Name: チップ チューブ形式を使用して散発的な家族性大腸腺腫症患者の遺伝的変異のデジタル ポリメラーゼ連鎖反応分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: 学ぶデジタルPCRを用いた稀な遺伝的変異の高感度検出法。チップチューブ形式でAPCアレル変異を検出し、次世代シーケンスと同等のVAF定量精度を実現。がん診断や精密医療への応用が期待される技術です。

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本研究は、智 Kahyo に日本社会のための科学振興) (第 15 K 08397) から Scientific Research (C) 費補助金、医療研究と開発 (アメッド) (第 927960719)、機構からの助成金にサポートされていた科研費挑戦的萌芽研究 (No. 16 K 15256) 管理費補助金 (第 1019253) と喫煙研究財団の国立大学改革の推進のためのインセンティブ特別予算の関連するプロジェクトのための支出晴彦の杉村です。著者は、岩泉町博士と博士倉知を臨床応援ありがちましょう。資金提供者は、原稿の準備の役割はなかった。図 3図 4、および表 4は適応され、Kahyoらによって記事から転載10、エルゼビアから権限を持つ。

研究デザインは、浜松大学医学部 (G-260-4) の制度上の審査委員会によって承認されました。書面によるインフォームド コンセントは、患者と彼の親から入手されました。
1。 ゲノム DNA の品質管理
注: ゲノム DNA (gDNA) は確立されたシリカ系膜 DNA 精製法を使用して末梢血から抽出されました。事前のプロシージャの下 gDNA の濃度を分光光度計を使用して測定しました。
<ol><li>10-100 ng/μ L の濃度で gDNA サンプルを準備します。</li>
	<li>8 チューブ ストリップに DNA のサンプルバッファーの 10 μ L を追加します。</li>
	<li>チューブに 1 μ L の DNA の梯子または gDNA を追加します。渦マイクロ プレート添付ファイルを使用して 1 分の混合物。</li>
	<li>チューブをロードは、電気泳動にゲルのデバイスとピペットのヒント (資材表) をインストルメントし、'開始' ボタンを押して実行を開始します。 注: 電気泳動システムは、スタート ボタンを 1 つクリックするだけで自動的に動作します。</li>
	<li>DNA サンプル バッファーに含まれる低いマーカーは、エレクトロフェロに正しく割り当てられていることを確認します。それが正しくない割り当てられている場合は、ソフトウェアの「Electroherogram モード」でマーカーを手動で割り当てます。 注: DNA の整合性番号 (DIN) が自動的に計算されます。DIN の値は、DNA の完全性から来ています。高低騒音値は非常にそのままで、強く劣化 gDNA をそれぞれ示します。</li>
	<li>GDNA (&gt; 200 bp) の濃度を自動的に計算するソフトウェアの '地域モード' で gDNA (&gt; 200 bp) のサイズの領域を指定します。</li>
</ol>2. プライマーおよびプローブ設計
<ol><li>次の条件の下でオープン アクセス ツールを使用して溶融温度 (Tm) 値を計算: 10-25 拠点、50 mM Na+/K+、0.80 mM dNTPs および 3 mM Mg2 + (資材表)。前方および逆 Tm値 60 ° C 程度と私アンプリコン長さ 100-300 bp でターゲット遺伝子を含んでいるゲノムの領域を増幅するプライマーを設計します。 注: は、オリゴヌクレオチドの濃度の表 1を参照してください。</li>
	<li>次の条件に基づく設計参照とバリアントの遺伝子のプローブをロックされた核酸 (LNA): (i) 1-6 Lna が各プローブであります。(ii) の蛍光染料と逆 5' に存在している- と各プローブの 3'-terminuses それぞれ;(iii) 一致と不一致のプローブの Tm値の違いは、&gt; 10 ° C;(iv) Tm値の一致と不一致のプローブは、それぞれ高いと、プライマーのそれらより低い [例えば、前方のプライマー: 60.8 ° C、逆プライマー: 59.8 ° C、基準対立遺伝子プローブ (一致/不一致): 62.6/45.3 ° C、変形(一致/不一致) 対立遺伝子プローブ: 61.7/50.5 ° C]。Tm値は、手順 2.1 用のもオープン アクセス ツールを算出しました。</li>
	<li>設計されたプライマーとプローブに [例えば、単一ヌクレオチド多型データベース (dbSNP)] データベースから &gt; 0.1% の頻度で、一塩基多型が含まれませんを確認します。</li>
</ol>3. デジタル PCR
<ol><li>プライマー、プローブと gDNA TE バッファーと表 1に示す濃度の溶液を準備し、-20 に保管-4 ° C</li>
	<li>
表 1 に示すよう室温を最終濃度 15 μ L の容量で試薬を混ぜます。
	<ol>
<li>いいえテンプレート コントロール (NTC) gDNA の代わりに蒸留水の 3 μ L を追加します。</li>
		<li>3.5 x ピペッティングの誤差を考慮する 3 通で PCR の混合物の量を準備します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>それをミックスする上下に pcr をピペットします。</li>
	<li>8 チューブ ストリップに建てられたチップの上に荷台を設定し、オートローダにそれらを設定します。チップと読み込みプラットフォーム間の接触があることを確認します。</li>
	<li>プラットフォームで読み込みスライダーを合わせて、ローダーからストッパー付きスライダーを押し続けます。</li>
	<li>スライダー (図 1A) の先端の近くのプラットフォームで pcr の 15 μ L をピペットします。</li>
	<li>ローダを実行するには、(約 1 分) のローダーのボタンを押します。 注: 問題ではない、少量の pcr がプラットフォームに残っている場合です。順番にローダーを再実行することが可能です。</li>
	<li>チップ-の-、-チューブ シール エンハンサーの側のスロットに pcr でいっぱいに設定します。スライド蓋と上部のふたの端を押して壊れないチップ (図 1B)。</li>
	<li>(約 2 分) のシールのエンハンサを実行します。原因は不完全なシール、肯定的な信号 (図 1 1 D) のクロス汚染液体の水たまりがまだ表示される場合、順番に 1 分のシールのエンハンサーを再実行します。</li>
	<li>密封流体、チューブに、石油ベースの試薬の 230 μ L を追加します。 注: チップは、流体に今没頭する必要があります。</li>
