Name: 分離と全体ブタ膵臓の Decellularization (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 学ぶ ブタ膵臓の分離と脱細胞化手法。血管結紮と低温洗浄剤灌流により複雑な臓器を損傷なく採取し、組織工学用スキャフォールドを作成する技術を解説。

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本研究は S.S.H. にアルフ LUA スウェーデン政府からの助成金によって融資されました。

ブタ膵臓とここで紹介する decellularization プロシージャの郭清ヨーテボリ大学の倫理的なガイドラインに従ってください。
1. Decellularization セットアップの準備
<ol><li>3 × 5 mm のシリコン チューブを使用して、peristalic ポンプ洗剤入口コンテナー シリーズの接続商工会議所、器官で膵臓にを介して脱ガス装置 (図 1参照)。男性のルアーをオルガン室管内の自由端に接続します。</li>
	<li>洗剤アウトレット コンテナーを介して灌流の洗剤を収集する蠕動性ポンプ別 3 × 5 mm のシリコン チューブを使用して、接続機関室。</li>
	<li>2 ml ラベル ピペットを管洗剤入口コンテナーと洗剤コンセント cointainer の空いている端点に接続します。</li>
	<li>4 ° C で全体の設定を維持します。</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig1v2.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> 図 1: 潅流セッティングの準備です。蠕動性ポンプ、脱ガス装置、機関室洗剤入口コンテナーをシリーズに接続する設定に示すように 3 × 5 mm のシリコン チューブを使用して。黒い矢印は、機関室に洗剤入口コンテナーからフローの方向を示します。洗剤のアウトレットの別の 3 × 5 mm のシリコン チューブを使用し、臓器商工会議所経由で蠕動性ポンプに接続洗剤アウトレット コンテナー。赤い矢印は、洗剤アウトレット コンテナーに機関室からの流れの方向を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
2. Decellularization 溶液の調製
<ol><li>解決策 1 (リン酸緩衝生理食塩水 [PBS]): 純水 1 L に塩化ナトリウム (137 の mM) の 8 g、塩化カリウム (2.7 mM) の 0.2 g、リン酸ナトリウム (10 mM) の 1.44 g と 0.24 g リン酸カリウム (1.8 mM) を追加し、溶けるまでかき混ぜます。塩酸 (HCl) 7.4 に pH を調整します。合計では、このソリューションの 3.2 L は必要です。</li>
	<li>解決策 2 (PBS + ヘパリン): 1 L ソリューション 1 にヘパリン (17 [IU] の国際単位/mL) の 3.4 mL を追加。このソリューションの新鮮なを準備し、寒くなるまで氷の上にそれを維持します。合計では、このソリューションの 1.2 L が必要です。</li>
	<li>解決策 3 (純水 + アジ化ナトリウム ナトリウム エチレンジアミン四酢酸 [EDTA]): 1 L の純水には 1.86 g (5 mM) EDTA とアジ化ナトリウム (0.02%) 200 mg を追加。塩が溶けるまでかき混ぜます。使用前に 4 ° C への解決策を冷やして下さい。合計では、このソリューションの 22 L は必要です。</li>
	<li>ソリューション (PBS + アジ化ナトリウム EDTA) 4: 1 L ソリューション 1 に追加のアジ化ナトリウム (0.02%) および (5 mM) EDTA の 1.86 g 200 mg。塩が溶けるまでかき混ぜます。使用前に 4 ° C への解決策を冷やして下さい。合計では、このソリューションの 1 L が必要です。</li>
	<li>解決策 (純水 + アジ化ナトリウム) 5: 1 L の純水に追加 (0.02%) アジ化ナトリウム 200 mg。塩が溶けるまでかき混ぜます。使用前に 4 ° C への解決策を冷やして下さい。合計では、このソリューションの 260 L が必要です。 注: EDTA, SDC を沈殿物を形作るし、すぐ洗濯 SDC 治療前後のそれに使用されるので、ソリューション 5 から除かれました。</li>
	<li>解決策 (SDC + トリトン X-100) 6: 純水の 940 Ml (4%) の 40 g を追加します。SDC (6%) 60 mLトリトン X-100, (0.02%) アジの 200 mg, (0.4 mM) 特異フッ化物 (PMSF) 69.6 mg。溶解するまで攪拌します。使用前に 4 ° C への解決策を冷やして下さい。PMSF を使用する前に追加します。合計では、このソリューションの 9.6 L が必要です。</li>
	<li>解決策 7 (DNase): DNase の 10,000 Kunitz の追加ユニット-CaCl2と MgCl2を含む (40 Kunitz ユニット/mL) ダルベッコ PBS の 250 mL の私。新鮮な準備し、すぐに使用します。使用する前に 37 ° C に解決を暖めます。</li>
	<li>解決策 8 (PBS + ナトリウム アジ化): 1 L ソリューション 1 に追加 (0.02%) アジ化ナトリウム 200 mg。塩が溶けるまでかき混ぜます。使用前に 4 ° C への解決策を冷やして下さい。合計では、このソリューションの 1 L が必要です。</li>
</ol>3 ブタの膵臓の解剖
注: この研究では、ブタの膵臓切除したから安楽死、ヘパリン (400 IU/kg) 雌豚農場から 45 kg.
