Name: C-fos の役割と Dusp1 の遺伝子依存性の評価方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 学ぶc-FosとDusp1の遺伝学的検証法。マウス骨髄細胞を用いた白血病におけるオncogene依存性の評価と、キナーゼ駆動型がん治療標的の同定手法を解説。

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著者は BaF3 WEHI 細胞を提供するため g. q. デイリーに感謝して、MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP の t. Reya を構築します。著者は、CML 爆発危機から患者のサンプルを提供するため m. キャロルに感謝しています。本研究は、NCI (1RO1CA155091)、白血病研究財団と V 財団、NHLBI (R21HL114074-01) から修士に補助金によって支えられました。

<ol><li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr%2Fabl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science. 247, 824-830 (1990).</li>
<li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).</li>
<li>Mahon, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discontinuation+of+imatinib+in+patients+with+chronic+myeloid+leukaemia+who+have+maintained+complete+molecular+remission+for+at+least+2+years%3A+the+prospective%2C+multicentre+Stop+Imatinib+%28STIM%29+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial.</a> Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).</li>
<li>O'Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pushing+the+limits+of+targeted+therapy+in+chronic+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia.</a> Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).</li>
<li>Rousselot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imatinib+mesylate+discontinuation+in+patients+with+chronic+myelogenous+leukemia+in+complete+molecular+remission+for+more+than+2+years%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years.</a> Blood. 109, 58-60 (2007).</li>
<li>Krause, D. S., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+kinases+as+targets+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tyrosine kinases as targets for cancer therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).</li>
<li>Sharma, S. V., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+balance+between+life+and+death%3A+targeted+cancer+therapy+and+%22oncogenic+shock%22%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and "oncogenic shock".</a> Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).</li>
<li>Sharma, S. V., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene+addiction%3A+setting+the+stage+for+molecularly+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy.</a> Genes & Development. 21, 3214-3231 (2007).</li>
<li>Weinstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer.+Addiction+to+oncogenes--the+Achilles+heal+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer. Addiction to oncogenes--the Achilles heal of cancer.</a> Science. 297, 63-64 (2002).</li>
<li>Corbin, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chronic+myeloid+leukemia+stem+cells+are+insensitive+to+imatinib+despite+inhibition+of+BCR-ABL+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).</li>
<li>Straussman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+micro-environment+elicits+innate+resistance+to+RAF+inhibitors+through+HGF+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion.</a> Nature. 487, 500-504 (2012).</li>
<li>Wilson, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+potential+for+growth-factor-driven+resistance+to+anticancer+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors.</a> Nature. 487, 505-509 (2012).</li>
<li>Kesarwani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+c-FOS+and+DUSP1+abrogates+intrinsic+resistance+to+tyrosine-kinase+inhibitor+therapy+in+BCR-ABL-induced+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia.</a> Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-fos+regulates+neuronal+excitability+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">c-fos regulates neuronal excitability and survival.</a> Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).</li>
<li>Dorfman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+erp%2Fmkp-1+gene+does+not+affect+mouse+development%3A+normal+MAP+kinase+activity+in+ERP%2FMKP-1-deficient+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts.</a> Oncogene. 13, 925-931 (1996).</li>
<li>Padhye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorocurcumins+as+cyclooxygenase-2+inhibitor%3A+molecular+docking%2C+pharmacokinetics+and+tissue+distribution+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice.</a> Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).</li>
<li>Molina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeting+of+quiescent+chronic+myelogenous+leukemia+stem+cells+by+histone+deacetylase+inhibitors+in+combination+with+imatinib+mesylate%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate.</a> Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).</li>
<li>Koschmieder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+chronic+phase+of+myeloid+leukemia+with+expansion+of+hematopoietic+stem+cells+in+a+transgenic+model+of+BCR-ABL+leukemogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis.</a> Blood. 105, 324-334 (2005).</li>
<li>Abraham, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+targeting+of+p53+and+c-MYC+selectively+eliminates+leukaemic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells.</a> Nature. 534, 341-346 (2016).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+p53+by+SIRT1+inhibition+enhances+elimination+of+CML+leukemia+stem+cells+in+combination+with+imatinib%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib.</a> Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).</li>
<li>Qiagen-miRNAeasy kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources">https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources</a> (2018).</li>
<li>DNA-free DNA removal kit. , Available from: 
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<li>SuperScript™ III First-Strand Synthesis System. , Available from: 
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<li>Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html">https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html</a> (2018).</li>
<li>Abarrategi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+human+bone+marrow+niche+in+mice%3A+From+host+bone+marrow+engraftment+to+bioengineering+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modeling the human bone marrow niche in mice: From host bone marrow engraftment to bioengineering approaches.</a> Journal of Experimental Medicine. 215, 729-743 (2018).</li>
<li>Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+screening+and+validation+of+resistant+mutations+against+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

