Name: 結核抗酸菌 marinum感染成人ゼブラフィッシュをモデル化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 学ぼう、Mycobacterium marinumを用いた成人ゼブラフィッシュの結核感染モデル構築法。qPCRで細菌量と宿主免疫応答を同時測定し、適応免疫の役割と病態メカニズムを解明する。

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この作業によって、フィンランド文化財団 (H.L.)、タンペレ結核財団 (H.L.、l.-m. v.、M.M.H.、m. p.)、フィンランドの結核協会 (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L. の基礎をサポートされていますM.M.H.、m. p.)、ねんどろいど Jusélius 財団 (m. p.)、エミール ・ アールト財団 (M.M.H.)、ジェーンと Aatos Erkko 財団 (融点) とフィンランド アカデミー (融点)。その技術支援のレーナ Mäkinen、ハンナ レーナ ・ ピッポ、ジェナ ・ Ilomäki を認めた著者は、彼らのサービスのタンペレ ゼブラフィッシュ研究室を認めます。

すべてのゼブラフィッシュ実験は、動物実験委員会フィンランド (ESAVI/8245/04.10.07/2015) によって承認されています。メソッドは、行為 (497/2013) とフィンランドの科学又は教育のために使用される動物の保護に関する政府令 (564/2013) に従って実行されます。
1. 培養菌 marinumの
注: 結核菌 marinum は、人間の表面的な感染症を引き起こす可能性のある病原体は、のこの菌に作業を開始する前にバイオハザード廃棄物処分の安全と地域のガイドラインをご覧ください。
<ol><li>文化 7 h 10 M. marinumプレートを添加した 10 %oadc (オレイン酸、アルブミン、デキスト ロース、カタラーゼ) 濃縮及び 0.5 %v/v 29 ° C でグリセリンの少なくとも 5 日間。2 週間ごとに冷凍庫から新鮮な細菌を取り、1 週間おきに新しいプレートに転送によってM. marinum文化を維持します。 注: M. marinumは水生生物に感染する天然魚の病原体や細菌とゼブラフィッシュ株式を汚染しないための予防策を講じることが重要です。感染したゼブラフィッシュと細菌で汚染された項目が繁殖施設から分離することにあります。</li>
	<li>滅菌 1 μ L 接種ループを使用して無菌 7 H 9 の 10 mL を含む細胞培養用フラスコにM. marinum </li><li> </li></ol><ol><li><li></li><li></li><li> </li><li> </li></ol><ol><li><li> </li><li> </li><li><li><li> </li><li></li></ol><ol><li><li><li> </li><li><li></ol><ol><li> </li><li><li></li><li> </li><li></li><li> </li><li><li></li><li> </li><li></li><li><li></ol><ol><li> </li><li><li></li><li><li></li><li><li></li><li><li></ol><ol><li> </li><li></li><li></li><li></ol><ol><li> </li><li><li><li><li></ol><ol><li><li><li></li><li></ol><ol><li> </li><li></li><li></li><li> <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58299/58299eq1.jpg"></li></ol>

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ここで実験感染成人ゼブラフィッシュ組織から抽出した DNA から抗酸菌の負荷を測定する qPCR ベースのアプリケーションについて述べる。このアプリケーションは、プライマー 16S 23S rRNA スペーサー シーケンス40を中心に設計に基づいています。魚サンプルの全抗酸菌荷重は、培養抗酸菌の知られている数から抽出され、その 1 つの細菌が任意の時点でそのゲノムの 1 つのコピーを持っていれば DNA から作製した標準曲線を使用して推定されます。M. marinum -qPCR の検出限界は約 100 コロニー形成単位18。伝統的なめっきと比較して方法の明確な利点は、両方のアクティブおよび非分裂の休止状態の細菌を検出できることです。さらに、このアプローチによるゼブラフィッシュ組織から培養皿上の汚染成長の共通の問題が回避されます。ただし、DNA をテンプレートとして使用すると、測定したコピーのいくつかが非常に最近死亡した細菌の DNA 由来することができることが可能です。核酸ベースのプロトコルの重要な利点は、両方 DNA と...