<ol><li>仰臥位で解剖テーブルに豚を配置します。</li>
	<li>正中切開 xiphoidal プロセスから恥骨の骨 (約 40 cm) にメス、腹部臓器のすべてを公開することを確認します。</li>
	<li>脾を探します、十二指腸、および接続耳たぶ。</li>
	<li>大十二指腸乳頭のレベルを見つけ、2 つの独立した縫合糸を使用してそのサイトから口頭で十二指腸を結紮します。</li>
	<li>2 つの独立した縫合糸で下の食道を縛るし、胃を取り出してハサミで合字の間をカットします。</li>
	<li>大腸小腸に到達するから結合組織を分離します。</li>
	<li>膵脾葉にアタッチするコロンの結合組織を分離します。</li>
	<li>小腸から動脈を縛ることの後、コロンを削除します。</li>
	<li>下腸間膜静脈や下腸間膜動脈の木を見つけるし、膵臓の尾側の表示場所 1 つの縫合糸で縛る。</li>
	<li>脾動脈を結紮し、一緒に 1 つの縫合糸、門で、脾臓に近い静脈遠位脾を削除するハサミでカットします。</li>
	<li>従い、十二指腸十二指腸と接続の葉が消去され、2 つの独立した縫合糸端で十二指腸を縛る。</li>
	<li>門脈の解剖、肝臓からの血液流出を防ぐ、合字に近位にカットする 1 つの縫合糸で縛る。門脈は、decellularization 中にコンセントとして機能します。</li>
	<li>解剖し、胆管および 2 つの縫合糸で肝動脈を結紮します。縫合糸に遠位カットします。</li>
	<li>腎静脈下大動脈を見つけるそして膵領域に達するまで、筋肉や結合組織から頭蓋の方向にそれを解剖します。</li>
	<li>優しく膵臓を裏返すし、SMA と CT をそのまま維持する大動脈の解剖 CT よりも優れてとハサミで SMA に劣る大動脈をカットします。</li>
	<li>残りのはさみで周囲の組織を切り取って膵臓を取り出します。</li>
	<li>4 mm 切開カニューレに接続して 50 mL の注射器を使用して、それは全体の器官を perfuses まで、または全体の器官は寒くなるソリューション 2 大動脈を通じて器官のフラッシュします。</li>
</ol>4. Decellularization のブタの膵臓の準備
<ol><li>4 ° c またはプロセス全体で氷の上は、膵臓を維持します。</li>
	<li>はさみを使って十二指腸の縫合糸をカット、純水 25 mL ピペットを使用しての 50-150 mL をフラッシュすることによって食糧のそれをきれいにし再び縫合糸とそれを縛る。</li>
	<li>大動脈の一端と漏れを防ぐために縫合糸で SMA と CT のほかすべての枝を縛る。</li>
	<li>大動脈のもう一方の端から 4 mm 切開のカニューレを挿入し、縫合糸で結紮します。</li>
	<li>Decellularization 設定を使用 20 mL/分で 1 時間のソリューション 3 膵灌流します。 注: は、気泡が入らない膵臓そのソリューション 3 ポンプのチューブを自動設定します。器官のすべての側面からの漏れを捜し、縫合糸で門脈内を除くすべての開いている血管枝を縛る。</li>
	<li>ソリューション 4-20 ° C で膵臓を凍結、decellularization の開始まで。</li>
</ol>5 ブタの膵臓の decellularization
<ol><li>4 ° C で膵臓を解凍します。</li>
	<li>まで洗剤インレット チューブで気泡は見てない 20 mL/分でソリューション 3 decellularization 設定で蠕動ポンプを実行します。</li>
	<li>Decellularization コンテナーに膵臓を配置し、膵臓の大動脈に洗剤インレット チューブを接続します。4 ° C で 20 mL/分で一晩ソリューション 3 による血液灌流による臓器を洗う</li>
	<li>オルガンの部屋に残された解決策を注ぐ。</li>
	<li>ソリューション 5 ソリューション 3 に置き換えるし、20 mL/分 4 ° C で 30 分間膵臓を灌流機関室でソリューションを注ぐ。</li>
	<li>解決策 6 を追加し、20 mL/分 4 ° C で 8 h の膵臓を灌流機関室でソリューションを注ぐ。</li>
	<li>20 mL/分 4 ° C で 96 h のソリューション 5 による血液灌流による臓器を洗う機関室でソリューションを注ぐ。</li>
	<li>膵臓 DNase 処理に備える CaCl2と 37 ° C で 30 分間 MgCl2を含むダルベッコ PBS の 500 mL を再循環によって機関室でソリューションを注ぐ。</li>
	<li>解決策 7 の 250 mL を追加し、37 ° C で 20 mL/分 4 h の膵臓を灌流機関室でソリューションを注ぐ。</li>
	<li>20 mL/分 4 ° C で 120 h のソリューション 5 による血液灌流による臓器を洗う</li>
	<li>短い期間のための 4 ° c または-20 ° c 長時間ソリューション 8 に器官を格納します。</li>
</ol>6. Decellularization の検証
<ol><li>はさみを使用すると、膵臓のすべての葉から 3-10 mm 生検をカットし、室温で 48 時間ホルムアルデヒドでそれらを修正します。</li>
	<li>15 分間超純水で部分を洗浄し、次の標準的なプロトコル、ティッシュ プロセッサで処理してパラフィンに埋め込みます。</li>
	<li>ミクロトームを使用して 5 μ m のセクションをカットし、マイヤーのヘマトキシリンと 0.2% アルコール エオシン (HE) 次の標準プロトコルによって、それらを染色します。</li>
	<li>核の消失を確認する顕微鏡の下でスライドを表示します。 注: 同じ方法で処理された新鮮な組織から作品はコントロールとして核の有無の確認に使用できます。</li>
</ol>