癌細胞の一括、TKI 治療に対しては腫瘍がはまっているチロシン キナーゼ腫瘍信号の封鎖によって媒介されます。しかし、比較的少しは MRD に貢献する癌細胞の少数が遺伝子依存性と治療4をエスケープする方法について知られています。最近の研究では、ことは白血病や固形臓器腫瘍の薬剤耐性を仲介する成長因子シグナリングを明らかにしました。様々 な分子メカニズムがあります固有抵抗10、11,12の根底にあることが示唆されました。メカニズムを理解し、遺伝子治療開発対象を識別する、包括的な全ゲノム発現マウス (BaF3) と人間 (K562) 細胞を使用して行った。プライマリ骨髄サンプルが大幅に異機種混在、彼らは関連した遺伝子/ターゲットの身元をマスク、疑い、マウスの白血病や慢性骨髄性白血病患者から一次サンプルは使用されませんでした。細胞 (幹細胞) を並べ替えて抗体精製は、重要な多様性を示します。したがって、浄化された細...

BCR ABL1 融合遺伝子の構成のチロシンキナーゼの活性を引き起こす慢性骨髄性白血病、小分子阻害剤によってキナーゼ活動を対象とする理論的根拠を提供します。この慢性骨髄性白血病患者の治療の成功は、標的療法1,2の概念を革命化しました。その後、いくつかなどの悪性腫瘍、固形腫瘍の精密薬として抗プロテインキナーゼ治療が開発されました。ところ、30 以上のキナーゼ阻害剤は、様々 な悪性腫瘍の治療のため米国状態 FDA によって承認されています。TKI 治療は病気の抑制に非常に効果的ですが、根治的ではありません。その上、癌細胞の小集団が治療中に続く: MRD3,4,5。完全寛解を示したもの患者は最終的に再発でなく継続的に結果を抑圧する MRD が残っています。したがって、MRD 細胞の撲滅は、耐久性や治療の応答を達成するために必要です。慢性骨髄性白血病は、精密医学の概念は、発癌、合理的なターゲット向けの治療、病気の進行と薬剤耐性のメカニズムを定義するための貴重なパラダイムします。しかし、今日でも、がん細胞における TKI が誘導する細胞死のメカニズムは十分に理解されていない、またなぜ MRD 細胞 (白血病幹細胞 [LSCs] で構成) がず4,6に本質的に耐性。変異キナーゼ腫瘍を「癌遺伝子依存性」の現象がこによって目標とされた遺伝子急性阻害が大規模なアポトーシス応答またはセルに静穏化につながる発癌ショックを引き起こす TKI 効果に関与しているにもかかわらず、コンテキスト依存的6,7,8,9。ただし、遺伝子依存性のメカニズムの基盤が欠けています。最近の研究は、成長因子シグナリング遺伝子依存性の放棄し、その結果 TKI 療法10、11,12に対する耐性を付与に関与しています。したがって、遺伝子依存性のメカニズムに洞察力を得るためには、BCR ABL1 中毒と C-fos と Dusp1 がの重要なメディエーターであることを明らかにした (成長因子と成長)、nonaddicted の細胞からの全ゲノム発現プロファイリングを行った癌遺伝子中毒13。C-fos と Dusp1 の遺伝子の欠失は合成 BCR ABL1 表現する致命的な細胞、実験に使ったマウス白血病を開発しなかった。また、小分子阻害剤による C-fos と DUSP1 の阻害は、マウスにおける BCR 誘起 ABL1 CML を硬化させます。結果は、その下位レベルより高いレベルの治療13への抵抗を引き起こす間薬剤感受性を協議する C-fos と Dusp1 の発現が癌細胞でアポトーシスしきい値を定義を示します。
運転がん遺伝子依存性遺伝子を識別するためにいくつかの全ゲノム発現マウスと慢性骨髄性白血病患者由来細胞 (K562) の両方を使用して成長因子といって (イマチニブ) 存在下で実験を行った。CD34 から取得した慢性骨髄性白血病患者のデータ セットと並行してこれらのデータを分析した+造血幹細胞イマチニブ治療前後。この分析は、3 つの遺伝子を明らかにした (転写因子 [C-fos]、二重特定性のホスファターゼ 1 [Dusp1] と RNA 結合タンパク質 [Zfp36])、TKI 耐性細胞における一般的。薬剤耐性のこれらの遺伝子の意義を検証するには、ステップバイ ステップの in vitroとin vivoの解析を行った。これらの遺伝子の表現のレベルは、リアルタイム qPCR (RT qPCR) と薬剤耐性細胞のウェスタンブロッティングによって確認されました。さらに、cDNA 発現と Dusp1、C-fos の shRNA ヘアピンによるノックダウンと Zfp36 高架 C-fos と Dusp1 式が TKI 耐性を授けるに必要かつ充分なことを明らかにしました。したがって、のみ C-fos と Dusp1 マウス モデルを用いた生体内での検証を行った。C-fos と Dusp1 の遺伝学的検証、我々 ROSACreERT 誘導性 C-fosフロリダ州/フロリダマウス (条件付きノックアウト)14を作成し、Dusp1-/- (まっすぐノックアウト)15 ROSACreERT2 Fosフロリダ州/フロリダ州をようにそれらを交差させたDusp1-/-ダブル トランスジェニック マウス。C キット+ - 骨髄由来細胞 (Fos からフロリダ州/フロリダ・ Dusp1-/--、および Fosフロリダ州/フロリダ州Dusp1-/-) でコロニー形成単位 (CFU) 試金およびの in vitro解析あった BCR ABL1 を表現します。vivo白血病開発で単独で、または一緒に C-fos と Dusp1 の要件をテストするための致死的に放射線照射したマウスの骨髄移植によって。同様に、DFC (difluorinated クルクミン)16 C-fos と BCI によって Dusp1 の化学阻害 (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17テストされた in vitro および in vivo BCR ABL1-表現、骨を使用して野生型 (WT) マウス骨髄由来の c キット+細胞。白血病幹細胞における C-fos と Dusp1 の要件を確認するには、我々 は、BCR ABL1 は特異的にその幹細胞ドキシサイクリン (テト転写活性化表現するマウスの幹細胞白血病 (SCL) 遺伝子 3' エンハンサーの下で慢性骨髄性白血病モデルマウスを利用しました。規制)18,19。骨髄林-を用いて生体内での移植試験でこれらのマウスから細胞の Sca+c キット+ (LSK)。さらに、我々 phopsho p38 レベルと Dusp1 と C-fos 阻害の薬物ダイナミック バイオ マーカーとして il-6 の発現がそれぞれ開設、生体内で。最後に、人間の関連性、患者由来の CD34 の研究を拡張する+細胞 (マウスから c キット+細胞に相当) が長期的に受ける体外培養開始細胞アッセイ (LTCIC) との生体内でヒト化マウスモデル慢性骨髄性白血病の20,21。免疫不全マウスは CML CD34 陽性細胞、続いて薬物治療と白血病細胞生存率の解析で移植されました。
このプロジェクトで異なる前臨床モデルを使用してターゲット識別と遺伝的・化学的ツールを使用して検証のためのメソッドを開発します。これらのメソッドは、他の治療開発のための化学療法の開発のターゲットを検証に正常に適用できます。

