Name: マウスにおける線込みおよび脊髄窓移植 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: 学ぶマウス脊髄窓移植法。ガラス窓を用いた生体内イメージングにより、中枢神経系のタンパク質動態を可視化し、神経血管相互作用や疾患機構の解明に貢献します。

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S.E.Lutzは、グラントKL2TR002002とイリノイ大学シカゴ医科大学のスタートアップファンドの下で、翻訳科学を進める国立センター、国立衛生研究所によってサポートされています。サイモン・アルフォードはRO1 MH084874によってサポートされています。コンテンツは著者の責任のみであり、必ずしもNIHの公式見解を表すものではありません。著者らは、コロンビア大学医療センターの神経学科のドリタン・アガリューに感謝しています:Claudin-5マウス、科学的な議論、および外科的プロトコルとイメージングアプリケーションの開発に関する洞察。著者らは、カリフォルニア大学アーバイン校の神経生物学と行動学科のSunil P. Gandhiに感謝し、立体装置と動物温度コントローラの最初のプロトタイプを設計し、外科的プロトコルの議論を行い、2光子顕微鏡検査の訓練。著者らはまた、外科立体顕微鏡のカスタマイズを支援するスティーブ・ピッケンズ(W.Nuhsbaum, Inc.)と、立体部品を加工するためのロン・リピンスキー(ホエール・マニュファクチャリング)に感謝しています。