<ol><li>Federation, I. D. IDF Diabetes Atlas. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.diabetesatlas.org">http://www.diabetesatlas.org</a> (2016).</li>
<li>Yang, H. K., Yoon, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+encapsulated+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+and+its+Complications%22%5BJournal%5D)">Current status of encapsulated islet transplantation.</a> Journal of Diabetes and its Complications. 29 (5), 737-743 (2015).</li>
<li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-organ+tissue+engineering%3A+Decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Whole-organ tissue engineering: Decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+metazoan+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The evolution of metazoan extracellular matrix.</a> Journal of Cell Biology. 196 (6), 671-679 (2012).</li>
<li>Scarritt, M. E., Pashos, N. C., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+cellularization+strategies+for+tissue+engineering+of+whole+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A review of cellularization strategies for tissue engineering of whole organs.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnol. 3, 43(2015).</li>
<li>Goh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+pancreas+as+a+natural+3D+scaffold+for+pancreatic+tissue+and+whole+organ+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized pancreas as a natural 3D scaffold for pancreatic tissue and whole organ engineering.</a> Biomaterials. 34 (28), 6760-6772 (2013).</li>
<li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Culture+of+MIN-6+Cells+on+Decellularized+Pancreatic+Scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+and+In+Vivo+Study.+Biomed+Research+International%22%5BJournal%5D)">3D Culture of MIN-6 Cells on Decellularized Pancreatic Scaffold.</a> In Vitro and In Vivo Study. Biomed Research International. 2015, 432645(2015).</li>
<li>Peloso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Pancreas+as+a+Source+of+Protolerogenic+Extracellular+Matrix+Scaffold+for+a+New-generation+Bioartificial+Endocrine+Pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">The Human Pancreas as a Source of Protolerogenic Extracellular Matrix Scaffold for a New-generation Bioartificial Endocrine Pancreas.</a> Annals of Surgery. 264 (1), 169-179 (2016).</li>
<li>Mirmalek-Sani, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+pancreas+extracellular+matrix+as+a+platform+for+endocrine+pancreas+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Porcine pancreas extracellular matrix as a platform for endocrine pancreas bioengineering.</a> Biomaterials. 34 (22), 5488-5495 (2013).</li>
<li>Taylor, M. J., Baicu, S., Greene, E., Vazquez, A., Brassil, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+from+juvenile+porcine+pancreas+after+24-h+hypothermic+machine+perfusion+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Islet isolation from juvenile porcine pancreas after 24-h hypothermic machine perfusion preservation.</a> Cell Transplantation. 19 (5), 613-628 (2010).</li>
<li>Elebring, E., Kuna, V. K., Kvarnstrom, N., Sumitran-Holgersson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-perfusion+decellularization+of+whole-organ+porcine+pancreas+supports+human+fetal+pancreatic+cell+attachment+and+expression+of+endocrine+and+exocrine+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cold-perfusion decellularization of whole-organ porcine pancreas supports human fetal pancreatic cell attachment and expression of endocrine and exocrine markers.</a> Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417738145(2017).</li>
<li>Gilpin, A., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+Strategies+for+Regenerative+Medicine%3A+From+Processing+Techniques+to+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Decellularization Strategies for Regenerative Medicine: From Processing Techniques to Applications.</a> Biomed Research International. 2017, 9831534(2017).</li>
<li>James, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+protease+inhibitor+phenylmethylsulfonyl+fluoride+in+buffers%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride in buffers.</a> Analytical Biochemistry. 86 (2), 574-579 (1978).</li>
<li>Lichstein, H. C., Soule, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+the+Effect+of+Sodium+Azide+on+Microbic+Growth+and+Respiration%3A+I.+The+Action+of+Sodium+Azide+on+Microbic+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Studies of the Effect of Sodium Azide on Microbic Growth and Respiration: I. The Action of Sodium Azide on Microbic Growth.</a> Journal of Bacteriology. 47 (3), 221-230 (1944).</li>
</ol>