<table><tbody><tr><td>Biological Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Cellgro (corning)</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro (corning)</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Cellgro (corning)</td><td>15-016-CVR</td><td></td></tr><tr><td>RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment</td><td>Takara</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>MethoCultGF M3434 (マウスCFU用メチルセルロース)</td><td>幹細胞</td><td>3434</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult H4434 Classic (ヒト CFU 用メチルセルロース)</td><td>幹細胞</td><td>4434</td><td></td></tr><tr><td>4-ヒドロキシタモキシフェン</td><td>Sigma</td><td>H6278</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス SCF</td><td>Prospec</td><td>CYT-275</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス FLT3-リガンド</td><td>Prospec</td><td>CYT-340</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス IL-6</td><td>Prospec</td><td>CYT-350</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス IL-7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>DFC</td><td>LKT Laboratories Inc.</td><td>D3420</td><td></td></tr><tr><td>BCI</td><td>Chemzon Scientific</td><td>NZ-06-195</td><td></td></tr><tr><td>イマチニブ</td><td>LC ラボラトリー</td><td>I-5508</td><td></td></tr><tr><td>クルクミン</td><td>Σ</td><td>458-37-7</td><td></td></tr><tr><td>NDGA</td><td>Σ</td><td>500-38-9</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Cellgro (corning)</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta biological</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン EDTA 1x</td><td>Cellgro (コーニング)</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Cellgro (コーニング)</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>セルグロ (コーニング)</td><td>25-005-CL</td><td>5 mg/mL 水溶液</td></tr><tr><td>プロマイシン</td><td>ギブコ (ライフテクノロジーズ)</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>硫酸プロタミン</td><td></td><td>Σ P3369</td> 5 <td>mg/mL 水溶液</td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液 (0.4%)</td> <td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>WST-1</td><td>Roche</td><td>11644807001</td><td></td></tr><tr><td>0.45&mu;マクロディスクフィルター</td><td>PALL</td><td>2016-10</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;m ナイロン細胞 stariner</td><td>Becton Dickinson</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose)</td><td>Simga</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>CO-RO</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase Inhibitor Cocktail 2</td><td>Sigma</td><td>P5762</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocullulose Membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>1620115</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate)</td><td>Thermo Scientific</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>CD5</td><td>eBioscience</td><td>13-0051-82</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>eBioscience</td><td>13-0112-75</td><td></td></tr><tr><td>CD45R (B220)</td><td>BD biosciences</td><td>553092</td><td></td></tr><tr><td>CD45.1-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0453-85</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0454-83</td><td></td></tr><tr><td>hCD45-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555482</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Biotin-FITC</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-857&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-7-4</td><td>eBioscience</td><td>MA5-16539</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)</td><td>eBioscience</td><td>13-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ter-119</td><td>eBioscience</td><td>13-5921-75</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>558612 CD117 APC&nbsp;</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>553356</tr><tr><td>BD Pharm Lyse</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555899</tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm(固定・透過化液)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>554714</tr><tr><td>BDパーマ/ウォッシュ&nbsp;(リン酸化流の透過化および洗浄液)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>554723</tr><tr><td>リン酸化p38</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>4511S</td><td></td></tr><tr><td>合計p38</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>9212</td><td></td></tr><tr><td>マウスIgG制御</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>554121</tr><tr><td>Alexa Flour 488 コンジュゲート&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>K278001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x HBS</td><td>Invitrogen</td><td>K278002</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Ambion</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>毛細血管</td><td>Fisher</td><td>22-260-950</td><td></td></tr><tr><td>採血管</td><td>Giene Bio-One</td><td>450480</td><td></td></tr><tr><td>新生子牛血清</td><td>アトランタ 生物学的</td><td>S11295</td><td></td></tr><tr><td>エリスロポエイン</td><td>アムジェン</td><td>5513-267-10</td><td></td></tr><tr><td>ヒト SCF</td><td>プロスペック</td><td>CYT-255</td><td></td></tr><tr><td>ヒト IL-3</td><td>プロスペック</td><td>CYT-210</td><td></td></tr><tr><td>G-SCF</td><td>プロスペック</td><td>CYT-220</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>プロスペック</td><td>CYT-221</td><td></td></tr><tr><td>MyeloCult (LTCICアッセイ用培地)</td><td>幹細胞技術</td><td>5100</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン 半琥和酸ナトリウム</td><td>幹細胞技術</td><td>7904</td><td></td></tr><tr><td>MEM α</td><td>Gibco</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>1/2 cc Lo-Dose u-100 インスリン注射器 28 G1/2</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>モルトール ク</td><td>ア テック&nbsp;</td><td>60316 and 60317</td><td></td></tr><tr><td>Isoflorane (Isothesia TM)</td><td>Butler Schien</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>SOC</td><td>New England Biolabs</td><td>B90920s</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>100 mg/mL 水ストック</td></tr><tr><td>バクト寒天(寒天)</td><td>Difco</td><td>214050</td><td></td></tr><tr><td>Terrific broth</td><td>Becton Dickinson</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Genemate</td><td>E-3119-500</td><td></td></tr><tr><td>ドキシサイクリン チャウ</td><td>TestDiet.com</td><td>52662</td><td>変性RMH1500、オートクレーブ可能 5LK8&nbsp; 0.0625% ドキシサイクリン&nbsp;</td></tr><tr><td>タモキシフェン</td><td>シグマ</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>ヨードニトロテトラゾリウムクロリド&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I10406</td><td></td></tr><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dneasy 血液&組織キット</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye)</td><td>Promega</td><td>M1722</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit&nbsp;(RNA単離キット)</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td></td></tr><tr><td>DNA Free Dnase Kit (RT PCR の DNAse 治療)</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM1906</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III First Strand Synthesis (cDNA 合成の逆転写酵素)</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green (qPCR 用の緑色のインターキャレーティング色素と taq ポリメラーゼミックス)</td><td>Bio-Rad</td><td>1725270</td><td></td></tr><tr><td>CD117 MicroBead Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-224</td><td></td></tr><tr><td>ヒト長期培養開始細胞アッセイ</td><td>Stemp Cell Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NAPCO シリーズ 8000 WJ CO2 インキュベーター</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スイングバケットローター セトリフュージ 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-10自動セルカウンター</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C-1000 サーマルサイクラー</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Real Plex 2</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Imaging System (ゲルおよびウェスタンブロット用イメージングシステム)</td><td>Bio-RAD</td><td>17001401</td><td></td></tr><tr><td>Hemavet (boold counter)</td><td>Drew-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II (FACS analyzer)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フォルテッサI(FACSSアナライザー)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSAriaII(FACSソーター)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マグネットスタンド</td><td>ミルテニー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>照射器</td><td>&nbsp;J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA</td><td>Mark I Model 68A</td><td>source Cs 137</td></tr><tr><td>Mice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ROSACreERT2</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scl-tTA&nbsp;</td><td>クラウディア・ヒュットナー博士</td><td></td><td></td>研究室</tr><tr><td>BoyJ&nbsp;</td><td>CCHMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6のマウスコア施設&nbsp;</td><td>CCHMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/-&nbsp;</td><td>自社</td><td></td><td></td>製</tr><tr><td>ROSACreERT2/c-Fosfl/FL</td><td>自社製</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BaF3</td><td>ギフト George Daley, Harvard Medical School, Boston</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WEHI</td><td>Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CML-CD34+ and Normal CD34+ cells</td><td>シンシナティ</td><td></td><td></td>大学医学部附属病院</tr></tbody></table>