すべての実験は、イリノイ大学、シカゴ機関動物ケアおよび使用委員会のプロトコルに従います。これは端末の手順です。
1. 試薬の調製
<ol><li>人工脳脊髄液(aCSF)を125mM NaCl、5mM KCl、10mMグルコース、10mM HEPES、2mM MgCl 2·6H2 O、2mM CaCl2·2H2O in ddH2O.滅菌フィルターおよび凍結を含む。使用前に水浴中のaCSFを39°Cに温めます。</li>
	<li>暖かい低融点アガロース (2%)65°Cに設定された水浴に完全に溶解するまでaCSFで。ラミネクトミーの間に、水浴で溶かしたアガロゼアリコートを39°Cに冷却し、ステップ5.2の生理学的温度に近い温度で準備できるようにします。 注:アガロース溶液は、単一使用のアリコートで-20°Cで保存することができます。</li>
	<li>静菌水中に無菌50mg/mLカルプロフェンを調剤する。4 °Cで保存します。</li>
	<li>70%のエタノール、ddH2Oの3つの洗浄を備えたきれいなカバーグラス、ほこりのない容器に乾燥保存します。</li>
</ol>2. バックプレート3Dプリンティング
<ol><li>3D CAD ソフトウェアを使用して、図 1に示す寸法に対してモデルを作成します。内部は、プリンタに対して底面で最も広い楕円であり、反対側の内面に内面を形成する小さな楕円にロフトカットでカットされています。ねじを受け入れる穴を持つ2つの突出アームは、バックプレート保持フォークに取り付けるために、横に伸びています。この 3D 構造から、三角パッチされた 3D メッシュ ファイル (。STL ファイル)。 注:図 1B\u2012Dおよび補足ファイル 1 および 2を参照してください。</li>
	<li>三角パッチされた 3D メッシュ ファイルを 3D プリンターにアップロードします。</li>
	<li>0.4 mm のホットエンド ノズルと 0.2 mm の層の高さを使用してバックプレートを印刷します。ノズル温度205°C、ベッド温度45°C、印刷速度45mm/sを選択します。</li>
	<li>構造の完全性のために結果の3Dプリントバックプレートを視覚的に評価します(図1E)。重大な構造故障(ルーメンが存在せず、壁が崩壊した)は、印刷欠陥を示す(図1F)。</li>
</ol>3. 外科的準備
<ol><li>加熱パッドを予熱します。</li>
	<li>化学ヒュームフードで作業中に、送達シリンジに負荷が発生します。配達用注射器をイソファランユニットに取り付けます。</li>
	<li>8\u201212 週齢のマウスを選択します。動物の体重を量る。誘導室で2%イソファルランを用いて麻酔を誘導する。皮下に5mg/kgでカルプロフェンを注入する。</li>
	<li>鼻コーンを位置付けし、麻酔の外科面の維持のために150 mL/minの流量で2%でイソファランを提供する(図2A\u2012E)。クリーンアップを容易にするために使い捨て吸収パッドで加熱パッドをラップします。</li>
	<li>外科ステーションの暖房パッドの上に動物を置き、鼻コーンを取付けます。石油ゼリーで温度計を潤滑し、直腸に5mm挿入します。安定のために温度計のプローブを尾部にテープで留めます。マウスの目に眼科のチントを適用します。</li>
	<li>水分補給を維持するために、実験終了まで30分ごとに皮下注射により200μLの乳酸リンガー溶液を塗布する。</li>
	<li>70%のエタノールでドーサムをスプレーし、バリカンで毛皮を取り除き、ポビドネヨウ素でサイトをきれいにします。</li>
</ol>4. ラミネクトミー
<ol><li>耳の棒の間に動物を配置します。これらは、鼻コーンに対してマウスの頭部位置を維持します。</li>
	<li>動物がデジタル間のピンチ反射と安定した呼吸パターンの欠如によって評価されたと同じように深く麻酔されていることを確認する。</li>
	<li>#11ブレードを使用して、下部胸部/上部腰部の中間線に1.5cmのrostral-caudal切開を行います(図2)。鈍い歯の鉗子および/または手袋の指でそれをつかむかによって皮を分ける。鉗子を使用して、皮膚の下に残っている透明な結合組織を分離し、剥離します。表面的な筋肉が露出する必要があります。泡の外科槍でこれを置き換える。</li>
	<li>発泡手術槍(またはキュレット)を使用して、標的椎骨の残りの、より深い筋肉を取り除きます(胸部12)。バックプレート用の座席を作成するには、胸部11の後部態様、および胸部13の前側から筋肉を離れてもクリアする。外科槍で穏やかな圧力を加えることによって出血を制御するか、灼砲で最低の脈拍を使用する。鉗子を使用して腱から離れて残りの筋肉を削除し続ける</li>
	<li>筋肉を取り除いたら、鉗子で切って腱を慎重に取り外します。この手順が完了したら、コードを視覚化して操作するための十分なスペースが必要です。椎間空間の硬膜問題、半透明の層骨、骨の下の中央表面的な血管、および前々の放射動脈がはっきりと見えるようになりました。</li>
