住セルイメージ投射アッセイ研究神経膠腫脳腫瘍幹細胞の遊走と浸潤に
2018年8月29日
ここでは、移行と時間をかけて、複数の治療条件下で神経膠腫脳腫瘍幹細胞の侵入を定量化する生細胞イメージング技術について述べる。
この方法は、移動と浸潤を阻害する新しいアプローチの特定を容易にすることにより、膠芽腫、脳腫瘍幹細胞、またはBTSC生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。これらの手法の主な利点は、複数の条件下でのBTSCの移動と侵入を経時的に定量化できることです。この技術の意味は、がん細胞の正常な脳組織への移動と浸潤が疾患の再発に寄与するため、神経膠芽腫の治療にまで及びます。
この方法は、BTSCがどのように移動し、侵入するかについての洞察を提供しますが、他の種類の腫瘍に由来するがん幹細胞にも適用できます。まず、70%エタノールのビーカーで極低温保存されたBTSCのバイアルを、摂氏37度の水浴の中に置いて、最後の氷が溶けるまで解凍します。解凍した細胞と10ミリリットルの培地を15ミリリットルの円錐管で希釈して遠心分離し、BTSCペレットを8ミリリットルの完全培地に再懸濁します。
細胞をT25培養フラスコに移し、非接着条件下で10〜14日間培養し、フラスコを毎日モニタリングし、必要に応じて1〜2ミリリットルの新鮮な完全培地を細胞に補給します。ニューロスフェアの直径が約250マイクロメートルに達したら、ピペットを使用してフラスコの底に培地を流し、付着細胞を剥離し、上清を15ミリリットルの円錐管に移して遠心分離します。BTSCニューロスフェアを単一細胞に解離するには、ペレットを1ミリリットルの予熱細胞剥離溶液に再懸濁し、摂氏37度で7分間インキュベートした後、800マイクロリットルに設定されたP1000マイクロピペットで40回のトリチュレーションを行います。
細胞が完全に解離したら、抗生物質を添加した5ミリリットルのPBSをチューブに追加して別の遠心分離を行い、ペレットのサイズに応じてペレットを1〜4ミリリットルの完全な培地に再懸濁します。次に、T25フラスコあたり8ミリリットルの完全培地に10〜5番目の細胞に2〜3回播種し、フラスコを細胞培養インキュベーターに移して1〜2週間の培養を行います。目的の薬物治療が遊走に及ぼす影響を評価するには、まず、適切な実験期間、適切な濃度の薬物で細胞を前処理します。
走化性プレートを調製するには、96ウェル走化性プレートの条件ごとに3つのメンブレンインサートウェルと3つのボトムリザーバーウェルを、摂氏37度で1時間、それぞれ0.2ミリグラム/ミリリットルのI型コラーゲンを75マイクロリットルと225マイクロリットルでコーティングします。インキュベーションの終了時に、コラーゲンコーティングを傷つけずに各ウェルからコラーゲン溶液を吸引し、ウェルを滅菌PBSで2回洗浄します。最後の洗浄後、インサートをプレートから取り外し、走化性プレートの各底部リザーバーウェルに10%FBSを添加した225マイクロリットルの成長因子フリー培地を追加します。
次に、気泡が発生しないように上部のインサートを斜めに下部のリザーバーにそっと戻し、50マイクロリットルの成長因子フリー培地中の3番目の解離したBTSCに10の2.5倍を各インサートウェルに加えます。BTSCを単一の細胞に完全に解離し、プレーティングする前に慎重にカウントして、細胞の凝集や上部インサート内の細胞が多すぎるのを防ぐことが重要です。FBSグラジエントに沿ったBTSCの移動を画像化するには、プレートを生細胞イメージングシステムにセットし、自動イメージングソフトウェアを設定して、1〜2時間ごとに最大72時間プレートの顕微鏡画像を取得します。
画像取得が完了したら、メンブレンの底面にある挿入孔からBTSCを区別するための新しい処理定義を選択し、必要に応じて細胞と背景メンブレンを正確に区別できない場合は分析を変更します。細孔を通って移動した細胞を定量するには、条件ごとに 3 つの反復ウェルのそれぞれについて、メンブレンの底面の細胞表面積としてデータを収集し、細胞移動の面積をマイクロメートル単位で経時的にグラフ化します。BTSCニューロスフェアの浸潤を評価するには、まず、ニューロスフィアの浸潤プレーティングの前に、あらかじめ決められた時間経過で目的の濃度で目的の化合物をフラスコに加えます。
平均ニューロスフェアサイズが約150〜200マイクロメートルに達したら、フラスコを傾けてピペットで穏やかに混合し、再懸濁したBTSCニューロスフェアの500マイクロリットルを氷上の実験条件ごとに1.5ミリリットルのチューブ1本に移します。ニューロスフェアペレットを失うことなく、各1.5ミリリットルチューブの底からできるだけ多くの培地を吸引し、新たに調製した0.4ミリグラム/ミリリットルのI型コラーゲン溶液500マイクロリットルにニューロスフェアを穏やかに再懸濁します。コラーゲン懸濁したニューロスフェア100マイクロリットルを条件ごとに3つのウェルに移し、氷上の新しい96ウェルプレートに移し、ニューロスフェアを5分間落ち着かせます。
ニューロスフェアが氷の上で5分間落ち着くのを待つことが重要です。そうしないと、球体はイメージングのために同じ焦点面上にありません。細胞培養インキュベーターでコラーゲンを5分間重合した後、プレートを生細胞イメージングシステムのトレイに移し、浸潤が始まる前のプレーティング時のニューロスフェアサイズの参照画像を取得します。
次に、侵入速度が頭打ちになるまで(通常は24時間)1〜2時間ごとに画像を取得するようにソフトウェアを設定します。BTSCが時間の経過とともにマトリックスに侵入するにつれて増加する表面積を画像化するには、10X対物レンズを使用して、3つの反復ウェルのセットごとにウェルごとに4つの画像を取得します。ウェルの合流パーセントとして表される相対的な細胞表面積を決定するには、ウェルの背景上の細胞を具体的に強調表示する処理定義を設定し、各時点における各ウェルの総細胞表面積としてデータを収集し、3つの反復ウェルの平均を決定し、 そして、時間の経過とともに増加する細胞面積をプロットすることにより、BTSCの侵入をグラフ