S.S.H. は、Verigraft、血管組織工学の技術のライセンスを取得している会社の株式を保持します。他の作家が何を開示するあります。

4 ° c、SDC とトリトン X-100 の灌流を用いた提案方式は、全体ブタ膵臓を正常に decellularize されます。この手法では、課題は器官を灌流するために実質の供給の容器と試料の他の血管の枝の結紮を損なうことがなく、すべての 3 つの葉を含むそのまま膵臓の解剖ない漏れ。ブタの膵臓はひと膵臓と比較して異なる解剖学です。それは葉から成り、部分的囲ま小腸と密接な接触にとどまります。私たちは接続する腸と膵臓からいくつかの小血管、膵臓と十二指腸を解剖しました。最適化スタディの間にこれらの血管の鈍的切断は漏れとソリューションの不完全な灌流を示しています。
大動脈は、腹腔と優れた上腸間膜動脈を通って膵臓に接続するので、我々 は 1 つカニューレと、したがって、1 つの入口だけで灌流をできるだけ単純化する入口として大動脈を選んだ。経験から、大動脈 CT 上と下の SMA の結紮により郭清の時間を短縮、2 隻の船のいずれかの損傷のリスクを低減します。ヘパリン豚だけでなく我々 にも冷たいヘパリンを介して灌流剥離後すぐに大動脈は役立ちます臓器全体ソリューションの灌流を達成するために気づいた。これが血管の血栓の形成を防ぐことによって発生しますが推測された.郭清後純水と膵臓の初期の灌流は赤血球を溶解、器官で、血栓の形成を防ぐ血液の残骸を削除します。この期間は、血流を背景の上に簡単に気づくことができるよう、静脈と動脈の任意の unligated の小さな枝を見つけるため使用もできます。
これは膵臓の外分泌細胞から膵外分泌酵素の作用を妨げること、低温 (4 ° C) で全体の decellularization プロシージャを保つために選びました。膵外分泌酵素、抑制されないときは、彼らは、細胞膜やタンパク質12を消化すること、細胞と、ECM に悪影響を引き起こす可能性が。凍結・融解細胞をバーストすることができます効果的に、我々 含まれてフリーズ/フリーズ解除手順最初洗剤4,13の灌流前であってもに、。解凍後初期洗浄セルのバーストの残りが削除されます。我々 が使用される洗剤の治療は、SDC とトリトン X-100 高灌流の速度、異常に高い濃度でのミックスです。ECM を損傷外分泌腺の細胞を除去することによって高速な decellularization を達成するためにこの手法を選びました。我々 はより少ない時間が良い ECM 成分保持、ECM と対話する膵酵素の利用できるハードと高速のプロトコルが膵臓の decellularization のために有益されて推測します。ECM の部品を維持するためにもに追加しましたセリン プロテアーゼ阻害剤 (PMSF) 洗剤ソリューションには外分泌細胞14からリリースされた酵素の活性化を阻害すると。アジ化ナトリウムは、それ細菌汚染15のチャンスを阻害する静菌剤として機能するので、すべての decellularization ソリューションに追加されます。
膵臓は脱 ECM 構造と ECM タンパク質コラーゲンとエラスチンの保全を示したこのプロトコルに続きます。ただし、decellularized の膵臓におけるグリコサミノグリカンの大幅な損失がつきました。膵臓はまた 14 日12recellularized 個のひと胎児膵幹細胞の添付ファイルと外分泌と内分泌マーカーの発現のための約束を示したこのファッションで脱。ただし、そのままで機能的な膵臓を生成する正しい細胞源、細胞の種類、細胞播種戦略とバイオリアクター文化の評価にさらなる研究が必要です。

