の維持を伴うステイ融合、および3)融合小胞収縮を伴う収縮融合が含まれる。...

副腎クロマフィン細胞における融合細孔ダイナミクスの3つのモードを測定するための共焦点顕微鏡

この研究では、小腸と大腸に由来するブタオルガノイドの2D単層を生成するためのプロトコルを概説しています。これらの単層の成長は、TEER値の増加によって特徴付けられ、堅牢な上皮の完全性を示します。さらに、これらの単分子膜は、フォルスコリンの適用後のUssingチャンバー実験で生理学的分泌応答を示します。...

天然腸の生理学的特性を反映した二次元ブタ腸管オルガノイド

学ぶマウス腸クロム親和性細胞の一次培養と細胞全体電気生理学的手法。単一細胞レベルでEC細胞の興奮性と管腔刺激応答を詳細に解析し、消化管生理とホルモン放出メカニズムの理解を深める革新的技術です。

一次培養マウス腸クロム親和性細胞のセル全体を電気生理学

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