c-fos の役割と dusp1 の遺伝子依存性の評価方法

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

慢性骨髄性白血病 (CML) 治療におけるチロシン キナーゼ阻害剤 (こ) のデモンストレーションが癌治療の新しい時代を告げた。ただし、セルの小さい人口に応答しません TKI 治療結果微小残存病変 (MRD);これらの細胞を根絶するためにも、最も強力なず失敗。これらの MRD の細胞は、治療への抵抗を開発するための貯水池として機能します。TKI 治療なん MRD のセルに対して有効であることは知られていません。TKI 治療中に MRD 細胞の生存を支える成長因子シグナリング、関与しているが、機構の理解が欠けています。最近の研究では、昇格した C-fos と Dusp1 式収束結果発癌性成長因子 MRD 細胞内シグナルが TKI 抵抗を仲介することを示した。C-fos と Dusp1 の遺伝的・化学的抑制は、こに絶妙に敏感 CML をレンダリングし、遺伝とヒト化マウスモデルの慢性骨髄性白血病の治療法します。TKI 感受性及び抵抗性細胞から複数のマイクロ アレイを使用してこれらのターゲット遺伝子を同定しました。ここでは、in vitro および in vivo マウスモデルを使用してターゲットの検証のためのメソッドを提供します。これらのメソッドは、遺伝学的検証、および治療開発を対象に簡単に適用できます。