糖尿病は、血液中のブドウ糖のレベルを増加の存在によって特徴付けられます。それはほとんどの国1の主要な公衆衛生課題として認識されます。血糖値の高レベル血管、目、心臓、腎臓、および虚血肢への損傷を引き起こし、神経系に影響を与えます。治療の従来の方法には、ライフ スタイルの変化、薬、外因性インスリンの注射が含まれます。いくつかのケースで、病気の治療法はともかく、利用可能な治療は、高血糖の結果、治療レベルでインスリンを維持するために失敗します。小島や膵臓全体の移植は、病気を回避できますそれは一般的行われないリスクと免疫抑制とカプセル化の2から困難さのため、適切なドナー臓器の不足のため。
組織工学および再生医学の分野で現在の改善は、これらの問題に対するソリューションを提供するための能力を有しています。Decellularization を用いた、人間または動物のドナー由来の細胞は、成長因子、細胞外マトリックス (ECM) 蛋白質に落とせるし、シグナル分子は足場で保持されます。受信者の非免疫原性幹細胞3,4recellularization 後器官の機能を復元するのには、免疫抑制療法を必要とせず、このような足場を移植可能性のあることができます。同種または異種ソースから組織設計の臓器は、主要な細胞外マトリックス蛋白質種の間で維持され、移植5後拒否されない場合があります、臨床移植で使用できます。
Decellularization は、物理的な力、化学洗剤、ティッシュまたは器官から細胞や核物質を削除する生理学的な設定での酵素の最適な使用を含む検索が上手くいった方法です。Recellularization は、無細胞性臓器に細胞を播種の手順です。それは、温度、圧力、およびガス6のような生理学的許容条件で臓器の培養細胞、細胞播種、最適の戦略、およびバイオリアクター システムの多数を必要とする、知的厳しい手順です。
膵臓はその外分泌と内分泌の容量のため組織工学のための挑戦的な組織を見なすことができます。一方、内分泌の部分は、インスリンなどのホルモンを分泌する外分泌組織はいくつかの消化酵素を分泌します。酵素 (トリプシン、デオキシリボヌクレアーゼ [DNase]) を使用して既に報告されてマウス7、8、人間9、および豚10からそのまま膵臓の decellularization (トリトン X-100) 非イオン性とイオン性洗剤 (デオキシ コール酸ナトリウム [SDC] と [SDS] ドデシル硫酸ナトリウム)。ただし、発行済みのプロトコルを次は正常解剖と完全な血流と ECM 構造を維持しながら decellularization を苦しんだ。我々 は、decellularization の中に応用の洗剤が細胞の換散を引き起こすそれにより器官に消化酵素を放出と推測。リリースされた酵素は ECM 足場に不可逆的な損傷を引き起こす、decellularization と recellularization の非効率的なこと。効果的に膵臓を消化酵素の作用を抑制する、decellularizes メソッドのデザインは、問題を解決可能性があります。我々 は彼らがなぜ低温が使用される9の報告されていないが何倍ら、冷たい温度で膵臓の decellularization の戦略を選んだ。同時に腹腔トランク (CT) と上腸間膜動脈 (SMA)11上の灌流の入口として大動脈の選択によってテイラーらから変更と郭清の戦略を考案しました。
最近発行された記事12、効果的な分離といくつかの ECM 成分を維持しながらブタ膵臓の decellularization のメソッドを紹介します。本稿では、脾臓、十二指腸を含む全体ブタ膵臓を解剖する方法および接続耳たぶの詳細な説明を見るし、成功した decellularization のための段階的なプロトコルを提示します。