	<li>暖かいaCSFで地域を濡らします。マイクロドリルを使用して、脊髄の長軸に平行なストレートストロークを使用して層骨を繰り返し薄くします(図2、図3)。必要に応じて、グライディングステージを利用して、人間工学的の快適性を高めるために外科プラットフォームを回転させます(例えば、右利きのオペレータは、掘削ステップのために外科プラットフォームを反時計回りに回転させることができます)。 注:使用される滑空段階は固定された基盤版に対して±15 mmを滑る上のアルミニウム版から組み立てられる。</li>
	<li>鉗子で表面的な脊椎プロセスをそっとつかみ、椎骨を持ち上げます。骨は容易に持ち上がるべきです。抵抗がある場合は、ドリルで骨の薄化を繰り返し、必要に応じて虹彩はさみを使用し、組織を損傷しないようにハサミ先端を上方に向けるように注意してください。 注:硬膜をそのまま維持するためには、骨を引っ張らないことが不可欠です。</li>
	<li>#4鉗子を使用して、骨の破片を取り除きます。あらゆる出血を制御するために穏やかな安定した圧力を加えるために外科槍を使用しなさい。温かいaCSFで組織をすすいで下す。ティッシュが乾燥しないようにしてください。</li>
</ol>5. カバーガラス注入
<ol><li>露出したコードに3mmのホウケイ酸塩カバーガラスを優しく塗布します。</li>
	<li>アガロースが39°Cに冷却されていることを確認します。小さなへらを使用して、カバーガラスの端に暖かい2%アガロース/aCSFを適用し、毛細血管アクションが表面の下にそれを描画できるようにします。 注:39°C以下の温度では、アガロースがゲル化し始める場合があります。この場合は、水風呂または電子レンジを使用して再温めます。一部のオペレータは、最初にアガロースの1滴を適用し、上にカバーガラスを置くことを好みます。</li>
	<li>胸部レベル11椎骨脊椎および胸部レベル13椎脊椎で無傷の隣接椎骨の露出した骨関節プロセスに組織接着剤を適用する。隣接する腱および横断プロセスの上に、ラミネクトミー部位の周りのリングに追加の組織接着剤を適用します。 注:組織接着剤は、その後のステップで歯科セメントの適切な付着のために必要とされます。関節プロセスは、バックプレートが安定して休息できる自然な座席を形成します(図3)。関節プロセスへの接着は、愛着の最も強いポイントを形成します。</li>
	<li>歯科用セメントと磁器混合トレイに加速器を混ぜます。小さなへらを利用して、歯科用セメントを組織接着層に移します。歯科用セメントを使用して、窓の上に中央にバックプレートを外科分野に付着させます。歯科用セメントが硬化するまで10分かかります。 注:前後関節プロセスへのバックプレートのしっかりした接着は、インプラントの基本的な構造的安定性を提供します。</li>
	<li>バックプレートの内部ベースとバックプレートの下側を埋めるために追加の歯科セメントを使用してください: ティッシュインターフェイス。 注:歯科用セメントの余分な適用は付着性を改善し、顕微鏡客観的浸漬液(生理食べ物)がバックプレートの底部から漏出するリスクを減らす。</li>
	<li>フォークされたバックプレートホルダーをウィンドウ上の適切な位置に進めます。バックプレートをネジでバックプレートホルダーに固定します。 注: このプロトコルは、カスタムマシンのバックプレートホルダー(図2G\u2012H)を使用しました。</li>
	<li>バックプレートに生理生理を塗布し、漏れをテストします。流体が漏れた場合は、その面積を乾燥させ、より多くの歯科用セメントを塗布してください。</li>
</ol>6. イメージング製剤
<ol><li>外科プラットホームの動物を光学テーブルに移す。 注:私たちの外科プラットフォーム、バックプレートホルダー、およびイソファランノーズコーンホルダーは、連続的なイソファルラン麻酔(図2D、H)を適用しながら、1つのユニットとして外科用および2フォトンイメージングステーション間で輸送することができます。同様のユニットは、フォーク、ビーム、および商業ソースから入手可能な支持柱の支柱を保持から組み立てることができます(トールラボ)。生体内顕微鏡検査では、顕微鏡の目的と光学テーブルの間に少なくとも11インチのクリアランスが必要です。</li>
	<li>ステンレス鋼の土台のポストおよび反退屈した締め金で止めるフォークを使用して光学テーブルに外科プラットホームを接着する。</li>
	<li>バックプレートの井戸に新鮮な生理生理生理を適用します。水浸レンズを井戸に下ろします。</li>
	<li>透過光またはエピ蛍光光灯を使用して、対象領域と焦点領域を識別します。レーザー走査モードに切り替え、組織6に存在する蛍光体に対する適切な2光子レーザー励起波長、ダイクロイックおよびバンドパスフィルタに従って生体内イメージングを実行する。</li>
</ol>