癌遺伝子の中毒は、この治療効果に関与しています。ただし、遺伝子依存性の駆動メカニズムは理解されていません。中毒の調整に関与する遺伝的要素を識別するために複数の公平な遺伝子発現解析を行った。これらの分析には、3 つの遺伝子、C-fos、Dusp1 と Zfp36、がん細胞、がん化シグナルの生存のために依存しない、したがって、TKI 治療に敏感ではないでのアップレギュレーションが明らかにしました。ShRNA を介したノックダウンによる C-fos と Dusp1 のダウンレギュレーションがそうでなければ TKI 耐性の薬剤感受性を復元するための十分なセル。
白血病の治療上のターゲットとしての C-fos と Dusp1 の役割を検証するのには、BCR ABL1 遺伝子を発現する BaF3 細胞を使用しての過剰発現が初めて確認されて。成長因子 BA BaF3 細胞内シグナル等遺伝子依存性;結果として、彼らは TKI 治療に応答しません。Rt-qpcr と西部...

ここでは、in vitro および in vivo 遺伝子とヒト化マウスモデルを使用して白血病の薬剤標的として C-fos と Dusp1 の遺伝的・化学的検証のためのプロトコルについて述べる。このメソッドは、遺伝学的検証、および治療開発を対象に適用できます。