<table><tbody><tr><td>4mm DLP動脈切開カニューレ</td><td>Medtronic</td><td>31104</td><td></td></tr><tr><td>2ml ラベルなしピペット</td><td>vWR</td><td>612-3720</td><td></td></tr><tr><td>Degasser</td><td>Biotech AB</td><td>0001-6484</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Worthington</td><td>LS0020007</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 and MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>EDTA二ナトリウム塩二水和物</td><td>AlfaAesar</td><td>A15161。</td><td></td>OB</tr><tr><td>ヘパリン</td><td>レオ</td><td>387107</td><td></td></tr><tr><td>ルアー オス 1/8インチ ID バーブ</td><td>オイナ</td><td>LM-2PP-QC</td><td>3X5mm シリコンチューブ用</td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>オイナ</td><td>SP-1X4</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>ロシュ</td><td>10837091001</td><td>水溶液中で不安定です。灌流前に新たに追加する必要があります。</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>リン酸水素カリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>SDC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>シリコンチューブ 3X5mm</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13423</td><td></td></tr><tr><td>リン酸水素ナトリウム</td>メル<td>ク</td><td>71640-M</td><td></td></tr><tr><td>縫合糸</td><td>V&ouml;メル</td><td>14817</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ 50mL</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>300137</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>AlfaAesar</td><td>A16046.の</td><td></td></tr></tbody></table>

分離と全体ブタ膵臓の decellularization

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

全体膵臓のティッシュ エンジニア リングは、現在の糖尿病の治療法を向上できます。究極の目標は、組織エンジニア リング膵臓、ヒトの細胞と同種または異種ソースから効率的な郭清、decellularization、ブタの膵臓の recellularization に方法の例は、フィールドにメリットがあります。ブタ膵臓人間の膵臓に似ている 3 つの裂片のある解剖学的契約している (脾臓、十二指腸、および接続) 十二指腸や小腸で丸められます。膵十二指腸葉いくつかの小さな血管十二指腸に接続します。性質は、外分泌と内分泌膵臓の組織工学、複雑です。本稿では全くブタの膵臓を細かく分析し、その構造といくつかの細胞外マトリックス成分の保存中の洗剤とそれを decellularize 詳細なプロトコルを紹介します。完全な灌流を達成するために、大動脈は、入口と出口として門脈として選択されます。その他の血管 (肝動脈、脾静脈、脾動脈、上腸間膜動脈と静脈のツリー) と胆管を結紮します。豚のヘパリン血栓の形成を防ぐためには、そして、冷たいヘパリンと郭清後すぐに臓器がフラッシュされます。膵外分泌酵素の作用を抑制するには、膵臓の decellularization が 4 ° C で設定します。Decellularization は、トリトン X-100、デオキシ コール酸ナトリウム、デオキシリボヌクレアーゼ、断続的に最終的な広範な洗浄・灌流によって実行されます。成功した decellularization と膵臓が白、表示され、ヘマトキシリンとエオシンと組織学的評価は、保存された細胞外マトリックスの構造の核の不在を示しています。したがって、正常に decellularize 全体ブタ膵臓を解剖し, 提案手法を使用できます。

