チップ チューブ形式を使用して散発的な家族性大腸腺腫症患者の遺伝的変異のデジタル ポリメラーゼ連鎖反応分析

この方法は、モザイク現象の検出やリキッドバイオプシーベースの遺伝子検査など、遺伝子検査分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、低バリアント対立遺伝子画分のハイスループット検出です。この技術の意味は、高感度で発がん性変異を検出することで精密医療に貢献できるため、腫瘍の診断にまで及びます。

この実験を開始するには、10 LのDNAサンプルバッファーを8チューブストリップのチューブに加えます。次に、1マイクロリットルのDNAラダーを8チューブストリップの最初のチューブに追加し、残りの各チューブに1マイクロリットルのサンプルゲノムDNAを追加します。マイクロプレートアタッチメントを使用して、8チューブストリップの内容物を1分間ボルテックスして混合します。

ストリップ、ピペットチップ、およびゲルデバイスを電気泳動装置に入れます。スタートボタンを押して実行を開始します。分析が完了したら、ディスプレイ上のエレクトロフェログラムをチェックして、DNAサンプルバッファーに含まれる下部マーカーがエレクトロフェログラムに正しく割り当てられていることを確認します。

そうでない場合は、ソフトウェアのエレクトロフェログラムモードでマーカーを手動で割り当てます。次に、ソフトウェアの領域モードで、ゲノムDNAのサイズ領域を指定して、DNAの濃度を自動的に計算します。以前に設計したプライマー、プローブ、ゲノムDNAを新しい8チューブストリップに加えると、合計15 L.Pipetteで上下に混合できます。

新しい8チューブストリップに組み込まれたチップにローディングプラットフォームを追加し、チューブストリップをオートローダーに配置します。チップとローディングプラットフォームとの間に接触があることを確認してください。次に、プラットフォームにローディングスライダーを配置し、ストッパーを使用してスライダーをローダーから離します。

PCR混合物をスライダーの先端付近に15Lピペットで移動させ、ローダーボタンを押してローダーを1分間運転します。実行後、ローダーからチューブストリップを取り外し、シーリングエンハンサーに入れます。スライドリッドと上蓋の端を慎重に押します。

シーリングエンハンサーを約2分間実行します。シーリングが不完全で、液体の水たまりで示されている場合は、さらに1分間実行を繰り返します。チューブに230Lのシーリング液を加えます。

チューブストリップをサーマルサイクラーにセットし、プロトコルに記載されているようにPCRを実行します。正のパーティションが不均一に分布している場合は、PCの温度または持続時間を調整します。PCR産物の蛍光強度を検出および解析するには、チューブストリップを検出治具に置き、6 mLの蒸留水を加えます。

ピペットチップを使用して、目に見える気泡を取り除きます。ジグを検出器にロードします。検出ソフトウェアで、[Fluorescence]、[Experiment]、[Sample NTC]タブの順に選択し、[RUN]ボタンをクリックして実行を開始します。

実行が完了したら、位置プロット、ヒストグラム、2-D散布図を確認します。PCR産物を採取するには、チューブからシール液を取り出します。100 LのTEバッファーを追加し、30秒間激しくボルテックスします。

卓上遠心分離機でチューブを短時間遠心分離し、テキストプロトコルに記載されているように進めて、PCR産物の収集を完了します。デジタルPCRで作成された位置プロットは、患者と父親サンプルの両方で黄色のHEX蛍光を示し、APC対立遺伝子バリアントTの存在を示していますが、テンプレートコントロールではそうではありません。FAMの緑色蛍光で示されるように、患者のゲノムDNAのみがCバリアントを含んでいます。

散布図によってさらに確認されたように、患者と父親の両方がHEXまたはバリアントTに陽性であるのに対し、患者のみがバリアントCの存在を示しています。一方、患者の両親と健康なドナーのVAFは0.1%未満でした 収集および濃縮されたDPCR製品の電気フェレーシスは、予測フラグメントのサイズが患者と両親のDNAの123塩基対であることが確認されています。この手順を試みるときは、ファンフィルターユニットを使用するなどして、ベンチを清潔に保つことを忘れないでください。