	<li>熱 cycler でチューブを設定します。(約 2 時間) の表 2に説明されているように、サーマルサイクラーを実行します。肯定的なパーティション (図 1E) の偏在がある場合は、温度または PCR の期間を調整します。 注: 約 1 にランプに入る率を設定してお勧め ° C/s。</li>
	<li>ベースライン ノイズを低減する、少なくとも 15 分のサーマルサイクラーでチューブを残します。 注: チューブが一晩も残すことができます。蛍光信号が次の日も検出されました。</li>
	<li>検出治具にチューブをセットし、治具に 6 mL の蒸留水を注ぐ。空気の泡が、チューブの内外表示されているそれらを (数字 1 fと1 G) オフにします。</li>
	<li>検出器に治具を読み込み、蛍光・実験・ サンプル/NTC タブ (材料表) の選択後にソフトウェアの '実行' ボタンをクリックすると実行します。 注: デフォルト強度 8 試料のデュアル色検出は約 4-5 分かかります。</li>
	<li>位置プロット、ヒストグラム、散布図 2 D を確認します。 注: iIf 負のパーティションの蛍光強度が高い、30-70 の範囲内に収まるように、ソフトウェアの設定ボタンをクリックするだけで明るさを調整します。</li>
	<li>次の数式を使用してバリアント アレル分数 (エン) を計算します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58199/58199eq1.jpg"> ここでは、Cv と Cr は、バリアントと参照アレルのコピー番号それぞれ。 注: 彼らは自動的にポアソン統計量に基づくソフトウェア プログラムで計算されます。</li>
</ol>4 PCR の製品の収集
<ol><li>チューブからシール流体を削除します。</li>
	<li>チューブに TE バッファーの 100 μ L を追加します。30 s と簡単に遠心チューブを精力的に渦。</li>
	<li>別の管に TE 溶液を移し、30 μ L の 3 M 酢酸ナトリウムとエタノールの 200 μ L を追加します。</li>
	<li>-20 ° C でソリューションを一晩冷やします。</li>
	<li>16,000 x gで 30 分のためのソリューションを遠心し、上清を除去します。</li>
	<li>管と渦に 80% エタノール 300 μ L を追加します。</li>
	<li>16,000 x gで 15 分のためのソリューションを遠心し、上清を除去します。5 分風乾する沈殿物を許可します。</li>
	<li>風乾後 TE バッファーの 1-5 μ L で析出物を溶解します。</li>
	<li>必要に応じて、手順 1 を参照して電気泳動装置を用いて製品サイズを評価します。感度の高い (材料表) ゲル デバイス ソリューションの 1 μ L をロードします。</li>
</ol>

<ol><li>Majumdar, N., Wessel, T., Marks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+modeling+for+maximal+sensitivity%2C+dynamic+range+and+measurement+precision%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Digital PCR modeling for maximal sensitivity, dynamic range and measurement precision.</a> PLoS One. 10 (3), 0118833(2015).</li>
<li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+digital+MIQE+guidelines%3A+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Digital+PCR+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments.</a> Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).</li>
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<li>Alix-Panabières, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Applications+of+Circulating+Tumor+Cells+and+Circulating+Tumor+DNA+as+Liquid+Biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy.</a> Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).</li>
<li>Kiss, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+quantitative+polymerase+chain+reaction+in+picoliter+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets.</a> Analytical Chemistry. 80 (23), 8975-8981 (2008).</li>
<li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li>
<li>Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+digital+PCR+enables+multigene+analysis+of+individual+environmental+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria.</a> Science. 314 (5804), 1464-1467 (2006).</li>
<li>Low, H., Chan, S. J., Soo, G. H., Ling, B., Tan, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarity%E2%84%A2+digital+PCR+system%3A+a+novel+platform+for+absolute+quantification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Clarity™ digital PCR system: a novel platform for absolute quantification of nucleic acids.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (7), 1869-1875 (2017).</li>
