Name: 線虫の大規模栽培のプレート ・ ベース: 糖尿病の代謝変化に関する研究のための試料作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: 学ぼう、Caenorhabditis elegansの大規模プレート培養法を。同期化した線虫集団をM nineバッファーで処理し、密度調整後に凍結保存する。糖尿病研究やタンパク質定量解析に応用可能な再現性の高いサンプル作製プロトコルです。

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本研究は、ドイツ研究振興協会 (DFG) IRTG 1874「糖尿病性血管合併症」と CRC 1118「糖尿病合併症の原因として反応性代謝物」によって支持されました。線虫株 N2 と CL2166 は、CGC、研究インフラ プログラム (P40 OD010440) の NIH のオフィスによって資金が供給されるによって提供されました。

注: このプロトコルは、5 つのセクションに分かれています。セクション 1-3 大規模な線虫を培養する主なプロトコルが表示されます。セクション 4 と 5 は、糖尿病代謝で発生する例示代謝物の評価の追加のプロトコルを提供します。詳しくは、セクション 1 は板の一般的な大規模な文化について説明します。セクション 2 はc. の elegansの大量の転送に焦点を当てて説明 3 は、大規模なサンプルの収穫に対し。セクション 4 のサンプルの蛋白質の隔離およびセクション 5 以降の液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析 (MS/LCMS) 分析のための試料の前処理をについて説明します。
1. 大量培養プレート上
<ol><li>一般に、機能無菌フードの下にまたは汚染を避けるために開いた炎の横にあります。</li>
	<li>
文化にワーム若い大人の段階に達するまで次の適応を持つこの以前に発行された議定書7に従ってください。
	<ol>
<li>生菌大腸菌OP50 を使用して線虫をフィードし、実験のため 400 μ M フルオロデオキシウリジン寒天 (アンピシリン/FUdR ではない) を準備します。</li>
		<li>同期の人口の準備、未濃縮 OP50 を使用し、大人の実験が成功、上澄みの 70% を除去することによって集中 OP50 x 3.3 を使用します。</li>
		<li>毎日の給餌間隔をお勧めします。酸化ストレスの評価、さまざまな間隔と授乳のためボリュームが結果と競合します。</li>
		<li>接種、いくつか線虫とプレートを取り、メスで約 0.5 x 1 cm2の断片に切断します。未濃縮 OP50 を含む、直径 60 mm の線虫成長メディア (NGM) プレートの上に 2、3 個セットを転送します。</li>
		<li>ひずみ (野生型 N2 は 20 ° C で培養する必要があります) に適した温度で版を孵化させなさい卵が皿の上に表示されるまで。</li>
		<li>M9 バッファーの 2 mL で卵と大人の動物のほとんどを洗って 15 mL チューブでそれらを収集します。2 分間 800 x gの懸濁液を遠心します。一方、漂白液の準備を開始します。</li>
		<li>遠心管を取り出すし、10 mL のピペットを使い、M9 バッファーを削除します。大人の線虫を分離まで渦の漂白のソリューションとミックスの 10 mL を追加します。これは通常約 5-7 分がかかりますが、15 分よりも長くしてはならない、または卵は実験後に完全に開発することはしません。</li>
		<li>800 x gで 2 分間洗浄ソリューションを漂白から卵をクリアする 10 mL M9 バッファーで 3 回の懸濁液を遠心します。</li>
		<li>今 OP50 プレートに卵の懸濁液の 150 μ L を追加します。200-300 卵の密度は各プレート上に達します。線虫大人の段階に達するまで待機します。 注: 描かれた実験用 M9 バッファー (pH 7.0) 以下の物質で構成されています: 22 ミリメートル KH2PO4、42 mM ナ2HPO4、および 86 mM の NaCl。オートクレーブ混合物後、1 mM MgSO4 を追加します。漂白液には 0.5 M NaOH、2.3 mM NaOCl を蒸留水で解決が含まれます。</li>
		<li>ワーム、およびそれらを収集するために 15 mL チューブを洗浄するカットと滅菌ピペット チップ先端不稔の M9 バッファーを準備します。</li>
		<li>プレートに約 1 mL の M9 バッファーを適用、プレートから線虫を振るとゆっくりピペットでバッファーを優しく配布。</li>
		<li>今、管内線虫を収集します。カット ピペット チップで (OP50 でシード) プレートに直接サスペンションの 150 μ L を適用し、線虫の密度を病理組織学的評価 (推奨: 60 mm プレートごとの 50-100 線虫)。</li>
		<li>密度が高すぎる場合は、目的の密度に達するまで顕微鏡で評価して M9 バッファーと懸濁液を希釈します。収量が少なすぎる場合、落ち着くか、遠心分離機の流体を削除する 800 x gで懸濁液 10 のワームをしましょう。 注: 十分な密度の例は、図 1 a (マクロスコ ピック) と 20 X 増強で (微視的) 1 bで与えられます。実証的に従って進んでください。</li>