ゼブラフィッシュ (動脈分布) は生物医学研究で広く使用されている動物モデル、一般的な脊椎動物の生物学のための受け入れられたモデルです。ゼブラフィッシュひと疾患モデル研究の多くの分野で採用され、感染症や免疫学的いくつか細菌3のウイルス感染4癌1から心疾患2までの障害,5します。 さらに、ゼブラフィッシュ胚の子宮 ex開発したゼブラフィッシュ人気モデル発生生物学6および毒物学7,8。
感染生物学分野を含む研究の多くの分野で光学的に透明なゼブラフィッシュ幼虫はよく使用されます。最初の免疫細胞は、原始マクロファージが検出された9と 24 h ポスト受精 (hpf) 内で表示されます。好中球は、約 33 hpf10を表示する次の免疫細胞です。ゼブラフィッシュ幼虫は感染症の初期段階と適応免疫細胞11の不在で自然免疫の役割を研究するため可能。ただし、アダルト ゼブラフィッシュ機能的適応免疫システムは感染実験のため複雑さの追加レイヤーを提供します。T 細胞は、3 日後に受精12、および B 細胞の機能性抗体を生成することが 4 週間ポスト受精13周り検出できます。大人のゼブラフィッシュは哺乳類の自然免疫と適応免疫のすべての主要なカウンター パートです。魚の immune systems と人間の主な違いは、リンパ組織の解剖学のように同様の抗体アイソタイプで発見されます。ゼブラフィッシュの人間が 5153 つしか抗体クラス14があります。骨髄とリンパ節のない場合は、魚の第一次リンパ器官は脾臓と胸腺16腎臓、腎臓と腸の二次リンパ器官17としています。自然免疫と適応セルその完全免疫の武器とのこれらの相違にもかかわらず大人のゼブラフィッシュは宿主-病原体相互作用の研究のための非常に適用可能な簡単に使用できる、非哺乳類モデルです。
ゼブラフィッシュは、結核18,19,20,21,22を勉強する実行可能なモデルとして確立されている最近。結核は、結核菌によって引き起こされる空気中の病気です。世界保健機関によると、結核は 2016 年に1.7の百万の死を引き起こしたし、単一の病原体世界23死の主要な原因は。マウス24,25、ウサギ26ヒト以外の霊長類27が最も有名な動物モデル各面しますが、結核研究の制限。人間の病気が最も酷似の結核感染症非ひと霊長類モデルがこのモデルを使用して、重大な倫理的配慮のため限定。他の動物モデルは、結核病の病理に影響を与えるの宿主特異性によって妨げられます。おそらく結核をモデリングで最大の問題は人間の病気で感染や病気の結果の広いスペクトル: 結核は潜在的なアクティブ、再アクティブ化された感染症28 への耐性を滅菌に至る非常に異質病気、ハードを再現し、模型実験できます。
結核菌 marinumは、85% のアミノ酸のアイデンティティの29〜 3,000 相同タンパク質と結核の近親です。M. marinumは、ゼブラフィッシュ肉芽腫、その内臓19、30での結核の特徴を作り出す自然感染します。結核の研究で使用される他の動物モデルとは異なりゼブラフィッシュは多くの子孫を作り出す、限られたスペースのみ必要で、重要なは、後発の脊椎結核モデルでは neurophysiologically。M. marinum感染はひと結核19,の病気の結果のスペクトルを密接に模倣した大人のゼブラフィッシュの潜伏感染、アクティブな病や抗酸菌症のも殺菌を引き起こすまた、31,32しますここでは、 M. marinumを腹腔内に注入し、抗酸菌の負荷とゼブラフィッシュから免疫を測定する定量的 PCR を使用して大人のゼブラフィッシュの実験的結核症モデル法について述べる。組織サンプル。