<ol><li>Weinger, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+cellular+dynamics+in+the+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li>
<li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).</li>
<li>Farrar, M. J., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+implanting+a+spinal+chamber+for+longitudinal+in+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li>
<li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implanting+glass+spinal+cord+windows+in+adult+mice+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50826(2013).</li>
<li>Figley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spinal+cord+window+chamber+model+for+in+vivo+longitudinal+multimodal+optical+and+acoustic+imaging+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model.</a> PLOS ONE. 8 (3), e58081(2013).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Liebner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+morphology+of+the+blood-brain+barrier+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).</li>
<li>Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tight+junction+protein+complex+undergoes+rapid+and+continuous+molecular+remodeling+at+steady+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state.</a> Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).</li>
<li>Knowland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+recruitment+of+transcellular+and+paracellular+pathways+underlies+blood-brain+barrier+breakdown+in+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke.</a> Neuron. 82, 1-15 (2014).</li>
<li>Lutz, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolin1+Is+Required+for+Th1+Cell+Infiltration%2C+but+Not+Tight+Junction+Remodeling%2C+at+the+Blood-Brain+Barrier+in+Autoimmune+Neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation.</a> Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).</li>
<li>Harrison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebral+landmarks+for+the+identification+of+spinal+cord+segments+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse.</a> Neuroimage. 68, 22-29 (2013).</li>
<li>Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-4939-0381-8_2">Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue</a>. Bakota, L., Brandt, R. , Springer. New York. 37-50 (2014).</li>
<li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450(2016).</li>
<li>Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser-scanning+microscopy+for+single+and+repetitive+imaging+of+dorsal+and+lateral+spinal+white+matter+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Research%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo.</a> Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).</li>
<li>Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+Low-flow+Digital+Anesthesia+System+for+Mice+and+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).</li>
<li>Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Traditional+and+Integrated+Digital+Anesthetic+Vaporizers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).</li>
<li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+COX-2+inhibitor+celecoxib+prevents+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+through+COX-2-independent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway.</a> Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).</li>
<li>Muthian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COX-2+inhibitors+modulate+IL-12+signaling+through+JAK-STAT+pathway+leading+to+Th1+response+in+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis.</a> Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