		<li>ワームがすぐに落ち着くことを覚えてをおいてください。プレート間の等しい配分を確保するため、すべてのスタック プレート (4-5 版) の後チューブを反転します。 注: カット ピペットのチップとして穏やかな揺れと剪断応力を低減プレートの洗浄します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2。転送の大量の線虫
<ol><li>年齢や板の乾燥によって、M9 はバッファーの約 500 μ L で線虫を洗浄します。同じバッファーを使用して、動物のほとんどが懸濁液で収集されるまで、線虫をデタッチを繰り返します。</li>
	<li>ゆっくりカット ピペット チップで線虫を取るし、OP50 でプレートに転送します。ドライ プレートができます。 注: 推奨される量よりはるかに多くを適用するないように気をつけてください。特に長期的な実験は、プレートがそれを許さない、亀裂にクロールする線虫をできるように、寒天が破ることができます。</li>
</ol>3. 収穫大の線虫サンプル
<ol><li>選択した方法によってはc. の elegansの十分な量の実験を始めます。クロマトグラフィー-タンデム質量分析のサンプルあたり蛋白質の少なくとも 200 μ g の収量を確保するためプレートごと約 100 線虫を持つグループあたり 20 プレート (60 mm × 15 mm) を準備します。 注: プロトコルのこの部分は、線虫が収集され凍結としてはもう、無菌条件下で動作を必要ありません。</li>
	<li>サンプル コレクションの日に収集されたサンプルのスナップ-凍結液体窒素を準備します。マツ材線虫病の代謝を遅く氷の上の非滅菌の M9 バッファーを保持します。</li>
	<li>1 mL の M9 バッファーを適用しプレートを軽く旋回プレートから線虫を洗浄します。ある場合、現在細菌や寒天を守るため故人線虫とほとんどの卵の収集を回避できます。</li>
	<li>ボリュームを取るし、15 の mL の管にそれを転送します。</li>
	<li>完全なサンプルのコレクションの後、解決または 800 x gで簡単にチューブを遠心し、M9 バッファーの大部分を除去する線虫を待ちます。サンプル 3 を洗って約 10 ml の M9 の x (サンプル ボリューム x 10) 細菌を除去します。 注: すべての故人線虫が削除されていることを確認するには、ショ糖浮遊は別オプションです。ただし、これは表示されている実験15不向きでした。ショ糖はブドウ糖と果糖に加水分解します。描かれた実験でグルコースの役割は、持病の糖尿病の生化学的変化を促進するために評価されました。したがって、ショ糖浮遊可能性のある結果を混同できます。</li>
	<li>すべてのサンプルの 1 mL の M9 バッファーと 1 つの 1.5 mL チューブと 1 つの空の 1.5 mL チューブを準備します。空の 1.5 mL のチューブに 15 mL チューブからガラス ピペットを使い、ペレットを転送します。この手順は、定量的な伝達を確保することが重要です。 注: とは異なり、以前のステップの間にここで線虫より集中しています。プラスチック ピペット先端への可能な付着、によりサンプルの大きい部分の損失が予想されます。したがって、ガラス ピペットを代わりに使用します。</li>
	<li>転送後、ピペットの壁から線虫をリンスに 1 mL の 2 番目の 1.5 mL のチューブから M9 バッファーを取るガラス ピペットを使用します。また、15 mL チューブから残りの線虫を洗って、サンプル チューブに転送します。</li>
	<li>19,000 × gで 1 分でサンプル チューブを遠心分離機、可能な限りの上澄みを取り外します。</li>
	<li>パラフィルムでチューブをシールとすぐに液体窒素でスナップ-凍結するそれ。ライセート作製まで-80 ° c チューブを格納します。</li>
</ol>4. 質量分析のため蛋白質の隔離
注: ここで説明した蛋白質の隔離を (例えば、西部のしみ) 他のアッセイに使用もできます。
<ol><li>凍結サンプル 0.5 mm ジルコニア ビーズ、少なくとも 2 倍のプロテアーゼ阻害剤のカクテルを含む溶解バッファーのボリュームの同じボリュームを追加します。 注: 描かれている線虫蛋白質に相関分析を行ったバッファーの 100 μ L を使用します。LC ・ MS/MS サンプル バッファーの 200 μ L に溶解し。</li>
	<li>9 の速度で 1 分間ホモジナイザーを開始します。サンプルが完全に分離することを確認します。彼らは完全に分離していない場合は、この手順を繰り返します。</li>
	<li>19,000 x gで 4 ° C で 30 分間試料を遠心します。氷の上清を新しいチューブに転送、測定をとるつもりがさらにまで-80 ° C で保存できます。 注: 描かれた実験用非変性バッファーは以下の物質で構成されています: 20 mM トリス塩酸 (pH 8)、137 mM NaCl、1% トリトン X、2 ミリメートルの EDTA。 注: は、このプロトコルの推奨スケールを適用した手順に従ったこと、約 1,000 の線虫から蛋白ペレットの収量は約 500 μ g をする必要があります。多くの比較図 2および代表の結果を参照してください。</li>