<table><tbody><tr><td>Mycobacterium marinum</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 927</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrock 7H10 agar</td><td>BD, Thermo Fisher Scientific</td><td>11799042</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrock OADC enrichment</td><td>BD, Thermo Fisher Scientific</td><td>11718173</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrock 7H9 medium</td><td>BD, Thermo Fisher Scientific</td><td>11753473</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrock ADC Enrichment</td><td>BD, Thermo Fisher Scientific</td><td>11718173</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>GENESYS20 分光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水錠 (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>27 G 針</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710004020</td><td></td></tr><tr><td>1 mL シリンジ</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4010.200V0</td><td></td></tr><tr><td>Omnican 100 30 G インスリン針</td><td>ブラウン</td><td>9151133</td><td></td></tr><tr><td>3-アミノ安息香酸エチルエステル (pH 7.0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 均質化チューブ</td><td>Qiagen</td><td>13119-1000</td><td></td></tr><tr><td>2.8 mm セラミックビーズ</td><td>Qiagen</td><td>13114-325</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、ETAX Aa</td><td>Altia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-プロパノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>278475</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>VWR</td><td>22711.290</td><td></td></tr><tr><td>グアニジン チオシアン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9277</td><td>FW 118.2 g/mol</td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>ナトリウムSigma-Aldrich</td><td>1613859</td><td>FW 294.1 g/mol</td></tr><tr><td>Tris (遊離塩基)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TRIS-RO</td><td>FW 121.14 g/mol</td></tr><tr><td>TRI 試薬</td><td>分子研究センター</td><td>TR118</td><td>グアニジンチオシアン酸フェノール溶液</td></tr><tr><td>PowerLyzer24 ホモジナイザー</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator m08</td><td>Finnsonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermoフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SENSIFAST No-ROX SYBR、グリーンマスターミックス</td><td>バイオライン</td><td>BIO-98005</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 96 ウェルプレート</td><td>BioRad</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>光学透明フィルム</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>C1000 サーマルサイクラー、CFX96 リアルタイムシステム</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase AWAY</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10666421</td><td>除染試薬 RNaseを除去</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>逆転写マスターミックス</td><td>Fluidigm</td><td>100-6298</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast Eva グリーンマスターミックス</td><td>BioRad</td><td>172-5211</td><td></td></tr></tbody></table>

結核抗酸菌 marinum感染成人ゼブラフィッシュをモデル化

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

結核は現在毎年 170 万の死と 1040 万感染症を引き起こして最悪人間の病原体であります。この細菌への露出は、滅菌感染から積極的に進んで致命的な病気に至るまで人間の広い疾患のスペクトルを発生します。最も一般的な形式は、無症候性ですが、劇症疾患に再アクティブ化する可能性がある潜在的な結核です。アダルト ゼブラフィッシュとその自然の病原体菌 marinum結核の幅広い疾患のスペクトルを研究に該当するモデルであると証明した最近。重要なは、自発的な待機時間再活性化と抗酸菌感染症の適応の免疫反応はこのモデルで学ぶことができます。この記事で大人ゼブラフィッシュ、内臓抗酸菌荷重および量的な PCR によるホストの免疫反応の測定のための核酸の抽出のためのコレクションの実験的感染症法について述べる。社内の開発、 M. marinum -特定の qPCR の試金は非分裂、休止状態または最近死んだ抗酸菌から DNA が検出されるも、伝統的なめっきより敏感。DNA と RNA の両方は同じ個体から抽出した、病気の状態とホストと病原体の遺伝子発現との関係を研究することが可能です。結核成人ゼブラフィッシュ モデルはこうしてホスト病原体の相互作用を研究する、応用性・非哺乳類体内システムとしてそれ自身を示します。

天然魚の病原体菌 marinumゼブラフィッシュの臓器に感染し、組織学的肉芽腫19全身性感染症を生成します。大人のゼブラフィッシュは、腹腔内注入によるm. marinumに感染しています。DNA や RNA を抽出、およびテンプレートとして DNA を使用して量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) による抗酸菌の負荷を測定します。法の概要を図 1に示します。
抗酸菌感染魚の使用の最初の数は、感染症の結果の重要な決定要因です。M. marinum (~ 2,000 CFU) の高い伝染の線量は、抗酸菌の負荷は、細菌負荷を平均約 500 万細菌 (図 2 a) 最終的に魚を殺すに到達するまでを増やし続ける進歩的な病気につながります。低...