化します。単一細胞としてプレーティングされたBTSCは、自由に浮遊するニューロスフェアとして増殖させることができます。その後、ニューロスフェアを目的の薬剤で治療し、治療介入がBTSC遊走に及ぼす影響の走化性分析のためにプレーティングすることができます。BTSCが完全に解離していない場合、細胞は細孔を通って移動せず、小さなニューロスフェアとして残ります。
ウェルあたり10倍から3番目のBTSCの2.5倍以上を播種すると、細胞はメンブレンの底側に移動するのではなく凝集します。さらに、気泡は正確な細胞イメージングと定量を妨げるため、細胞をプレーティングするとき、またはメンブレンインサートをボトムリザーバーに配置するときに、メンブレンインサートウェルに気泡を作らないようにすることが不可欠です。ニューロスフェアから周囲のマトリックスへのBTSC浸潤は、96ウェルプレート形式で経時的に画像化および測定できます。
BTSCの浸潤に対する治療的介入の効果は、細胞がマトリックスに侵入する際の細胞の表面積を経時的に定量化することで評価できます。直径200マイクロメートルを超えるBTSCニューロスフェアを埋め込むと、視野内のすべての球体を正確に定量化するには焦点面が大きすぎます。同様に、インベージョンアッセイのためにニューロスフェアをコラーゲンに埋め込む際にマトリックスを摂氏4度に維持できないと、球体が同じ焦点面にない、細胞外マトリックスが均一に固まらないことにもつながり、正確なデータ取得が妨げられる可能性があります。
この手順を試みる際には、調査する各BTSC培養物の薬物治療条件と画像取得時間を最適化することを忘れないでください。この手順は、他の種類の腫瘍由来のがん幹細胞がどのように移動し、in vitroで浸潤するかについての追加の質問に答えるために変更することもできます。この技術は、がん生物学の分野の研究者が神経膠芽腫BTSCのin vitro移動と浸潤を探求するための道を開くのに役立ちます。
概要
この記事では、グリオブラストーマ脳腫瘍幹細胞（BTSC）の移動と浸潤を時間経過と様々な治療条件下で定量的に測定する生細胞イメージング技術について説明します。これらの方法は、BTSCの生物学と潜在的な治療アプローチへの洞察を提供します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- がん研究
背景
- BTSCは正常な脳組織への移動と浸潤を通じて、グリオブラストーマの再発に寄与します。
- これらのプロセスを理解することは、効果的な治療法を開発する上で重要です。
- 生細胞イメージングにより、細胞の挙動をリアルタイムで観察することができます。
- この技術は他のがん幹細胞にも適用できます。
研究の目的
- BTSCの移動と浸潤を定量的に評価する。
- これらのプロセスを阻害する新たな戦略を特定する。
- グリオブラストーマの生物学の理解を深める。
使用された方法
- 非付着条件下でのBTSCの解凍と培養。
- 薬物処理への反応としての移動を評価するためのケモタキシープレートの使用。
- 細胞の挙動を時間経過でモニターするための生細胞イメージングシステムの使用。
- 画像解析を通じて移動と浸潤を定量化。
主な結果
- 様々な条件下でのBTSCの移動と浸潤の定量化に成功。
- BTSCの挙動に影響を与える要因の特定。
- 他の腫瘍タイプへの方法の適用可能性の実証。
結論
- 生細胞イメージングはBTSCのダイナミクスを研究するための強力なツールです。
- 得られた洞察は、改良されたグリオブラストーマ治療につながる可能性があります。
- 他のがんへの影響を探るためのさらなる研究が必要です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative live-cell imaging of brain tumor stem cell migration and invasion enables mechanistic de-risking in glioblastoma target validation. These assays provide predictive confidence for therapeutic interventions by measuring functional phenotypes under controlled conditions. The approach supports early discovery decisions by linking molecular perturbations to invasive behavior in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses by quantifying BTSC migration and invasion in response to drug treatments.
- Operational Value: Enable biological de-risking through standardized, time-resolved phenotypic readouts.
- Predictive Value: Support portfolio triage by linking target modulation to reduced invasive capacity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepare validated BTSC models for downstream compound screening using chemotaxis and invasion endpoints.
- Operational Value: Establish reproducible, quantitative assays compatible with 96-well formats and live-cell imaging platforms.