<li>Iwaizumi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+APC+mosaicism+in+a+patient+with+familial+adenomatous+polyposis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genome+Variation%22%5BJournal%5D)">A novel APC mosaicism in a patient with familial adenomatous polyposis.</a> Human Genome Variation. 2, 15057(2015).</li>
<li>Kahyo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+digital+PCR+with+chip-in-a-tube+format+to+analyze+Adenomatous+polyposis+coli+%28APC%29+somatic+mosaicism%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Application of digital PCR with chip-in-a-tube format to analyze Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism.</a> Clinica Chimica Acta. 475, 91-96 (2017).</li>
<li>Kanai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Japanese+Society+of+Pathology+Guidelines+on+the+handling+of+pathological+tissue+samples+for+genomic+research%3A+Standard+operating+procedures+based+on+empirical+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+International%22%5BJournal%5D)">The Japanese Society of Pathology Guidelines on the handling of pathological tissue samples for genomic research: Standard operating procedures based on empirical analyses.</a> Pathology International. 68 (2), 63-90 (2018).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).</li>
<li>Cao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+digital+polymerase+chain+reaction+%28dPCR%29+and+its+emerging+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Advances in digital polymerase chain reaction (dPCR) and its emerging biomedical applications.</a> Biosensors and Bioelectronics. 90, 459-474 (2017).</li>
<li>Bio-Rad Laboratories. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/Isr/literature/Bulletin_6311.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/Isr/literature/Bulletin_6311.pdf</a> (2018).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.garvan.org.au/research/capabilities/molecular-genetics/documents/qs-3d-user-guide.pdf">https://www.garvan.org.au/research/capabilities/molecular-genetics/documents/qs-3d-user-guide.pdf</a> (2013).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

DIN 値は、gDNA の高度な低下は低品質データの可能性があるためしばしば数量や順序の前に (例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から gDNA) 傷つけられた DNA を評価するために使用されます。DIN 評価は、このように、人間 gDNA11の品質管理の重要なステップになって。GDNA 実験では代表的な使用は、血、その抽出後 4-11 年の 4 ° C で格納されていた、dPCR 試金する前に品質管理のため、DIN の値が決まります。この手順は、特に推奨材料が破損している疑いがある場合。GDNA 濃度も電気泳動によって決定しました。DPCR のダイナミック レンジは、qPCR パーティションの制限のために広いできないため gDNA 濃度の測定は成功した dPCR の試金のための重要なステップです。DNA dPCR のアッセイでバリアントと参照の遺伝子の総コピー数と相関していた入力の量として (R 乗 = 0.935;表 4) 電気泳動 dPCR 試金前に、gDNA 濃度の測定に便利です。