</ol>5. 液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法による測定の前処理
注: 興味のパラメーターに応じて、サンプル準備が異なります。このプロトコルは、メチルグリオキサールや年齢の決定に焦点を当てください。
<ol><li>
上記9として 1, 2-diaminobenzene (DB) 誘導体化による細胞内メチルグリオキサールを測定します。
	<ol>
<li>冷たい 20% (重量/巻) トリクロロ酸塩化ナトリウム 0.9% (重量/巻) の 20 μ L と 1.5 mL チューブの水の 80 μ L 試料をホモジナイズしてください。</li>
		<li>スパイク内部標準の 5 μ L のサンプル (13C3MG; 400 nM)、ボルテックス、それらをミックスし、4 ° C で 5 分間 21,000 × gで遠心分離</li>
		<li>上澄みの 35 μ L を高速液体クロマトグラフィーのサンプルのバイアル 200 μ L ガラス挿入に転送します。</li>
		<li>0.5 mM DB 200 mM HCl 含む 0.5 mM ジエチレントリアミン酸 (DETAPAC) の水の 10 μ L の順に各サンプルに 3% アジ化ナトリウム (wt/巻) の 5 μ L を追加します。</li>
		<li>光から保護部屋の温度で 4 時間サンプルをインキュベートします。</li>
		<li>上記9LC-MS/MS による試料を分析します。 注: 年齢の測定プロトコルのセクション 4 で説明したよう、蛋白質を分離します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ブラッドフォードの試金10を使用して (解凍) 溶解液のタンパク質濃度を測定します。
	<ol>
<li>ウシ血清アルブミン (BSA) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 以下の濃度の解決とスパイク標準曲線の 30 μ L の因数を準備: 0;0.1 となります。0.2;0.3;0.4;0.6;0.8;1.0 Mg/dl。 注: 推奨されるサイズ サンプル調製した場合 (バッファーの 200 μ L でライセートの調製手順 4.1 を参照)、推定濃度は、およそ 2 – 7 mg/mL の範囲でする必要があります。この場合、希釈、サンプル 1:10 PBS で、測定前にします。 注: このメソッドを使用して最初の実験は勧め異なる希釈率のサンプルを測定する (1、1:10 と 1: 100)。線虫の数の厳密な決定は、個々 の研究者間収量できます異なります。</li>
		<li>透明の 96 ウェル プレート (ポリスチレン) を使用して、各標準濃度と井戸に重複で選ばれた希釈サンプルの 10 μ L をピペットします。</li>
		<li>希釈、タンパク質アッセイ色素試薬の集中 1:5 蒸留水 (aq。dest)希釈の 200 μ L をプレート上のすべてのサンプルに追加します。板室温で 10 分間、インキュベートします。</li>
		<li>595 で 30 分以内で吸光度を測定プレート リーダーの nm。サンプルは、計算された標準曲線から補間することができます。メソッドの詳細については、文献10に広く記載されています。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
前述11,12として細胞年齢を測定します。
	<ol>
<li>総蛋白抽出物 (約 200 μ g) を洗う遠心遠心ろ過単位 10 kDa によって水で 3 倍。</li>
		<li>回復されたタンパク質 (約 100 μ L) を 10 μ L の 100 mM 塩酸、ペプシン (20 mM 塩酸で 2 mg/mL) の 10 μ L、チモール (2 mg/mL で 20 mM HCl) の 10 μ L を追加し、37 ° C 24 時間でサンプルをインキュベートします。</li>
		<li>中和し、ph 7.4 0.5 M カリウム リン酸バッファー (pH 7.4) の 12.5 μ L を追加することによって、サンプルをバッファーと 260 mM コの 5 μ L。</li>
		<li>プロナーゼ E [10 mM カリウム リン酸バッファー (pH 7.4) に 2 mg/mL] の 10 μ L を追加し、ペニシリン ・ ストレプトマイシン液の 10 μ L 24 h 37 ° C でサンプルをインキュベートし、。</li>
		<li>アミノペプチダーゼ [10 mM カリウム リン酸バッファー (pH 7.4) に 2 mg/mL] の 10 μ L を追加し、プロリダーゼ [10 mM カリウム リン酸バッファー (pH 7.4) に 2 mg/mL] の 10 μ L 48 h の 37 ° C でサンプルをインキュベートし、。</li>
		<li>上記12- MS LC/MS による、結果として得られる加水分解物を分析します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