ここで説明する方法は、ガラス窓を介してマウスにおける脊髄の安定的なイメージングを可能にする。この方法は、蛍光BBBタイトジャンクションタンパク質を発現するトランスジェニックeGFP:Claudin5+/-マウスにおけるBBBリモデリングを評価するために適用されているが、脊髄内の蛍光タンパク質または細胞の研究にも同様に適用できる。
ラミネクトミーと脊髄安定化のための複数の方法が開発されている。すべてのプロトコルは、目的の構造への視覚的なアクセスのためのイメージングとウィンドウの実装中に脊髄を安定させることに対処します。除去された椎骨の数および利用可能なプロトコルの侵襲性の程度はさまざまである(例えば、表面的な骨の表面に接着された成分は、本プロトコルのように、より深く埋め込まれるのと比較して)。ダバロスとアカソグロウ2は、脊髄を安定させるために、脊柱の両側に取り外し可能なクランプとマウスの尾部の基部に1つのクランプを使用して、ラミネクトミー法を開発した。動物を中断するこの革新的な戦略は、外科テーブルに対...

蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック動物モデルは、生体内顕微鏡と組み合わせることで、生物学および病態生理学に対処するための強力なプラットフォームを提供する。これらの技術を脊髄に適用するには、脊髄をイメージング用に準備するために特別なプロトコルが必要です。そのような戦略の1つは、ラミンクトミーと脊髄窓の移植を行う。顕微鏡検査のための理想的なラミネクトミープロトコルの主な特徴は、ネイティブ組織の構造と機能の保存、イメージング分野の安定性、迅速な処理時間、および結果の再現性を含みます。特に課題は、呼吸と心拍によって引き起こされる運動に対してイメージングフィールドを安定させることです。複数のex vivoとインビボ戦略は、これらの目標1、2、3、4、5を達成するために報告されています。生体内の方法のほとんどは、脊柱2、4の側面を締め付け、しばしば手術中の安定性のために堅い金属装置3、4を埋め込むことが続く。ダウンストリームイメージングアプリケーション。脊柱を締め付けると、血流を損なう可能性があり、血液脳関門(BBB)タンパク質リモデリングを誘発する可能性があります。
この方法の目的は、プロトコルの侵襲性を最小限に抑え、結果を改善しながら、生きているマウスの光学イメージングのために無傷の脊髄を利用できるようにすることです。我々は、まだ堅牢な機械的安定性を達成する最小限に侵襲的な楕円形のプラスチック3Dプリントバックプレートと組み合わせた単一のラミネクトミーとカバーガラスの注入手順を説明します。バックプレートは歯科セメントが付いている前部および後脊柱に直接付着する。バックプレートは金属の腕によって顕微鏡の段階に堅く付着するねじ穴が付いている横延長腕が装備されている。これは、無傷の前椎骨と後椎骨を顕微鏡段階に効果的に固定し、呼吸と心拍によって導入される運動アーティファクトに機械的抵抗を提供します。この方法は、胸部レベル12で単一椎骨のラミネクトミーのために最適化されており、生体内イメージング中の安定性のための代替戦略で利用されるクランプを省略する。この手順は、マウスあたり約30分を取って、迅速です。
このプロトコルは、BBBの疾患メカニズムを研究するために使用することができる。BBBは、内皮細胞、血管平滑筋、ペリサイト、および星状の足のプロセスからなる動的な微小血管系であり、中枢神経系(CNS)に高度に選択的な環境を提供します。代表的なデータは、増強された緑色蛍光タンパク質(eGFP):Claudin-5、BBBタイトジャンクションタンパク質を発現するように設計されたトランスジェニックマウスにおけるこのプロトコルの適用を示す。提供されるバックプレート印刷ファイルは、代替用途用にカスタマイズすることもできます。