ロード ・ プロセスをシールは、成功した結果を得るのための重要なステップです。プラットフォームで pcr の適切な実装を確認し、チップおよびプラットフォーム (図 1A) 間の接触を確保することが重要です。スライダーから pcr の突出は、チップ.に無効なディストリビューションを引き起こす可能性位置プロット上の正と負のパーティションの分布を確認することも必要です正確な分析のため、DNA テンプレートがランダムに分割されて室1ポアソン統計と見なされるため。代表の結果肯定的なパーティションは、チップ (図 3) 全体に分散されました。この結果は、ポアソン統計情報の要件を満たすし、読み込みとシールの手順が有効であったことを反映しています。シールのエンハンサーでチューブを設定する場合、上部のふたの中央部があまりにも強くプッシュされる場合チップは壊れたかもしれない (図 1B)。これを避けるためには、上部のふたの端を軽く押します。肯定的なパーティション (図 1D) の人工クラスターの場合は、パーティション間の交差汚染によるコピー数を過大評価する可能性があります。液体の水たまりが表面 (図 1C) に表示される場合に改善されるシールの手順 (例えば、順番に 1 分のシールのエンハンサーを再実行して)。肯定的なパーティション (図 1E) 分布が不均一な場合、十分な増幅またはシールの流体と水の汚染のためコピー数を過小評価すること可能性があります。PCR の状態は、この場合は [例えば温度や PCR (プロトコルの手順 3.11) の時間をチューニングすることによってまたはシールの流体と治具に注いだ水が汚れていないことを確保することによって] 調整必要があります。蛍光シグナルは蒸留水に浸漬 8 チューブ ストリップから検出されます。空気の泡は、管の表面に付着、信号検出 (図 1 f) が妨害する可能性があります。したがって、罰金のピペット チップなどのツールを使用して泡がクリアされます。また、治具 (図 1G) に設定している場合、空気の泡はチューブ内フォームがあります。チューブ内の気泡がチップをカバーするのに十分な大きさなら、彼らもクリアする必要があります。彼らは室温でのいくつかの分が残っている場合、泡がオフにします。
いくつかの肯定的なパーティションは、NTC で検出可能性があります。DNA テンプレートの汚染を避けるためには、ベンチを清潔に保つし、可能であれば、ファン フィルター ユニットでクリーンな空間を作る。DNA テンプレートの汚染が疑われる場合徹底的にきれいにスペースおよび使用試薬を破棄します。対照的に、gDNA 存在参照アレルの肯定的なパーティションが検出されない場合は、gDNA、プライマーおよびプローブの濃度を再確認します。特に、プライマーは、代表的な実験では、従来の PCR (表 1)12と比較して低濃度で使用されました。また、従来の PCR はほとんど変更ランプ率を確認することが重要です。
チューブでのチップ形式で dPCR の異なるものは、普遍的な 8 チューブ ストリップ8,13内 pcr の分割です。PCR チューブに分割の部屋転送不要ですこのシステムで、汚染リスクを低減します。チップ チューブ形式を使用 dPCR システムに利点もあります。< 液滴ベース dPCR14の試金の同じ数を完了する、少なくとも 5 h かかるその dPCR システムで 96 アッセイを終了する 4 時間かかります。さらに、ユニバーサル 8 チューブ ストリップは別チップ ベース dPCR15、サーマルサイクラー フラット ブロックを必要とするのとは異なり、従来サーマルサイクラーの使用をできます。また、蓄積された知識と従来の PCR 用試薬は、dPCR システムに適用できます。これは、dPCR のアプリケーションを拡大するために役立つことでしょう。
その dPCR はいくつかの制限に留意。チューブでのチップ形式で dPCR、チップのパーティション番号は比較的低いと他の dPCR プラットフォームでの比較します。チップ デバイスへのそれ以上の改善は、パーティションの数に依存する動的な範囲を拡大する必要があります。普遍的な管の内部のスペースが限られているのでチップ デバイスの画期的なデザインはパーティションの数を増加する必要が。全体 dPCR 手順の自動化は、将来的には大幅にも信頼性の高い結果で、ヒューマン エラーを減らします。その高速・高感度の性質のためチューブでのチップの形式で dPCR は液体生検と環境 DNA のサンプルの数を治療に適用する予定です。

量的な PCR (qPCR) は単一のヌクレオチドの変種 (SNVs) を含めて、人間の遺伝的変異と DNA コピー数変化 (CNVs) を定量化するよく使用されます。QPCR で従来終点 PCR と同じように各管内ポリメラーゼ反応をされるので、すべての熱サイクル後のチューブから増幅信号を取得します。対照的に、dPCR、このレポートでエンドポイント dPCR の意味で、pcr が読み込まれます多くの顕微鏡室パーティションと呼ばれる、DNA テンプレートは、提示または限界希釈法と含む pcr として評価されるすべてのパーティションで欠席完全な PCR 後正または負。それは否定的なパーティションで DNA テンプレートがないことを推定する簡単ですが、わかりにくい DNA テンプレートのコピーの数が正のパーティション内に存在。したがって、肯定的なパーティション内 DNA テンプレートの数は、負のパーティション1からカウントを使用してポアソン分布に基づいて推定されています。dPCR はより高価なと小さいダイナミック レンジは qPCR と比較してが、このメソッドは、絶対数量化できる、感度が高くなるとより精度2。
DPCR の主な用途の 1 つは、次世代シーケンサー (NGS) によって識別されるバリアントの検証です。稀な変形、意味低バリアント分数、特に検証は NGS3で発生するシーケンス エラーのため重要です。一方、サンガー シーケンスと qPCR SNVs と CNVs の検証に便利なツール、dPCR と比較して感度が低い。したがって、dPCR 技術は、遺伝学の稀な変形を扱うの需要です。最近、薬剤耐性などのがんの特性に関連する稀な変形の液体生検によって検出分子診断と治療4話題になっています。DPCR 技術は、液体生検研究に適した表示され、動的範囲に関連して改善とコストを実装する必要がありますが、近い将来には、重要な臨床アプリケーションを有すると期待されます。
市販 dPCR 技術は、液滴とチップ ベースのプラットフォームに大体分類することができます。違いは、どのように DNA テンプレート、パーティション5,6,7です。チューブでのチップの形式で dPCR、PCR の混合物はチップ上のパーティションに毛管作用によって配布されています。8 チューブ ストリップ、どの多くのラボのスタッフは既に精通することが、チップが組み込まれて、1 時間8時、8 個のサンプルを扱うことができます。読書の手順でチップと各パーティションの全体像を検出することにより 96 サンプルを治療するために < 1 時間がかかります。チップ管内形式の dPCR は他の dPCR システムと比較して高スループットがあるので使いやすさと生産性、ユーザーのキーの利点であります。
本報告では、散発的な家族性大腸腺腫症患者におけるAPC遺伝子の体細胞モザイクを代表格として使用、dPCR と NGS の結果が比較されます。このレポートの主な目的は、チューブでのチップ形式で dPCR を使用して単一のヌクレオチド バリアントを明確に定量化することです。我々 は、このレポートは自分の仕事の dPCR プラットフォームを採用することに興味を持って研究に役立つことを願っています。