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このプロトコルは、定量的な結果を得るためのc. の elegansの大規模養殖のための信頼性の高い方法を示します。文献からの知見は、代表の結果に示すように、レプリケート可能性があります。にもかかわらず、 c. の elegansの大規模なサンプルのコレクションのこのプロトコルはストレート フォワード法のように思える、考慮する点があります。線虫密度の同期に関するこのプロトコルは、線虫を破壊し、もっぱら卵を収穫する亜塩素酸ナトリウムと水酸化ナトリウムと人口を漂白によるアプローチについて説明します。このアプローチはすべての実験に適したかもしれない考慮に入れなければなりません。人口規模漂白液の量との比によって漂白液の害を与える効果胚15の開発に影響します。発達過程を勉強して場合は特にこれは重要なステップ可能性があります。、線虫の取扱いに関するプロトコルを通してできるだけ小さなせん断力として適用することが重要です。注意して処理されない、線虫の数が多いが滅びる。さらに言えば、回転時間と速度を超えないように重要です。線虫を転送する際は...

西部のしみや質量分析法などのタンパク質解析タンパク質のミリグラムが必要です。この収量の線虫、洗濯によって液体培養または線虫を転送する固体メディア上を達成することができます何百もの大規模な養殖が必要です。流体とせん断応力は、ナトリウム、線虫の寿命を変えることと代謝解析1 に影響を与える可能性があるの増加の取り込みによる浸透圧ストレスを高めることができる上皮性ナトリウム チャネル (ENaC) の発現を誘導します。.したがって、プレート ベースのアプローチのこのプロトコルのいくつかの重要なステップは、アカウントに実験的変動に影響を与えるストレスの軽減を取る。液体培養は、他の一方で、線虫の表現型に影響を与えるし、文化と線虫2の正確な数のコレクションが複雑になります。さらに、反応生成物は、メディア コンポーネントによって変更することができ、線虫に達する前に均等に分散可能性があります。液体文化の制限については、このプロトコルはc. の elegansの大規模なサンプルを培養する方法を提供します。
線虫は 302 の神経細胞の異なるネットワークのモデル生物すべてのセル3の 3 分の 1 を構成します。多くの相同科学への導入以来オーソログ遺伝子の説明、医学研究のためのモデルとしてその値を増幅されています。最近では、糖尿病性網膜症、血管の損傷の前の神経学的な減損の証拠は4を提示されています。線虫は血管が欠けているが、血管のものから離れて神経の変化を調査するための適切なモデルを作るそれ異なる神経ネットワークが含まれています。したがって、 c. の elegansは糖尿病合併症の一般的なメカニズムを研究するための特別な関心です。糖尿病合併症の生化学的変化は、さらに高血糖5に応えて ROS の生成に及ぼす年齢の形成を含みます。年齢は線虫で発見され、神経損傷6に貢献。慢性疾患は、糖尿病合併症の評価をここで例示としてしばしば、メカニズムの評価のための多重アプローチを必要とする複雑なポリジーンのプロセスによって引き起こされます。このプロトコルは、だけでなく、その後複数のパラメーターを同時に、取得のための使用することができます。増加の比較と多重手法の再現性は、液体と固体のメディア文化の形態と代謝の違いを省略することで実現できます。