<table><tbody><tr><td>3Dプリンター</td><td>Raise3D</td><td>Pro2</td><td>バックプレートの印刷用</td></tr><tr><td>PLA 3Dプリンティングフィラメント</td><td>インランド</td><td>PLA+-175-B</td><td>ブラックプラスチック 3Dプリンティング材料</td></tr><tr><td>3D CADソフトウェア</td><td>Dassault Systemes</td><td>Solidworksソフトウェア</td><td>3D形状の設計に使用する</td></tr><tr><td>ソフトウェア 3Dプリンターソフトウェア</td><td>Raise3D</td><td>Ideamakerソフトウェア</td><td>ソフトウェア 3Dプリンターとのインターフェースに使用する</td></tr><tr><td>3Dプリントされた楕円形のバックプレート</td><td>カスタム</td><td></td><td>安定化イメージングフィールド</td></tr><tr><td>手術解剖顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>M205 C</td> ライ<td>カフュージョンオプティクス、プラナポ0.63x Mシリーズ対物レンズ、グライディングステージ搭載</td></tr><tr><td>顕微鏡カメラ</td><td>ライカ</td><td>MC170</td><td>手術野を視覚化するためのHDカラーカメラ</td></tr><tr><td>ライディングステージ</td><td>ライカ</td><td>10446301</td><td>滑走ステージは2枚の金属板で構成されています。ベースプレートは固定されています。上部プレートはグリースを塗ったインターフェース上をスライドし、回転および直線運動を可能にします。</td></tr><tr><td>手術ステーションと安定化フォーク</td><td>クジラ製造</td><td>カスタム</td><td>椎弓切除術</td></tr><tr><td>SomnoSuite 低流量イソフルラン送達ユニット</td><td>ケント・サイエンティフィック</td><td>SS-01</td><td>デジタル気化器を内蔵した外科麻酔薬</td></tr><tr><td>ステンレス製 1.5インチ取り付けポスト</td><td>ThorLabs</td><td>P50/M</td><td>2光子イメージング</td></tr><tr><td>用の光学テーブルへの手術ステーションの取り付け用1.5インチ取り付け用座ぐりクランプフォーク ポスト</td><td>ThorLabs</td><td>PF175</td><td>手術ステーションを安定させるため、2光子イメージング用の光学テーブルに取り付けられ</td></tr><tr><td>ます 理想的な骨マイクロドリル</td><td>ハーバード装置</td><td>72-6065</td><td>椎弓切除術のための骨の薄化</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15-462-10</td><td>温まる生理食塩水</td></tr><tr><td>焼灼銃</td><td>FST</td><td>18010-00</td><td>マイナーな焼灼ブリード</td></tr><tr><td>加熱パッド</td><td>ベンチマーク</td><td>BF11222</td><td>1.9 "x 4.5"シリコンヒーター、20 "付きテフロンリード、10W、5V</td></tr><tr><td>Kタイプ熱結合直腸プローブ</td><td>Physitemp</td><td>RET3</td><td>マウス体温測定</td></tr><tr><td>ワセリン</td><td>シグマ</td><td>8009-03-8</td><td>潤滑直腸プローブ</td></tr><tr><td>フィードバック調整サーマルコントローラー</td><td>カスタム</td><td>NA</td><td>市販の代替品には、Physitemp TCATシリーズ</td></tr><tr><td>PVAサージカルアイスピアーズ</td><td>ビーバービジターが含まれます国際</td><td>40400-8</td><td>血液を吸収する</td></tr><tr><td>電気トリ</td><td>マーWahl</td><td>41590-0438</td>トリミング<td>マウスの毛皮</td></tr><tr><td>ブレード、#11</td><td>FST</td><td>14002-14</td><td>手術器具</td></tr><tr><td>鉗子、#5</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td>手術器具</td></tr><tr><td>鉗子、#4</td><td>FST</td><td>14002-14</td>外科<td>手術器具</td></tr><tr><td>チタトニウム歯付き鉗子</td><td>WPI</td><td>555047FT</td><td>手術器具</td></tr><tr><td>チタンアイリスはさみ</td><td>WPI</td><td>555562S</td><td>手術用具</td></tr><tr><td>Vetbond組織接着剤</td><td>3M</td><td>084-1469SB</td><td>歯科用アクリルの組織表面の準備</td></tr><tr><td>セラミックミキシングトレイジャック</td><td>リッチソン</td><td>420716</td>促進<td>剤と歯科用アクリル剤の混合</td></tr>オル<tr><td>ソジェット歯科用アクリル</td><td>Lang Dental</td><td>1520BLK、1503BLK</td>組織<td>へのバックプレートの永久接着</td></tr><tr><td>小さな丸いカバーガラス、#1の厚さ、3ミリメートル</td>ハーバー<td>ドの装置</td><td>64-0720</td><td>光学窓</td></tr><tr><td>NaCl</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>7647-14-5</td><td>aCSF</td></tr>の<tr><td>KCl</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>7447-40-7</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>グルコース</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>50-99-7</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ</td><td>7365-45-9</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>MgCl2&ミッドドット;6H2O</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>7791-18-6</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>CaCl2&middot;2H2O</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10035-04-8</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>カルプロフェン</td><td>リマジル</td><td>QM01AE91</td><td>鎮痛剤</td></tr><tr><td>静菌水</td><td>ヘンリー・シャイン</td><td>2587428</td><td>カルプロフェン用希釈剤</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ヘンリー・シャイン</td><td>11695-6776-2</td><td>麻酔</td></tr><tr><td>乳酸リンガー溶液</td><td>バクスター</td><td>0338-0117-04</td><td>ハイドレーションマウス</td></tr><tr><td>用アガロース高EEO</td><td>シグマ</td><td>A9793</td>ゲル<td>ポイント34-37°C</td></tr>眼<tr><td>科用潤滑軟膏</td><td>アクワ涙液68788-0697</td><td></td>角<td>膜乾燥を防ぐ</td></tr><tr><td>MOM Two-Photon</td>顕微鏡<td>サッター</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウスにおける線込みおよび脊髄窓移植