- Scalability: Enable platform reuse across tumor types by adapting neurosphere dissociation and matrix embedding protocols.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintain disease relevance by using patient-derived BTSCs that recapitulate stem cell properties and invasive potential.
- Operational Value: Bridge discovery and preclinical work through continuous monitoring of migration and invasion over time.
- Risk Mitigation: Inform advancement decisions by measuring functional outcomes tied to tumor recurrence mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The migration and invasion assays integrate into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing quantitative, time-dependent phenotypic data.
- Discovery Biology: Support hypothesis testing and pathway clarification by measuring BTSC responses to perturbations in a neurosphere-based system.
- Screening: Enable assay readiness through standardized collagen coating, cell seeding, and imaging protocols that yield reproducible migration and invasion metrics.
- Analytics: Generate quantitative readouts such as migrated cell area (µm²) and percent confluence over time, enabling condition comparisons and dose-response modeling.
- Translational Research: Connect to preclinical continuity by using disease-relevant BTSCs that model invasion-driven recurrence.
- Enterprise Reuse: Frame the method as a reusable capability for studying cancer stem cell migration and invasion across multiple tumor types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provide predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in migration and invasion pathways.
- Operational Value: Ensure standardization and reproducibility through defined dissociation, plating, and imaging parameters.
- Strategic Value: Improve go/no-go decisions by linking target inhibition to reduced invasive phenotypes, decreasing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enable risk-adjusted prioritization based on functional validation of anti-invasive activity in a clinically relevant model.
Implementation Considerations
- Require expertise in BTSC culture, neurosphere handling, and live-cell imaging systems.
- Depend on collagen-coated chemotaxis plates, invasion matrices, and environmental controls for accurate quantification.
- Necessitate cross-team standardization of dissociation protocols, cell counting, and bubble avoidance to ensure data integrity.
- Involve adaptation considerations for different BTSC lines based on neurosphere size and dissociation efficiency.
- Include practical limitations such as the need to optimize drug exposure times and image acquisition intervals per BTSC culture.