図 2 aにツリー、門脈、肝動脈、胆管、大動脈 CT と SMA への分岐を静脈や下腸間膜動脈解離の検索とのに役立ちます、代表的なブタ膵臓解剖の写真が表示されます。2 b、および2 C (黄色の矢印)、それぞれ。ライトピンクし、脾、含まれています表示される図 3 a正常膵の形態を示しています接続、および十二指腸の葉。Decellularization 後、ピンク色が失われ、decellularized 膵臓の色で淡い白に見えます。脾を示す形態画像、接続、および decellularized 膵臓十二指腸の葉図 3 bに示します。図 3は、彼との汚損によって正常膵で多くの青い核の存在を示しています。Decellularized 膵臓、彼の核の損失青い核は見たない染色示した (図 3 D)。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig2v2.jpg"> 図 2: ブタの膵臓の解剖の写真。(A) 下腸間膜動脈と静脈ツリー (黄色の矢印) の場所です。(B) 結紮術、門脈、肝動脈、胆管 (黄色の矢印)。(C) 大動脈腹腔トランクと上腸間膜動脈 (黄色の矢印) に分岐します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig3.jpg"> 図 3: 総体の形態および彼通常と脱膵臓の染色します。(A) 通常の膵臓の形態。(B) decellularized 膵臓の形態。彼 (C) 染色正常膵で青い核の存在を示しています。彼 (D) 染色 decellularized 膵臓で青い核の欠如を示しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

全体膵臓の組織工学は、外分泌と内分泌機能のための挑戦です。そのままブタ膵臓と界面活性剤 Triton X-100 の灌流成功 decellularization のプロセス、デオキシ コール酸ナトリウム、デオキシリボヌクレアーゼの解剖のための手法を示す.