C-fos の役割と Dusp1 の遺伝子依存性の評価方法

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

この方法は、がん遺伝子依存に関与する主要な遺伝子の同定など、がん治療薬分野の主要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、多くのキナーゼ駆動癌に共通する腫瘍遺伝子依存性を利用するため、複数の腫瘍タイプに適用可能である。この方法は白血病に関する洞察を提供することができますが、肺癌、脳腫瘍、膵臓腫瘍などの固形腫瘍のような他のシステムにも適用できます。一般的に、この方法に新しい個人は、分子生物学や細胞生理学の経験の欠如のために苦労します。まず、安楽死させたマウスから脚の骨を収穫します。メスで骨から組織をきれいにします。その後、氷の上に冷たいPBSに骨を置き、害虫で骨を粉砕します。この後、70マイクロメートルのセルストレーナーを通して、10ミリリットルのピペットを用いた50ミリリットルのスクリューキャップチューブにセルサスペンションをフィルターします。乳鉢と害虫を冷たいPBSで複数回洗い、50ミリリットルチューブに細胞懸濁液を加えます。次に骨髄を遠心分離し、真空とガラスピペットで上清を取り除きます。細胞ペレットを5ミリリットルのPBSで再懸濁する。ピペットを使用して、中断した骨髄を室温ポリショ糖の上部にゆっくりと加えます。この後、ポリショ糖を400 Gsで20分間回転させてブレーキをオフにします。遠心分離後、ピペットで曇った全単核細胞界面を回収し、新しい15ミリリットルチューブに移します。PBSで10ミリリットルにボリュームを持参し、カウントのために20マイクロリットルを取り除く。遠心後、上清を捨てて、ペレットを氷の上に置きます。次に、EDTAおよびBSAでPBS中の細胞ペレットを再懸濁する。CD117マイクロビーズを細胞懸濁液に加え、渦を混ぜ合わせます。この後、4°Cで10分間、懸濁液をインキュベートします。その後、EDTAとBSAと遠心分離機で1200 Gで5分間、10ミリリットルまでのボリュームを持って来ます。真空を使用して上清を除去し、EDTAおよびBSAでPBS中の細胞ペレットを一時停止する。次に、EDTAとBSAを持つPBSを磁気カラム付きのマグネットスタンドに3ミリリットル加え、回収管に流れ込みます。バッファーが列を通過し終わったら、セルの懸濁液を追加し、列を通ってコレクションチューブに流れるようにします。次に、EDTAとBSAを持つPBSをさらに5ミリリットル追加し、プランジャーですぐにフラッシュします。プランジャーを取り外し、セルを数える前にフラッシュを繰り返します。細胞を遠心分離した後、上清を取り除き、培養のために完全なIMDMで細胞ペレットを一時停止する。細胞を摂氏37度で一晩培養し、5%の二酸化炭素を使用します。まず、レトロウイルスプラスミドDNAを1.5ミリリットルチューブに包装プラスミド、塩化カルシウム、水と組み合わせます。その後、HBSの500マイクロリットルを別の1.5ミリリットルのチューブに加えます。最も低い設定に設定されたボルテクサーと同時に混合しながら、HBSを含むチューブにトランスフェクション混合物をドロップワイズ追加します。トランスフェクション混合物を室温で20~30分間インキュベートする。インキュベーション期間中、HEK細胞にクロロキンを加え、インキュベーターに保管します。トランスフェクションミックスを加えた後、新鮮なDMEM10培地を14ミリリットル加えて細胞培地を変化させる摂氏3%CO2インキュベーターで8時間培養します。皿の壁に対してゆっくりとピペットを入れ、HEK細胞の剥がしを防ぐのに役立ちます。その後、摂氏37度5%CO2インキュベーターで細胞を一晩インキュベートします。ウイルス上清を収集するために10ミリリットルの注射器を使用してください。その後、0.45マイクロメートルのシリンジフィルターをシリンジに取り付けます。ウイルス上清を新しいコレクションチューブに突っ込みます。約16時間後にウイルス上清を収集します。