<table><tbody><tr><td>QIAamp DNAの血のMaxiのキット</td><td>Qiagen</td><td>51194</td>の<td>プロトコル1の前: ゲノムDNA</td></tr><tr><td>の抽出 NanoDrop 1000</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>ND-8000</td><td>プロトコル1の前: 分光光度計</td></tr><tr><td>8ストリップ管</td><td>Agilent Technologies</td><td>401428</td><td>プロトコル1</td></tr><tr><td>ゲノムDNAのサンプル緩衝液</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5366</td><td>プロトコル1: ゲノムDNAスクリーンテープアッセイ</td></tr><tr><td>DNAラ</td><td>ダーAgilent Technologies</td><td>5067-5366</td>の<td>コンポーネント プロトコル1: ゲノムDNAスクリーンテープアッセイ</td></tr><tr><td>MS3基本的な小型シェーカーIKA</td><td></td><td>3617000</td>の<td>コンポーネントプロトコル1:ボルテックスミキサー</td></tr><tr><td>ゲノムDNAスクリーンテープ</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5365</td>プロトコル<td>1:ゲルデバイス</td></tr><tr><td>2200 TapeStationシステム</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2965AA</td><td>プロトコル 1: 電気泳動装置</td></tr><tr><td>TapeStation 解析ソフトウェア</td><td>Agilent Technologies</td><td>Bundled with G2965AA</td><td>プロトコル 1: 解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>DNA オリゴプライマー</td><td>IDT</td><td>カスタムオーダー</td><td>プロトコル 2</td></tr><tr><td>LNA プローブ</td><td>IDT</td><td>カスタムオーダー</td><td>プロトコル 2</td></tr><tr><td>ソフトウェアツール</td><td>IDT</td><td>ウェブサイト:http://biophysics.idtdna.com/</td> <td>プロトコル 2</td></tr><tr><td>dbSNP データベース</td><td>NCBI</td><td>Web サイト: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/</td> <td>プロトコル 2</td></tr><tr><td>TE バッファー</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>12090015</td><td>プロトコル 3</td></tr><tr><td>DNase/RNase-Free 蒸留水</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>10977015</td><td>プロトコル 3 (表 1)</td></tr><tr><td>Clarity デジタル PCR プローブ Mastermix</td><td>JN Medsys</td><td>12013</td><td>プロトコル 3 (表 1): 2xPCR Master Mix #10011</td></tr><tr><td>Clarity Sealing Fluid</td><td>JN Medsys</td><td>12005</td><td>の成分 プロトコル 3: シーリング液 #10011</td></tr><tr><td>Clarity JN</td><td>Solution JN Medsys</td><td>12006</td><td>プロトコル 3 の成分 (表 1): 20xdPCR solution #10011</td></tr><tr><td>Clarity Tube-strip</td><td>JN Medsys</td><td>12007</td> <td>の成分プロトコル3:チップインチューブ #10011</td></tr><tr><td>クラリティサンプルローディングキット</td><td>JN Medsys</td><td>12008</td>のコンポーネント <td>プロトコル3:ローディングプラットフォームとスライダー #10011</td></tr><tr><td>クラリティオートローダーJN</td><td>Medsys</td><td>11002</td><td>のコンポーネント プロトコル3:オートローダー #10001</td></tr><tr><td>クラリティシーリングエンハンサーJN</td><td>Medsys</td><td>11003</td>のコンポーネント <td>プロトコル3:シーリングエンハンサー のコンポーネント#10001</td></tr><tr><td>クラリティ リーダー</td><td>JN Medsys</td><td>11004</td><td>プロトコル 3: Reader #10001</td></tr><tr><td>Life Eco サーマル サイクラー</td><td>バイオア テクノロジー</td><td>TC-96GHbC</td><td>プロトコル 3: サーマル サイクラー</td></tr><tr><td>クラリティ ソフトウェア</td><td>JN Medsys</td><td>#10001 プロトコル 3 にバンドル:</td><td>分析ソフトウェア</td></tr><tr><td>高感度 D1000 スクリーン テープ</td><td>アジレント テクノロジー</td><td>ズ 5067-5584</td><td>プロトコル4:高感度のためのゲルデバイス</td></tr></tbody></table>

チップ チューブ形式を使用して散発的な家族性大腸腺腫症患者の遺伝的変異のデジタル ポリメラーゼ連鎖反応分析

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

人間の遺伝の変化の定量的解析は、腫瘍などの深刻な病状の分子の特性を理解することにとって重要です。デジタル ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) は、DNA コピー数変異体の正確な定量を可能にする、ので薬剤耐性変異などのまれな遺伝的変異を検出するために不可欠なツールになっています。デジタル PCR (dPCR) を用いた分子診断は近い将来臨床実習で利用可能になると予想したがって、人間の遺伝物質と dPCR を効率的に実施する方法は、ホットな話題です。大腸腺腫症大腸菌(APC) 体細胞モザイク チップでチューブ形式で、8 つの dPCR 反応を同時に行うことを可能にする dPCR を使用して検出する方法を紹介します。充填およびチップに反応混合物を密封するときに注意が必要があります。以上、肯定的なパーティションの過小評価を回避する方法を説明します。さらに、特定の増幅を確認するために使用することができますチップ上のパーティションから dPCR 製品を収集するための簡単な手順を提案する.我々 はこの方法のレポート、遺伝子研究でチップ管内メソッドで、dPCR を促進することを願っています。