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

このプロトコルは、マウス脊髄の生体内イメージングのための脊髄ラミネクトミーおよびガラス窓移植のための方法を説明する。統合されたデジタル気化器はイソロルランの低流量で麻酔の安定した平面を達成するために利用される。単一の脊椎が取り除かれ、市販のカバーガラスが薄いアガロースのベッドの上に重ね合わされる。3Dプリントされたプラスチックバックプレートは、組織接着剤と歯科セメントを使用して隣接する椎体脊椎に貼り付けられます。安定化プラットフォームは、呼吸と心拍からモーションアーティファクトを減らすために使用されます。この急速でクランプフリーの方法は急性多光子蛍光顕微鏡検査に適している。代表的なデータは、eGFPを発現するトランスジェニックマウスにおける脊髄血管系の2光子顕微鏡検査に対して、この技術を適用するために含まれる:Claudin-5 - タイトな接合タンパク質である。

埋め込まれたガラス窓および重要な2光子顕微鏡はCNSタンパク質の動的変化を査定するための有用な用具を提供する。BBBの機能的完全性は、タイトジャンクションタンパク質7の発現、細胞内局在化、および回転率の影響を受ける。以前の研究では、タイトな接点タンパク質が定常状態8で迅速かつ動的なリモデリングを受けることが実証されています。現在記載されているラミネクトミーとガラス窓の調製は、蛍光タイトジャンクションタンパク質を有するTransgenic eGFP:Claudin-5マウス9で使用され、実験的自己免疫におけるBBBタイトジャンクションリモデリングを評価する。多発性硬化症の脳脊髄炎(EAE)モデル10.代表的なデータでは、eGFP:Claudin-5のイメージングは、920nm励起、40×赤外線目的(0.8 NA)、および緑色蛍光発光フィルタ(図...