この後、PBSに2ミリリットルの組換えヒトフィブロネクチン断片を未治療6ウェル培養プレートに添加する。翌日、ピペットを使用してプレートからフィブロネクチンを取り除きます。PBSで2%BSAでプレートをブロックし、室温で30分間インキュベートします。真空を使用してBSAを取り除き、PBSでプレートを洗ってから真空で取り除きます。この後、すぐに濾過されたウイルス上清を加え、プレートを2時間遠心分離する。真空を使用して上清を取り除き、プレートを再び回転させます。次に真空で上清を取り除き、PBSでウイルスコーティングされた井戸を洗浄します。真空でPBSを取り出し、以前培養したc-Kipとマウス細胞をウイルスコーティングされたウェルに加える。遠心分離後、セルを摂氏37度と5%の二酸化炭素でインキュベートします。導入から48時間後、遠心分離を介して細胞をペレット化し、FACS緩衝液1で再懸濁した。まず、マウスのメチルセルロースをサイトカインで室温で解凍します。次いでFACSチューブ中のメチルセルロースの3ミリリットルをアリコートした。メチルセルロースの3ミリリットルに適切な阻害剤を用いて細胞懸濁液の100マイクロリットルを加える。その後、サスペンションを10〜30秒間高く渦液します。気泡のほとんどが逃げた後、1ミリリットルのシリンジを使用して、3つの複製プレートに1ミリリットルの培地をプレートします。皿を大きなペトリ皿に入れ、滅菌水を入れた1つのオープンディッシュと一緒に入れます。その後、大きなペトリ皿をカバーし、37°Cで細胞をインキュベートします。10ミリリットルの水に10ミリグラムの塩化ヨドニトロテトラゾリウムを溶解して、ヨドニトロテトラゾリウムクロリドステインを調製します。フィルターは0.2マイクロメートルフィルターが装備されているLuerロックシリンジと染色液を殺菌する。組織培養フードに、CFUプレートの周りに滴下して100マイクロリットルの染色液を加える。その後、細胞培養インキュベーターで摂氏37度で一晩プレートをインキュベートします。最後に、コロニーが濃い赤色の茶色に変わった後、染色されたCFUプレートの写真を撮るために、無菌組織培養フードに白い背景を使用する。このプロトコルでは、複数の公平な遺伝子発現分析を使用して、遺伝子中毒を調整する遺伝的構成要素を同定した。白血病における治療標的としてのc-FosおよびDusp1の役割を検証するために、BCR-ABL1オンコジーンを発現する細胞でそれらの過剰発現が確認された。RT-qPCRおよびウェスタンブロッティングによる分析は、両方ともBCR-ABL1によって誘導され、その発現が成長因子IL-3によって増強されることを確認した。YFPプラス発現細胞は、さらにインビトロおよびインビボアッセイのためにFACSを介して選別した。結果は、c-FosおよびDusp1の削除のみによってCFU数が阻害されることを示した。c-FosとDusp1の両方を欠いている細胞は、コロニーを形成する能力が著しく損なわれ、イマチニブ治療はC-FosおよびDusp1の喪失がBCR-ABL1発現に対して合成致死的であることを示すCFUsのすべてを一掃した。この開発の後、この技術は、がんの分野の研究者が、遺伝子の依存を促進する遺伝的ネットワークと遺伝子を探求し、これらの遺伝子がマウスモデルおよびヒト患者における特定の応答にどのような影響を与えるかを探求する道を開いた。レトロウイルスや患者のサンプルを使用すると、この手順を実行している間に非常に危険で安全な実験室の練習を観察することができることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

このビデオでは、慢性骨髄性白血病細胞株のレトロウイルスを使用して標的遺伝子を移植することにより、遺伝子検証のプロトコルについて説明しています。レトロウイルスは、形質導入と呼ばれるプロセスを通じて遺伝物質を白血病細胞に移植するメディエーターとして機能し、標的遺伝子の長期発現を可能にします。この方法は、遺伝子検証と治療開発のために、任意の標的細胞に適用できます。...