分離と全体ブタ膵臓の Decellularization

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

この方法は、接続、十二指腸、脾臓葉を含むブタ膵臓の解剖および低温時の洗剤の灌流による最終的な脱細胞化に使用することができる。この脱細胞化法は、ブタ膵臓に関する洞察を提供するが、他の大型動物の膵臓にも適用される可能性がある。この技術の主な利点は、さらに組織工学的な適用のために、膵臓のような複雑な器官の無傷の検索を容易にすることである。一般的に、この方法に新しい個人は、周囲のすべての血管を識別し、連結しながら、無傷の膵臓の解剖が習得するために多くの練習を必要とするので、彼らは苦労します。手順を開始する前に、1つの3〜5ミリメートルのシリコーンチューブを使用して、洗浄剤容器を蠕動ポンプに接続し、2番目の3〜5ミリメートルのシリコーンチューブを使用して、蠕動ポンプを脱ガッサーを介して臓器室に接続します。オスのLuerを2本目のチューブの自由端に接続し、3つ1~5ミリメートルのシリコンチューブを使用して、蠕動ポンプを介して臓器室を洗剤回収容器に接続します。最後に、2ミリメートルのラベルなしピペットを、洗剤容器と洗剤回収容器のチューブの自由端に接続します。次に、脱細胞化の設定を摂氏4度に設定します。膵臓を収穫するには、ヘパリン化された45キログラムの雌豚をスピーニン位置の解剖台に置き、メスを使ってxiphoidプロセスから陰部骨への40センチメートルの中線切開を行い、腹部器官を露出させる。脾臓、十二指腸、および接続ローブを同定した後、主要な十二指腸乳頭を見つけ、2つの個々の縫合糸を使用して、サイトから十二指腸を経口的にリゲートする。下の食道を追加の縫合糸でリゲートし、合字の間をはさみで切り取り、胃の除去を容易にする。結腸組織を結腸から分離して小腸に到達し、膵臓の脾臓に付着する結腸の結合組織を分離する。小腸は脾臓の葉で結合組織によって膵臓に付着するが、また膵臓を取り囲む。腸と膵臓の間の結合組織を解きほぐし、分離するために腸の経路に注意深く従う必要があります。動脈を結紮した後、小腸から結腸を取り除く。下腸間膜静脈、下腸間膜動脈の木を識別し、膵臓に1つの縫合口尾で血管をリゲートし、はさみで切断します。脾動脈と静脈をヒラムで一緒にリゲートし、脾臓に近づき、はさみで遠分切って脾臓を取り除きます。十二指腸と接続ローブがクリアされるまで十二指腸に従い、最後に十二指腸を2つの別々の縫合糸でリゲートします。2つの器官間のすべての小さな血管の結紮が困難すぎるため、接続と十二指腸葉と密接に接触している十二指腸の部分は、膵臓と除去される。門脈を解剖した後、肝臓からの血液漏れを防ぐために1つの縫合糸で血管をリゲートし、胆管と肝動脈を2つの縫合糸で解剖し、リゲートする。その後、門脈、肝動脈、胆管をはさみで切ります。腎静脈の下で大動脈を見つけ、血管が膵臓に到達するまで筋肉および結合組織から頭蓋方向に大動脈を解剖する。さて、膵臓をそっとひっくり返し、大動脈を解剖し、上の腸間膜動脈とセリアックトランクをそのまま維持します。大動脈頭蓋をセリアックトランクに切り、残りの周囲の組織を鈍く解剖して膵臓の収穫を可能にする。次に、4ミリの動脈切開カニューレに接続された50ミリリットルの注射器を使用して、臓器全体が浸透するまで、または臓器全体が冷たくなるまで、大動脈を通して大動脈を通して大動脈を洗い流す。溶液2つの浸透した膵臓を氷の上の金属トレイに置き、大腸を上に向け、はさみを使用して十二指腸から縫合糸を切断します。25ミリリットルのピペットを使用して、十二指腸を50〜150ミリリットルの超純水で洗い流し、新鮮な縫合糸で組織を再縫いします。大動脈の一方の端と、上の腸間膜動脈とセリアック幹を除くすべての枝をリゲートして漏れを防ぎ、4ミリメートルの動脈開管を大動脈の反対側に挿入する。次に、膵臓を臓器室に入れ、膵臓のカニューレを男性のルエルに接続します。その後、1分間に20ミリリットルで1時間溶液3で膵臓を浸透させ、二重浸透した膵臓を解放菌開始まで溶液4でマイナス20度で凍結する。脱細胞化を開始した日には、膵臓を摂氏4度で解凍し、解凍した膵臓を脱細胞化器官室に入れます。洗剤入口チューブを膵臓の大大小に接続し、1分間に20ミリリットルの溶液3で膵臓を摂氏4度で一晩洗います。翌朝、臓器室に残っている溶液をデカントし、4°Cの溶液5で毎分20ミリリットルで膵臓を30分間浸透させた。溶液5回の灌流の終わりに、溶液6と4°Cで毎分20ミリリットルで8時間膵臓を浸透させ、続いて新鮮な溶液5で96時間の洗浄を毎分20ミリリットル、摂氏4度で洗浄する。洗浄をカルシウムとマグネシウムを30分間摂氏37度で30分間補ったDPBSの500ミリリットルに置き換え、続いて250ミリリットルの溶液を4時間、毎分20ミリリットル、摂氏37度で灌流します。その後、1分間に20ミリリットル、摂氏4度で新鮮な溶液5で臓器をさらに120時間洗浄し、オルガンを溶液8に保存します。ここでは、薄いピンク色に見え、脾臓、接続、十二指葉を含む正常な膵臓の総形態が観察される。脱細胞化後、ピンク色が失われ、処理された膵臓は淡い白色に見えます。正常な膵臓では、多くの青色核はH染色とE染色によって明らかであり、脱細胞化された膵臓では核はもはや視覚化されず、その喪失を確認する。単離されたインタクトブタ膵臓は、この手順に従って、構造を維持しながら完全な灌流と脱細胞化を可能にし、またいくつかの細胞外マトリックスタンパク質を得ることを可能にする。脱細胞化膵臓は、関連する細胞タイプのバイオリアクターシステムにおける全臓器の再細胞化戦略の開発に使用できます。レシピエント幹細胞による再細胞化後、組織設計膵臓は臨床応用および薬物検査に使用され得る。Triton X-100およびSDCでの作業は非常に危険であり、手袋を着用したり、ヒュームフードの下でソリューションを準備するなど、予防措置は常にこの手順を実行している間に取られるべきであることを忘れないでください。

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