末梢血およびリンパ組織から主な人間の T 細胞のシナプスのインタ フェースの評価

今日お話しするアプローチは、組織由来T細胞と末梢血T細胞の特性と機能活性を比較するために導き出されたものです。このトピックの重要性は、末梢血T細胞が体内の全T細胞のわずか20%しか占めていないという事実によって例証されています。少数の組織由来T細胞を研究できることは非常に重要であり、私たちはまさにそれを達成しました。

この技術の主な利点は、従来の技術よりも必要な細胞数と試薬の量が少ないことです。まず、ポリプロピレン製のハサミ型鉗子を使用して、ガラスカバースリップを新たに調製した酸性ピラニア溶液に25〜30分間浸します。洗濯が終わったら、洗濯のたびにカバーガラスを新鮮な量の超純水で7回すすいでください。

次に、濡れたカバースリップを脇に置いて、残りの水がきれいなガラスから転がり落ちるのを待ちます。カバースリップが乾いたら、最終的なリポソーム混合物の2マイクロリットルを、滅菌フローフード内の自己接着性スライドチャネルの中央に正確に分注します。そして、すぐに、しかし慎重に、1つの清潔で乾燥したカバースリップをスライドに位置合わせして、カバースリップがスライドの粘着性のある面に優しく下ろされるようにします。

また、ポリプロピレン製のハサミ型鉗子の外輪を使用して、カバースリップとスライドの周辺接触部に穏やかな圧力をかけ、スリップがスライドにしっかりと取り付けられていることを確認して漏れを防ぎます。次に、スライドを裏返し、油性マーカーを使用して、スライドアセンブリの外側の二重層の周りに4つのドットを描きます。最初の注入の前に、チャネルの一方のポートを入口ポートとして指定し、もう一方のポートを出口ポートとして指定し、実験全体でこの指定を維持します。

気泡の形成を防ぐため、スライドチャネルのゴムシールがチップに浸透しているのを感じるまで、ピペットチップの端をエントリーポートに直接挿入します。チャネルに50マイクロリットルの温かいアッセイバッファーをゆっくりと充填します。カゼインブロッキング溶液中の200マイクロリットルの塩化ニッケル(II)をエントリーポートに注入します。

そして、出口ポートから50マイクロリットルのバッファーを取り出します。45分間のインキュベーション後、出口ポートから余分なカゼイン溶液を取り出します。ストレプトアビジン溶液中のICAM-1 100マイクロリットルをエントリーポートに注入し、室温で45分間インキュベーションします。

インキュベーションの最後に、出口ポートから余分なタンパク質溶液を取り出します。そして、洗浄ごとに100マイクロリットルのアッセイバッファーで二重層を2回洗浄します。次に、100 μLのフルオロ-4標識抗CD3抗体で二重層を標識し、室温で45分間待ちます。

続いて、示されているように、洗浄ごとに100マイクロリットルのアッセイバッファーで2回洗浄します。T細胞二重膜相互作用をイメージングするには、全反射蛍光またはTIRF顕微鏡の摂氏37度の加熱ステージにスライドを置きます。また、インクマークを使用してステージを調整し、バイレイヤーを100パワーの対物レンズの中央に配置します。

顆粒放出イメージングでは、蛍光標識抗CD107A抗体FABフラグメントをCD4 T細胞懸濁液に添加します。そして、標識した細胞を50マイクロリットルのアッセイバッファーに再懸濁して、スライドチャネルのエントリーポートに注入します。次に、適切な数の実験フィールドを選択し、注入後30分間、1分に1回、各フィールドの画像を記録します。

この代表的な実験では、フローセルまたはマルチチャネルフロースライドのいずれかに構築された脂質二重層上に古典的な免疫学的シナプスを形成したCD8 T細胞間に違いは観察されませんでした。脂質二重層相互作用により、CD4 T細胞は成熟免疫シナプスを確立するが、顆粒を放出するか放出しないか、成熟シナプスの形成なしに顆粒を放出するか、またはシナプスを形成しず顆粒を放出しないかのいずれかである。注目すべきは、末梢血単核細胞由来CD4 T細胞は、リンパ節由来CD4細胞の約2倍の速さで顆粒を放出し始めることができることです。

この手順を試みるときは、気泡が形成されないように、一定の温度を維持し、ゆっくりとピペッティングすることが重要です。このアプローチにより、T細胞の二重層界面を調査する能力に加えて、二重層に触れたT細胞の細胞間染色も可能になります。これにより、リンパ組織または他の組織に由来する特定のT細胞を記述するために使用できる情報量が大幅に促進されます。

ピラニア溶液での作業は非常に危険であり、この手順を試みる際には適切なPPEを着用することが重要であることを忘れないでください。