このプロトコルは、マウスの脊髄にガラス窓を移植し、生体内顕微鏡による視覚化を容易にすることを説明する。

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

この方法により、インタクト中枢神経系内の生体内のタンパク質ダイナミクスを調べ、神経科学や免疫学の問題に対処することができます。この手順の主な利点は、画像取得、短い手術時間、ガス麻酔へのオペレータ暴露の減少、および安価なカスタマイズ可能なバックプレートのための優れた運動安定性です。この方法の視覚的なデモンストレーションは、手順のラミネクトミーステップ中に密接に基礎となる神経系組織を損傷することなく骨を除去することが困難であるため、重要である。手順を開始する前に、3D コンピュータ支援設計ソフトウェアを使用して、指定された寸法に対するモデルを作成します。だから、私たちは3次元オブジェクトであるオブジェクトを持っています。私ができることは、印刷版の設定を置くことができるということです。だから私がこれを編集を開いたら、詳細設定に進み、これらの設定をすべて見せるためのウィンドウを開きます。3Dプリンタでノズル温度を摂氏205度、ベッド温度を摂氏45度、印刷速度を毎秒45ミリメートルに設定します。0.4ミリメートルの熱いentノズルと0.2ミリメートルの層の高さを使用して、バックプレートを印刷します。次に、印刷されたバックプレートの構造的完全性を視覚的に評価します。グロス構造障害は印刷上の欠陥を示します。バックプレートの準備ができたら、8〜12週齢の麻酔マウスの頭部を外科用拘束剤のイヤーバーの間のヒートパッドに置き、動物の目に軟膏を塗布します。つま先ピンチに対する応答の欠如を確認した後、11センチメートルのロストラルを下胸部上部腰椎領域上の垂直切開にして、皮膚を腹膜から分離します。皮膚の下に残っている透明な結合組織を剥がして表面的な筋肉を露出させるために鉗子を使用してください。ターゲット椎骨の残りの深部筋肉と一緒に泡の外科用槍で筋肉を置き換えます。バックプレートのシートを作成するには、胸部11の後部の側面と胸部13の前側面から筋肉をクリアする。必要に応じて腱から残りの筋肉を除去するために鉗子を使用する。すべての筋肉を取り除くと、脊髄を視覚化して操作するための十分なスペースが得られるまで、慎重に鉗子で腱を切断する。椎間空間の硬膜、半透明の層骨、骨の下の中央の表面血管、および前放射動脈がはっきりと見えるのを確認する。暖かい人工脳脊髄液で領域を濡らし、脊髄の長い軸に平行なストレートストロークを使用して層状骨を薄くするためにマイクロドリルを使用します。表面的な棘のプロセスを鉗子でそっとつかみ、椎骨を持ち上げます。骨は簡単に持ち上げるはずです。4番の鉗子を使用して骨の破片を取り除き、必要に応じて外科的槍と穏やかな安定した圧力で出血を制御します。その後、暖かい人工脳脊髄液で組織をすすいします。カバーガラスの注入のために、露出したコードに3ミリメートルのホウケイ酸カバーガラスを静かに塗布する。ガラスの端に39度の摂氏3%のアガロースを加え、カバーガラス表面の下にアガロースを描くために毛細血管作用を可能にするために小さなへらを使用してください。胸部レベル11および13椎骨の脊椎において、無傷の隣接する椎骨の露出した骨関節プロセスに組織接着剤を塗布する。隣接する腱および横のプロセスの上に、ラミネクトミー部位の周りのリングに追加の組織接着剤を塗布します。次に、新しいヘラを使用して、加速剤と混合した歯科用セメントを組織の粘着層に塗布し、カバーガラスの窓の上に中央の外科フィールドにバックプレートを置きます。歯科用セメントの複数の薄い層を適用すると、より強いバックプレートの接着になりますが、歯科用セメントが乾燥し始める前にすぐにバックプレートを配置してください。歯科用セメントを10分間硬化させた後、バック・プレイスの内部ベースと下側に追加の接着剤を充填します。薄い層に歯科用セメントを適用すると、セメントがカバーガラスやアガロースに広がるリスクを減らすのに役立ち、プロトコル全体を損なう可能性があります。歯科用セメントが乾燥したら、フォークバックプレートホルダーを窓の上の適切な位置に塗布し、バックプレートをバックプレートホルダーにねじ込みます。その後、漏れのテストのためにバックプレートに生理焼け地を適用します。動物および外科プラットホームはカバーガラスの窓を通してイメージ投射のための2つの光子顕微鏡の光学テーブルに移すことができる。本代表的実験では、EGFP陽性クローディン-5を、血管叢全体にわたって蛍光標識されたタイトな接合部内で可視化した。Z投影における密接点構造の明確な線引きは、ラミニング、窓の配置、およびバックプレートの移植が成功した後に最小のXY画像変位が生成されることを示しています。この手順を試みる間、このマイクロサージャストは困難であり、習得に時間がかかるかもしれないことを覚えておくことが重要です。しかし、一度習得すると、この手術は約30分で行うことができます。この手順に従って、2つの光子顕微鏡および生体内イメージングのような他の方法は、神経血管リモデリングおよび脊髄を含む他の疾患プロセスに関する追加の質問に答えるために行うことができる。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

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出典: Pietruczyk, E. A., et al.マウスにおける椎弓切除術と脊髄窓移植J. Vis. 経験。(2019年)このビデオは、in vivo イメージングのために麻酔をかけたマウスに脊髄ウィンドウを移植する方法を示しています。このプロトコルは、ホウケイ酸カバーガラスと 3D...

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学ぶマウス脊髄窓移植法。ガラス窓を用いた生体内イメージングにより、中枢神経系のタンパク質動態を可視化し、神経血管相互作用や疾患機構の解明に貢献します。

マウスにおける線込みおよび脊髄窓移植

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