レトロウイルス媒介形質導入:がん細胞に標的遺伝子を導入する方法

フォーカス形成アッセイは、候補癌遺伝子の形質転換能を評価するための簡単​​な方法を提供する。...

フォーカス形成：細胞ベースのアッセイ遺伝子の発癌性を決定するために、

このプロトコルは、 ショウジョウバエの眼/触角成虫（EAD）に蛍光マークされ、遺伝的に定義されたクローンの腫瘍を生成する方法を示します。なお、第3齢幼虫とどのように遺伝子発現の変化と腫瘍侵襲性を可視化し、定量化するためにそれらを処理するからEADと脳を分析する方法について説明します。...

ザ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;成虫盤腫瘍モデル：遺伝的モザイクを用いた遺伝子発現と腫瘍侵襲性の可視化と定量化

前臨床試験からヒト試験に移行する新規薬物標的を特定することは、科学的な優先事項です。そのために、ここでは、遺伝子の枯渇ががん細胞株スフェロイドに与える影響を調べるための機能ゲノミクスアプローチについて説明します。これは、in...

癌細胞スフェロイド培養における潜在的に新規薬剤標的を同定するためのスクリーニング機能ゲノミクスを利用

本稿では急性骨髄性白血病 (AML) 細胞増殖で複数の候補者の遺伝子の役割を簡単かつ迅速な捜査のためクラスター化定期的に空間短い回文を繰り返す (CRISPR) CRISPR ベース Cas9...

CRISPR ベース Cas9 の競争の試金を使用して遺伝的依存関係の調査

CRISPR/sgRNA ライブラリは、蛋白質コーディングの遺伝子を尋問に適用されています。ただし、CTCF 境界の遺伝子発現制御の機能を明らかにするための sgRNA ライブラリの可能性は未踏のままになります。ここでは、 HOX遺伝子座の CTCF 境界の働きを解明するHOX遺伝子特定 sgRNA...

HOX軌跡 Focused CRISPR/sgRNA ライブラリ スクリーニングを識別する重要な CTCF の境界

本質的に障害が発生したドメインは、発癌性融合転写因子機能にとって重要である。これらのタンパク質を治療的に標的にするためには、これらのドメインで採用される調節機構のより詳細な理解が必要である。ここでは、Ewing肉腫における本質的に無秩序なEWSドメインの重要な構造的特徴をマッピングするために、トランスクリプトミクスを使用する。...

トランスクリプトーム解析を用いた無秩序発がん性転写因子の構造機能関係のマッピング

子宮頸がん細胞の増殖とシスプラチン感受性における FAM83Aの役割を検証するためのFAM83A のノックダウン

この研究では、膵管細胞株のRNA-seq解析を通じて、pHの変化ががん遺伝子発現に及ぼす影響を調査するためのプロトコルについて説明します。...

膵管細胞株におけるpH変化を伴うがん遺伝子発現解析

癌の悪性挙動を理解するには、腫瘍細胞がマクロファージなどの腫瘍微小環境の構成要素とどのように相互作用するかについての正確なモデルを作成する必要があります。ここでは、膠芽腫細胞と腫瘍関連マクロファージおよびミクログリアとの相互作用を研究するための2つの方法について説明し、膠芽腫の浸潤への影響が評価されます。...

共培養アッセイは、神経膠芽腫の浸潤のマクロファージとミクログリアの刺激を研究します

学ぶc-FosとDusp1の遺伝学的検証法。マウス骨髄細胞を用いた白血病におけるオncogene依存性の評価と、キナーゼ駆動型がん治療標的の同定手法を解説。

C-fos の役割と Dusp1 の遺伝子依存性の評価方法

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