An <em>In Vitro</em> Approach to Photodynamic Therapy

Evan Austin; Jared Jagdeo

doi:10.3791/58190

JoVE Journal
Medicine

This content is Free Access.

JoVE Journal Medicine

An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

体外光線力学的治療へのアプローチ

Full Text

9,469 Views

04:53 min

August 17, 2018

DOI: 10.3791/58190-v

Evan Austin^1,2, Jared Jagdeo^1,2,3

¹Department of Dermatology,University of California, Davis, ²Dermatology Service,Sacramento VA Medical Center, ³Department of Dermatology,State University of New York, Downstate Medical Center

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This article presents a detailed in vitro protocol for photodynamic therapy (PDT), focusing on the effects of photosensitizer incubation and light treatment parameters on apoptosis. The method aims to facilitate the development of novel PDT protocols and enhance understanding of its applications in skin cancer research.

Key Study Components

Area of Science

Photodynamic therapy
Cell apoptosis
In vitro experimental protocols

Background

Photodynamic therapy involves the use of photosensitizers and light to induce cell death.
Understanding the parameters affecting PDT can lead to improved therapeutic strategies.
In vitro studies are essential for optimizing PDT protocols.
This method can help explore the efficacy of different photosensitizers.

Purpose of Study

To establish a reliable in vitro PDT protocol.
To investigate the effects of incubation duration and temperature on PDT efficacy.
To assess the impact of light treatment parameters on cell apoptosis.

Methods Used

Cell plating and incubation in a controlled environment.
Application of varying concentrations of 5-ALA as a photosensitizer.
Blue light irradiation with controlled fluence and irradiance.
Flow cytometric analysis to quantify apoptosis.

Main Results

A dose-dependent increase in cell apoptosis was observed following PDT.
Variations in incubation time and temperature influenced treatment efficacy.
Standard flow cytometric protocols were effective in analyzing cell death.
Further techniques like RTQPCR and western blot can be applied post-treatment.

Conclusions

The established protocol provides a framework for future PDT research.
Understanding the parameters can lead to better therapeutic outcomes.
This method can be adapted for studying other skin diseases in vitro.

Frequently Asked Questions

What is photodynamic therapy?

Photodynamic therapy (PDT) is a treatment that uses photosensitizers and light to induce cell death, particularly in cancer cells.

How does the incubation time affect PDT?

Longer incubation times can enhance the uptake of photosensitizers, potentially increasing the effectiveness of PDT.

What role does temperature play in PDT?

Temperature can influence the activity of photosensitizers and the overall efficacy of the treatment.

What methods are used to analyze apoptosis?

Flow cytometric analysis is commonly used to quantify apoptosis following PDT treatment.

Can this protocol be used for other types of cells?

Yes, the protocol can be adapted for various cell types to study the effects of PDT.

What are the potential applications of this research?

This research can lead to improved PDT protocols for treating skin cancer and other skin diseases.

光線力学療法 (PDT) は、ジベレリン光増感剤 (PS) 目に見える光した後アポトーシス誘導へのインキュベーションを含む医療処置です。PS 培養と光治療パラメーターの差異を検討するために使用可能性があります PDT をシミュレートするように設計の in vitro PDT プロトコルを提案します。

この方法は、光線力学療法(PDT)に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法を使用して答えることができる質問には、光増感剤のインキュベーション期間、または細胞を加熱または冷却して温度を変更するなど、実験でのさまざまなパラメーターの使用が含まれます。この技術は、PDTの新規光増感剤、プロトコル、および適応症のin vitro開発を促進するのに役立ちます。

まず、2ミリリットルの培養培地に10〜4番目の細胞を2回、6ウェルプレートの各ウェルに、無菌技術を使用して、摂氏37度と二酸化炭素5%で24時間インキュベーションします。翌日、少なくとも2ミリリットルのPBSで細胞を洗浄し、新たに調製した5-ALAのゼロ、ゼロポイント5、1、または2ミリメートルの希釈で培養物を処理します。次に、プレートを摂氏36〜37度の加熱ブロックに30分間置き、光から保護します。

手順では、インキュベーション段階で、研究者が加熱ブロックを使用して、インキュベーション期間全体で一貫した温度を達成することをお勧めします。さらに、インキュベーション期間中は、光増感剤の活性化を防ぐために、細胞をアルミホイルで覆うことをお勧めします。インキュベーションの終わりに、各ウェルの細胞を2ミリリットルのPBSで洗浄します。

そして、ブルーライト照射用の2ミリリットルの新鮮な培地で培養物をリフレッシュします。細胞を照射する前に、青色光装置を417ナノメートルの出力波長で1、000秒のサイクルで温め、光度計を使用して細胞表面の放射照度を測定し、光源の強度に応じて適切な放射照度を達成するために光の距離を調整します。次に、5-ALA処理した細胞を青色光の下の黒い表面に1,000秒間置き、合計10ジュール/平方センチメートルのフルエンスを実現します。

光の活性化中は、光の反射や一貫性のない投与を防ぐために、細胞を黒い表面に置くことをお勧めします。光線療法治療の最後に、各ウェルの細胞を2ミリリットルのPBSで洗浄し、ウェルあたり1ミリリットルの0.25%トリプシン-EDTAで細胞を剥離します。3〜5分後、剥離を確認し、10%FBSとPBSでトリプシンを非アクティブ化します。.

各ウェルからの細胞を個々の5ミリリットルのフローチューブに移し、遠心分離によって細胞を回収します。200 μLのフローバッファーと標識アネキシン-V抗体を各サンプルに加えます。細胞を再懸濁し、チューブをインキュベーターに20分間入れて、アネキシン-Vが結合できるようにします。

インキュベーションの終了時に、各サンプルに3マイクロリットルの7-AADを加え、室温で5分間再度インキュベートした後、標準的なフローサイトメトリー解析プロトコルに従ってサンプル分析を行います。5回のALAおよび青色光線療法治療の後、細胞アポトーシスの用量依存的な増加が観察されます。アポトーシスを受ける細胞の割合を計算するために、アネキシン-V高、7-AAD低、およびアネキシンV高、7-AAD高象限の細胞の割合を追加します。

5つのALAインキュベーション期間の長さ、インキュベーション温度、または光活性化照射量に一貫性がないと、光治療の有効性が変化し、例えばアポトーシスの温度依存的な増加につながる可能性があります。この手順に続いて、RTQPCRやウェスタンブロットなどの他の手法を実行して、PDTが遺伝子発現とタンパク質活性をどのように変化させるかを決定することができます。この方法により、光線力学療法に関心のある研究者は、in vitroで皮膚がん細胞やその他の皮膚疾患への影響を発見することができます。