上記の手順に従って散発的な家族性大腸腺腫症患者におけるAPC遺伝子の体細胞モザイクを見直しました。以前の研究では、 APC c.834 + 2 t &gt; 両親、サンガーを使用してではなく、患者で、C 変異が発見されたシーケンスと NGS9。プライマーおよびプローブの代表の結果で使用されているデザインは表 3のとおりです。ゲノム DNA は、発端者、両親と六つの健康なドナーの血液から抽出されました。6.7 – 7.9 (図 2および表 4) 〜 9 gDNA サンプルの DIN の値。ファムと 16 進数として使用された蛍光染料 C と T の対立遺伝子のそれぞれ。位置のプロットに緑と黄色の斑点、それぞれファム ポジティブに、HEX ポジティブ パーティションを表します (図 3A)。ブルー スポットは、FAM と 16 進数の両方の否定的なパーティションを表します。黒の背景は、反応混合物が追加されましたいないパーティションに対応します。発端者の父親または NTC で C の対立遺伝子のいくつかの肯定的なパーティションが検出された、対立遺伝子が検出されなかった T の後者、肯定的なパーティションで C と T の対立遺伝子の多くの肯定的なパーティションが、発端者で検出されました。C と T の対立遺伝子間の信号分離は二次元 (2 D) 散布図を明確され、六角、FAM の最も肯定的な信号が互いに (図 3B) に排他的。発端者のエンは 13.2%、NGS (12.7%) を使用して決定するに似ています。(表 4)。発端者の両親の健康なドナー VAFs &lt; 0.1% であった。APC c.834 + 2 t の検出限界 &gt; C 変異は合計 gDNA10の 10-11 ng で繰り返し測定の標準偏差 × 3 を使用して 0.3% と推定されました。
APC c.834 + 2 t dPCR のアッセイで増幅サイズ &gt; 123 に予測された C bp。DPCR 製品は、シングル バンドとして増幅されたことを確認するには、dPCR 製品は assayed チップから収集されました。電気泳動を使用して、単一のバンドが検出されたはっきりと製品サイズ (図 4) 予測と一致していた。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58199/58199fig1.jpg"> 図 1: チップでチューブの形式で dPCR の試金のための注意点。(A) このパネルがオートローダ内 8 チューブ ストリップを設定する方法を示します。(B) このパネルには、壊れたチップが表示されます。(C) このパネルは、(i) 直後の読み込みおよび (ii) シールのチップの表面を示しています。(iii) 液体の水たまりが不完全なシールの場合表示されます。(D) このパネルは、交差汚染の場合位置のプロットを示しています。(E) このパネルは、不均一な分布の場合位置のプロットを示しています。水に浸漬管表面に気泡をこのパネル (F) を示していますどのように。(G) このパネルは、チューブ内の空気の泡を示しています。全体図で黒と白の矢印は壊れたチップ部分を示し、気泡、それぞれ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58199/58199fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58199/58199fig2.jpg"> 図 2: 血 gDNA の代表エレクトロフェロ。騒音値が 6.7 と 7.9 血 gDNA のエレクトロフェロはそれぞれ上部と下部のパネルに表示されます。アスタリスクは、低いマーカーを示します。DIN: DNA の整合性の数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58199/58199fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58199/58199fig3.jpg"> 図 3: DPCR を用いたチップ内管形式APC体細胞モザイクの代表の結果。(A) の位置をプロットし、発端者、父なしテンプレート コントロール (NTC) の (B) の散布図を示します。16 進数と FAM 参照とバリアントの遺伝子にそれぞれ対応します。縦線および横線はそれぞれ六角 FAM の輝度しきい値を示します。この図は、Kahyoらから変更されています。10.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58199/58199fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58199/58199fig4.jpg"> 図 4: Assayed のチップから dPCR 製品のコレクションです。収集され、集中された dPCR 製品は、電気泳動を受けるでした。予測対象のサイズは 123 bp。この図は、Kahyoらから変更されています。10. NTC: いいえテンプレート コントロール。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58199/58199fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>濃度 原液の</td>
			<td>ボリューム (μ L)</td>
			<td>最終濃度</td>
			<td>お勧めします 最終濃度</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNase、RNase フリー蒸留水</td>
			<td>-</td>
			<td>1.75</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>PCR マスター ミックス × 2</td>
			<td>-</td>
			<td>7.5</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>主要な対立遺伝子の LNA プローブ</td>
			<td>2 Μ M</td>
			<td>0.5</td>
			<td>66.7 nM</td>
			<td>3.33-100 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>マイナーな対立遺伝子の LNA プローブ</td>
			<td>2 Μ M</td>
			<td>0.5</td>
			<td>66.7 nM</td>
			<td>3.33-100 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>前方のプライマー</td>