その自然の病原体菌 marinumを使用して大人のゼブラフィッシュ モデルひと結核にプロトコルを紹介します。抽出された DNA と感染したゼブラフィッシュの内臓からの RNA は、抗酸菌の合計負荷魚と qPCR で宿主の免疫反応を明らかにする使用できます。

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

この方法は、適応免疫応答の役割やこの多因子性疾患の病因など、結核の分野における重要な質問に答える助けとなる。この核酸塩基法の主な利点は、細菌負荷と遺伝子発現レベルの両方を同じ個体から測定できることである。この手順を開始するには、テキストプロトコルで概説されているように、7H10プレート上の培養M.marinum。ADC濃縮を含む7H9培地の10ミリリットルを転写し、ポリソルベート80、およびグリセロールを細胞培養フラスコに移す。次に、滅菌1マイクロリットル接種ループを使用して、M.marinum細菌塊のループをフラスコに無菌で伝達する。キャップを緩めたままにするか、OD600が約0.7に達するまで3〜4日間揺れることなく、暗闇の中で摂氏29度で十分なガス交換と培養を可能にするためにフィルターキャップを使用してください。テキストに概説されているように、細菌を希釈し、培養し続けます。感染のための細菌溶液の調製を開始するには、培養物の1ミリリットルを新鮮なチューブに移す。遠心分離機を10,000gで3分間行う。上清を取り除き、滅菌PBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁します。滅菌PBSをトレーサーとしてフェノールレッドのミリリットル当たり0.3ミリグラムで使用し、懸濁液を希釈して所望の細菌濃度に達する。この後、1ミリリットルの注射器を使用して、27ゲージの針を通してサスペンションを3回ゆっくりと引っ張ります。各アリコートに対して使用する直前にこの手順を実行します。まず、希釈された細菌溶液の5マイクロリットルの液滴をパラフィンフィルムの一部にピペットする。その後、液滴を30ゲージのインスリン針に引き込みます。この実験には5〜8ヶ月の魚を使用し、1つは野生のタイプの魚であり、もう1つはボロ突然変異魚です。湿った泡立ったプラスチックの破片のスリットにこれらの魚の腹側を上に置きます。45度の角度で骨盤のフィンの間にインスリン針を注入します。針を上向きに開いたままにして、開口部全体が腹腔内にあることを確認します。次いで、細菌溶液をゆっくりと注入する。この後、慎重に針を取り出し、すぐに新鮮なタンクの水で満たされた回収槽に魚を転送します。7H10プレートで15分ごとに使用されている細菌アリコートからサンプルを採取します。これらのサンプルを摂氏29度で5日間インキュベートし、感染量を確認します。魚の幸福を定期的に確認し、3アミノ安息香酸エチルエステルの0.02%以上で水中でインキュベートすることで、感染症状を伴う魚を安楽死させることを確認してください。魚を安楽死させた後、枝柱線に後方にピンを挿入します。尾に2番目のピンを挿入して、魚をプラットフォームに取り付けます。メスを使用して、腹腔全体を開きます。その後、小さなスプーンと鋭いピンセットを使用して、心臓から始まり、背骨に沿って

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

透明なゼブラフィッシュの胚は、次のような視覚化するための有用なモデルのホストと自然免疫細胞と細胞内細菌性病原体との間の機能的研究の相互作用を、証明している...