<table><tbody><tr><td>大腸菌 OP50</td><td>CGC</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans N2</td><td>CGC</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans CL2166</td><td>CGC</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿、60 mm x 15 mm</td><td>Greiner One</td><td>628161</td><td></td></tr><tr><td>Pot.pracet、ガラス、10 mL</td><td>Neolab</td><td>E-0413</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ阻害剤カクテル錠</td><td>ロシュ</td><td>04693124001</td><td></td></tr><tr><td>非変性溶解液 緩衝液:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH 8</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>NaClΣ</td><td></td> <td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td>ΣX-100</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td><td>Σ</td><td>E5391</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート、透明底部</td><td>ブランド</td><td>781611</td><td></td></tr><tr><td>Infinite M200、プレートリーダー</td><td>Tecan</td><td>30017581</td><td></td></tr><tr><td>酸化ジルコニウムビーズ、0.5 mm</td><td>ネクストアドバンス</td><td>ZROB05-RNA</td><td></td></tr><tr><td>ブレットブレンダー、ホモジナイザー</td> ネク<td>ストアドバンス</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>ブタの胃粘膜からのペプシン</td><td>Sigma</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>チモール</td><td>Σ</td><td>T0501</td><td></td></tr><tr><td>プロナーゼ E/プロテアーゼ Streptomyces griseus </td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液</td><td>Σ</td><td>P43339</td><td></td></tr><tr><td>豚の腎臓からのプロリダーゼ</td><td>Σ</td><td>P6675</td><td></td></tr><tr><td>アミノペプチダーゼ Aeromonas proteolytica</td><td>Sigma</td><td>A8200</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td><td>Merckmillipore</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>プレート培養の基本材料は、参考文献 6に記載されています。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

線虫の大規模栽培のプレート ・ ベース: 糖尿病の代謝変化に関する研究のための試料作製

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

線虫(C. elegans) を寒天に大規模な方法で養殖は時間がかかり、困難にすることができます。このプロトコルでは、西部のしみ、質量分析法、またはさらにプロテオミクス解析を続行する蛋白質の分離のための動物の大規模な番号を取得する簡単で安価な方法について説明します。さらに、immunostainings の線虫の数の増加と同じ培養条件下で複数の解析の統合容易に達成します。さらに、異なる実験条件とプレート間の移動が促進されます。平板培養における一般的な技法白金線を使用して 1 つのc. の elegansの転送と住まれた寒天の転送チャンク メスします。ただし、線虫数増加に伴い、これらの技術に過度に時間がかかる。このプロトコルはc. の elegans多数の手順を含むワームの生理学的試料の影響を最小限に抑えるための大規模な文化をについて説明します。流体および剪断応力の寿命や線虫、こうして信頼性と再現性のある結果を取得するために重要な手順の詳細な説明を必要とする代謝過程を変更できます。線虫は最大 1/3 の神経細胞から成るが血管に欠けている、従って神経変化のみ血管制御の独立を検討する可能性を提供するモデル生物であります。最近では、早期の神経変性糖尿病網膜症は血管病変の前に発見されました。したがって、 c. の elegansは糖尿病合併症の一般的なメカニズムを研究するための特別な関心です。たとえばの高められた形成高度糖化最終製品 (年齢)、線虫に見られる再現性をもって、活性酸素種 (ROS) を観察しました。調査のより広いスペクトルのための適切なサイズのサンプルを処理するプロトコルは、糖尿病による生化学的変化の研究に代表されるここで、掲載されています。一般に、このプロトコルは大規模な線虫を必要とする研究に有用することができます番号とどの液体培養は適していません。

ここで大規模な線虫の作成例文化の糖尿病研究のアプリケーションに渡されます。総蛋白濃度を正常化するのではなく、パラメーターを 1 つの動物に関連する関心のことです。線虫の数が少ないを必要とする試金、これ簡単に達成できます、線虫をカウントすることによって。大規模な線虫の実験グループごと線虫の数百人を文化、この方法は便利です。図 2線虫 c. エレガンスの量とタンパク質含量との相関を示しています。ここに示されているように、このプロトコルを使用して再現性のある量的蛋白質分離を実現できます。
アマドリ フルクトシルアミノ リジンを付加体中に形成されたいくつかの年齢の前駆体である実験動物の糖尿病モデル13。図 3では、12 日古い線虫と 3 つの...