			<td>1 Μ M</td>
			<td>0.5</td>
			<td>33.3 nM</td>
			<td>3.33-50.0 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>逆プライマー</td>
			<td>1 Μ M</td>
			<td>0.5</td>
			<td>33.3 nM</td>
			<td>3.33-50.0 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>dPCR ソリューション x 20</td>
			<td>-</td>
			<td>0.75</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>gDNA</td>
			<td>3.33 ng/μ l</td>
			<td>3</td>
			<td>666 pg/μ l</td>
			<td>pg は 20 pg/μ L-2,000/μ L1
</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: dPCR アッセイ用試薬。1予想の精度と感度によって異なります。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>ステップ</td>
			<td>温度</td>
			<td>時間</td>
			<td>サイクル</td>
		</tr>
<tr>
<td>初期変性します。</td>
			<td>95 ° C</td>
			<td>3 +</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>変化させなさい。 アニーリングをおよび拡張</td>
			<td>95 ° C 58 ° C</td>
			<td>50 s 90 s</td>
			<td>42</td>
		</tr>
<tr>
<td>最終的な拡張</td>
			<td>70 ° C</td>
			<td>3 +</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: サーマルサイクラー条件。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>名</td>
			<td>シーケンス1</td>
			<td>Tm値2</td>
		</tr>
<tr>
<td>前方のプライマー</td>
			<td>5'-GGTCAAGGAGTGGGAGAAATC-3 '</td>
			<td>60.8 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>逆プライマー</td>
			<td>5'-TCTTAGAACCATCTTGCTTCATACT-3 '</td>
			<td>59.8 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>T の対立遺伝子の LNA プローブ</td>
			<td>5'-六角-ATTT [CCTGACCA IBFQ 3'</td>
			<td>一致: 62.6 ° C 不一致: 45.3 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>C の対立遺伝子の LNA プローブ</td>
			<td>5'-ファム-TTT [G] CCTGACC-IBFQ-3'</td>
			<td>61.7 ° C の一致: 不一致: 50.5 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>テーブル 3: プライマーとプローブのデザイン。1下線付きと括弧で囲まれた文字は、それぞれ LNA とターゲット バリアントです。2プロトコルの手順 2 に従って計算されます。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NGS3</td>
			<td colspan="4">dPCR4</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">サンプル1</td>
			<td rowspan="2">組織</td>
			<td rowspan="2">DNA (ng) の入力</td>
			<td rowspan="2">DIN2</td>
			<td rowspan="2">エン (%)</td>
			<td rowspan="2">バリアント (コピー)</td>
			<td rowspan="2">参照 (コピー)</td>
			<td colspan="2">エン (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>意味</td>
			<td>RSD</td>
		</tr>
<tr>
<td>NTC</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1.23</td>
			<td>0</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>発端者</td>
			<td>血</td>
			<td>11.3</td>
			<td>7.6</td>
			<td>12.7</td>
			<td>379</td>
			<td>2.48 x 103
</td>
			<td>13.2</td>
			<td>0.0353</td>
		</tr>
<tr>
<td>父</td>
			<td>血</td>
			<td>10.3</td>
			<td>7.7</td>
			<td>0.0167</td>
			<td>1.08</td>
			<td>3.42 × 103
</td>
			<td>0.0341</td>
			<td>0.439</td>
		</tr>
<tr>
<td>母</td>
			<td>血</td>
			<td>10.8</td>
			<td>7.6</td>
			<td>0.0136</td>
			<td>0.956</td>
			<td>3.04 × 103
</td>
			<td>0.0313</td>
			<td>0.637</td>
		</tr>
<tr>
<td>ドナー 1</td>
			<td>血</td>
			<td>11.7</td>
			<td>7.3</td>
			<td>-</td>
			<td>1.64</td>
			<td>3.01 × 103
</td>
			<td>0.0543</td>
			<td>0.414</td>
		</tr>
<tr>
<td>ドナー 2</td>
			<td>血</td>
			<td>10.5</td>
			<td>7.6</td>