細胞内細菌性病原体を持つゼブラフィッシュ胚の感染

出典: Niu, L. ほか。 ゼブラフィッシュ胚におけるマイコバクテリア感染時のマクロファージ溶解細胞死の生体内顕微鏡による可視化。 J. Vis. Exp.(2019年)このビデオは、 マイコバクテリウム・マリナム...

ゼブラフィッシュ胚におけるマイコバクテリア感染時のマクロファージ細胞死のライブ画像

出典: Bernut, A.ら。ゼブラフィッシュ胚における マイコバクテリア・アブスペル の病因解析および解析。 J. Vis. Exp. (2015年)このビデオでは、蛍光マクロファージを発現し、蛍光性 のマイコバクテリウム・ブスペサス...

マイコバクテリウム・ブスペサスに感染したゼブラフィッシュ胚における宿主-病原体相互作用のライブ画像化

出典:Luukinen, H. ほか。Mycobacterium marinum感染の成体ゼブラフィッシュにおける結核のモデル化。 J. Vis.

ゼブラフィッシュモデルを用いたマイコバクテリア感染における宿主免疫の役割の評価

出典:Flores, E. ほか。ゼブラフィッシュ幼虫の食中毒の媒介として原生動物のパリミキウム・カウダタムを利用すること。J. Vis.

食中毒菌を用いたゼブラフィッシュ幼虫の腸内感染モデル化

このビデオの記事は正常に全動物脊椎動物生物を用いた化合物の試験と創薬のための新しい強力なツールを提供するゼブラフィッシュ胚を大量に感染し、分析するために確立されたハイスループット·パイプラインについて説明します。...

設立し、研究するために、高スループットの設定の最適化<em&gt;表皮ブドウ球菌</em&gt;と<em&gt;マイコバクテリウムmarinumの</em創薬のためのモデルとして&gt;感染症

粘膜レベルでの病原体と免疫防御の生体内時空間相互作用は、既存の脊椎動物宿主では容易には画像化されません。ここで紹介する方法は、ゼブラフィッシュの幼魚の水泳膀胱を感染部位として使用して、生きた脊椎動物の粘膜カンジダ症を研究するための汎用性の高いプラットフォームを示しています。...

浮袋注入による幼虫ゼブラフィッシュにおける粘膜カンジダ症のモデル化

光学的に透明なゼブラフィッシュの胚は、病原性微生物と自然免疫細胞との間の相互作用をリアルタイムで研究し、視覚化するために広く使用されています。Mycobacterium...

イメージング病因とのコーディングを解読し、<em&gt;マイコバクテリウム膿瘍</em&gt;ゼブラフィッシュ胚で

DNA ワクチンと大人ゼブラフィッシュ (動脈分布)...

大人のゼブラフィッシュの DNA 基づかせていたワクチンの前臨床スクリーニングのため予防接種

このプロトコルは、マイコバクテリウム・マリナム感染時の胚性ゼブラフィッシュにおけるマクロファージ挙動および死を可視化する技術を記述する。細菌の調製、胚の感染、およびバイタル内顕微鏡検査のステップが含まれています。この技術は、感染または無菌炎症を伴う同様のシナリオにおける細胞行動および死亡の観察に適用され得る。...

バイタル顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚におけるマイコバクテリア感染時のマクロファージ溶解細胞死の可視化

現在、慢性細菌感染症に対する薬物スクリーニングに適した in vivo モデルが不足しています。ここでは、ゼブラフィッシュの幼生に持続的な感染を引き起こす ための緑膿菌...

負傷したゼブラフィッシュ幼生における持続性 緑膿菌 感染のモデル化

学ぼう、Mycobacterium marinumを用いた成人ゼブラフィッシュの結核感染モデル構築法。qPCRで細菌量と宿主免疫応答を同時測定し、適応免疫の役割と病態メカニズムを解明する。

結核抗酸菌 marinum感染成人ゼブラフィッシュをモデル化

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