このプロトコルは固体媒体で線虫の大規模栽培の方法をについて説明します。液体培養する代わりに、このプロトコルは、栽培プレート ベースの異なるスケールのパラメーターを取得できます。これは、液体と固体のメディア文化の形態と代謝の違いを省略することで結果の比較可能性を向上します。

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

C.elegansの分野では、この方法は、プレート培養を使用して大規模な線虫の集団とサンプルを作製する必要がある主要な質問に答えるのに役立ちます。このプロトコルの主な利点は、確立が容易であることと、落とし穴やアプリケーションを含む説明のしやすさです。線虫の同期集団を得た後、約1ミリリットルのM nine緩衝液をプレートに加え、プレートを振ることにより緩衝液を慎重に分配する。この後、線虫を15ミリリットルのチューブに集めます。次に、チューブを反転させ、顕微鏡を使用して線虫の密度を評価します。必要に応じて懸濁液の密度を調整し、顕微鏡下で評価を続けます。150マイクロリットルの懸濁液を、ピペットチップを変更したプレートに直接塗布します。プレート間で線虫が均等に分布するように、懸濁液のチューブを一定の間隔で反転させます。まず、改良したピペットチップを使用して、約500マイクロリットルのM nineバッファーで線虫を洗浄します。同じ緩衝液を使用して、ほとんどの動物が懸濁液で収集されるまで線虫の剥離を続けます。次に、ピペットチップを修正した線虫を取り込み、OP50でプレートに移します。改良されたピペットチップは、直径が大きいため、せん断応力と線虫への損傷を軽減します。次に、プレートを乾かします。サンプルを収集する前に、収集した線虫をスナップフリーズするための液体窒素を準備します。次に、M nine buffer を氷の上に置きます。各プレートに1ミリリットルのMナインバッファーを塗布し、各プレートを静かに渦巻いて洗浄します。次に、M nineバッファーの容量を取り、新しい15ミリリットルチューブに移します。チューブを800 gで短時間遠心分離してから、M nineバッファーの大部分を取り出します。次に、サンプルを10ミリリットルのMナインバッファーで3回洗浄して、細菌を取り除きます。ガラスピペットを使用して、各ペレットを空の1.5ミリリットルチューブに移します。ガラスピペットを使用して、ピペットの壁から線虫をすすぐために、2番目の1.5ミリリットルチューブから1ミリリットルのMナインバッファーを取り出します。次に、15ミリリットルのチューブから残りの線虫を洗い流し、サンプルチューブに移します。次に、サンプルチューブを19, 000倍gで1分間遠心分離し、できるだけ多くの上清を除去します。次に、各チューブをパラフィンフィルムで密封し、すぐに液体窒素でスナップフリーズします。ライセートが調製されるまで、チューブをマイナス80°Cで保管します。各凍結サンプルに、同量の0.5 mm酸化ジルコニウムビーズと、2 倍の容量のライセートバッファーとプロテイナーゼ阻害剤カクテルを添加します。次に、チューブを速度9で1分間ホモジナイザーに入れます。サンプルを摂氏4度で30分間、19, 000倍g遠心分離します。最後に、上清を氷上の新しいチューブに移し、将来の実験のために摂氏マイナス80度で保存します。このプロトコールでは、糖尿病研究への応用のために大量のC.elegansを培養しました。収集された線虫の数は、ライセートのタンパク質収量と相関しており、このプロトコルを使用して再現性のある定量的タンパク質単離を達成できることを実証しています。ここでは、反応性代謝物であるメチルグリオキサールと、メチルグリオキサール曝露によって形成される終末糖化産物の質量分析を示します。グルコース処理された線虫と対照を比較しました。ピペットを介して線虫を移すと、せん断応力が発生し、線虫に害を及ぼす可能性があります。ピペットで移動させた線虫および金属線で転写した線虫の酸化ストレスレベルは、このプロトコルを使用しても差がなかった。この手順に続いて、プロテオミクスにおける追加の質問に答えるために、ウェスタンブロットなどの他の方法を実行することができます。また、このプロトコルは、複数のパラメータを同じ母集団に関連付ける実験を容易にします。

plate-based-large-scale-cultivation-caenorhabditis-elegans-sample

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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線虫の大規模栽培のプレート・ベース: 糖尿病の代謝変化に関する研究のための試料作製

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線虫の大規模栽培のプレート ・ ベース: 糖尿病の代謝変化に関する研究のための試料作製

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