			<td>-</td>
			<td>1.06</td>
			<td>2.90 × 103
</td>
			<td>0.0406</td>
			<td>0.539</td>
		</tr>
<tr>
<td>ドナー 3</td>
			<td>血</td>
			<td>17.6</td>
			<td>7.9</td>
			<td>-</td>
			<td>4.24</td>
			<td>5.65 x 103
</td>
			<td>0.0713</td>
			<td>0.783</td>
		</tr>
<tr>
<td>ドナー 4</td>
			<td>血</td>
			<td>12.3</td>
			<td>7.6</td>
			<td>-</td>
			<td>2.38</td>
			<td>4.16 × 103
</td>
			<td>0.0666</td>
			<td>0.557</td>
		</tr>
<tr>
<td>ドナー 5</td>
			<td>血</td>
			<td>19.2</td>
			<td>7</td>
			<td>-</td>
			<td>1.48</td>
			<td>6.79 x 103
</td>
			<td>0.0213</td>
			<td>0.571</td>
		</tr>
<tr>
<td>ドナー-6</td>
			<td>血</td>
			<td>14.4</td>
			<td>6.7</td>
			<td>-</td>
			<td>3.44</td>
			<td>4.67 x 103
</td>
			<td>0.0728</td>
			<td>0.729</td>
		</tr>
</tbody></table>表 4: 結果、dPCR のアッセイのAPC体細胞モザイク。1NTC: いいえテンプレート コントロール;ドナー: 健康なドナー。2DIN: DNA の整合性の数。3岩泉ら9、ハム ゲノムと 2 15057 (2015 年)。4帳票と独立して繰り返し 3 x で実行された実験データは、平均値として表されます。RSD: 相対標準偏差;該当なし: 適用されません。テーブルは、Kahyoらから変更されています。10。

デジタルのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) は、単一のヌクレオチドの亜種と DNA コピー数変異体の高感度検出のための便利なツールです。ここでは、管内チップ形式でデジタル PCR を使用して人間のゲノムの稀な変形を測定する重要な考慮事項を示します。

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

この方法は、モザイク現象の検出やリキッドバイオプシーベースの遺伝子検査など、遺伝子検査分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、低バリアント対立遺伝子画分のハイスループット検出です。この技術の意味は、高感度で発がん性変異を検出することで精密医療に貢献できるため、腫瘍の診断にまで及びます。この実験を開始するには、10 LのDNAサンプルバッファーを8チューブストリップのチューブに加えます。次に、1マイクロリットルのDNAラダーを8チューブストリップの最初のチューブに追加し、残りの各チューブに1マイクロリットルのサンプルゲノムDNAを追加します。マイクロプレートアタッチメントを使用して、8チューブストリップの内容物を1分間ボルテックスして混合します。ストリップ、ピペットチップ、およびゲルデバイスを電気泳動装置に入れます。スタートボタンを押して実行を開始します。分析が完了したら、ディスプレイ上のエレクトロフェログラムをチェックして、DNAサンプルバッファーに含まれる下部マーカーがエレクトロフェログラムに正しく割り当てられていることを確認します。そうでない場合は、ソフトウェアのエレクトロフェログラムモードでマーカーを手動で割り当てます。次に、ソフトウェアの領域モードで、ゲノムDNAのサイズ領域を指定して、DNAの濃度を自動的に計算します。以前に設計したプライマー、プローブ、ゲノムDNAを新しい8チューブストリップに加えると、合計15 L.Pipetteで上下に混合できます。新しい8チューブストリップに組み込まれたチップにローディングプラットフォームを追加し、チューブストリップをオートローダーに配置します。チップとローディングプラットフォームとの間に接触があることを確認してください。次に、プラットフォームにローディングスライダーを配置し、ストッパーを使用してスライダーをローダーから離します。PCR混合物をスライダーの先端付近に15Lピペットで移動させ、ローダーボタンを押してローダーを1分間運転します。実行後、ローダーからチューブストリップを取り外し、シーリングエンハンサーに入れます。スライドリッドと上蓋の端を慎重に押します。シーリングエンハンサーを約2分間実行します。シーリングが不完全で、液体の水たまりで示されている場合は、さらに1分間実行を繰り返します。チューブに230Lのシーリング液を加えます。チューブストリップをサーマルサイクラーにセットし、プロトコルに記載されているようにPCRを実行します。正のパーティションが不均一に分布している場合は、PCの温度または持続時間を調整します。PCR産物の蛍光強度を検出および解析するには、チューブストリップを検出治具に置き、6 mLの蒸留水を加えます。ピペットチップを使用して、目に見える気泡を取り除きます。ジグを検出器にロードします。検出ソフトウェアで、[Fluorescence]、[Experiment]、[Sample NTC]タブの順に選択し、[RUN]ボタンをクリックして実行を開始します。実行が完了したら、位置プロット、ヒストグラム、2-D散布図を確認します。PCR産物を採取するには、チューブからシール液を取り出します。100 LのTEバッファーを追加し、30秒間激しくボルテックスします。卓上遠心分離機でチューブを短時間遠心分離し、テキストプロトコルに記載されているように進めて、PCR産物の収集を完了します。デジタルPCRで作成された位置プロットは、患者と父親サンプルの両方で黄色のHEX蛍光を示し、APC対立遺伝子バリアントTの存在を示していますが、テンプレートコントロールではそうではありません。FAMの緑色蛍光で示されるように、患者のゲノムDNAのみがCバリアントを含んでいます。散布図によってさらに確認されたように、患者と父親の両方がHEXまたはバリアントTに陽性であるのに対し、患者のみがバリアントCの存在を示しています。一方、患者の両親と健康なドナーのVAFは0.1%未満でした 収集および濃縮されたDPCR製品の電気フェレーシスは、予測フラグメントのサイズが患者と両親のDNAの123塩基対であることが確認されています。この手順を試みるときは、ファンフィルターユニットを使用するなどして、ベンチを清潔に保つことを忘れないでください。

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