空間と時間の温度変化に対応したショウジョウバエのパフォーマンスを決定する自動化された方法

ここで時間と空間で高速かつ正確な温度変化を生成するプログラム可能な温度制御のアリーナを使用して温度変化でショウジョウバエの歩行のパフォーマンスを自動的に決定するためのプロトコルを提案する.

この方法は、遺伝子型の違い、他の感覚的手がかりとの相互作用、または異なる温度受容体の機能など、温度変化に対するハエの反応に関する重要な質問に答える上で役立ちます。この技術の主な利点は、時間と空間を制御し、自動化された方法で複数の高速かつ正確な温度変化を可能にすることです。まず、45ミリリットルのフライフードメディアを含む飼育ボトルに20匹のオスと20匹の雌のハエを入れ、ボトルを12時間の光、12時間の暗いサイクルの下で25°Cインキュベーターの中に入れることから始めます。

10日後、二酸化炭素パッド上の新しく閉鎖されたハエを最大4分間麻酔します。そして、ペイントブラシを使用して、6.5ミリリットルの新鮮なハエ食品培地を含むバイアルを飼育するバイアルを飼育する2.5〜9.5センチメートルのフライで、バイアルあたり20ハエのグループにセックスで分離したヴァージンハエを収集します。その後、バイアルを5〜7日間インキュベーターに戻します。

温度調節されたアリーナを設定するには、アリーナをオンにして、コントロールコンピュータで温度フェーズスクリプトを開きます。温度シーケンスが正しく設定されていることを確認し、各実験フェーズの継続時間が60秒に設定されていることを確認します。実験開始ブロックセクションの下で、これらの設定を確認します:フェーズの所望の数、指標赤い発光ダイオードの反復オン/オフセットアップ、フェーズごとの摂氏2度の温度上昇、および開始温度として摂氏16度。

次に、温度フェーズスクリプトを実行します。ソフトウェアは5秒間初期化され、停止します。温度行動実験では、アリーナの銅タイルの上に白い導電テープのストランドを置き、すべてのエッジが覆われていることを確認します。

銅タイルの周りに加熱されたアルミニウムリングを置き、きれいなティッシュを使用してガラスカバーを拭きます。カバーをアルミリングの上部に置き、ハエを吹き込むことができる隙間を残し、順応したフライバイアルを2回タップしてハエをバイアルの底に押し付けます。口の吸引器を使用して、1つのハエをトラップし、インキュベーターに戻す前にバイアルを閉じます。

ガラスカバーとアルミリングの隙間からアリーナにフライを吹き込み、すぐにガラスクローバーを押してギャップを閉じます。アリーナの周囲にライトのフレームを配置して、対称的な照明を確保し、ビデオ録画プログラムで録画を開始します。次に、制御コンピュータのスペースバーを押して実験フェーズの実行を開始します。

ビデオを追跡するには、フライステップトラッキングソフトウェアを開き、フライトラッカーフォルダ内の設定ファイルを開きます。ビデオフォルダ内のビデオの場所とビデオファイルのビデオ名を設定します。アリーナのエッジで複数のポイントの x/y ピクセル座標に基づいて、アリーナ設定でフライ アリーナの境界線を指定します。

LED の中心の位置の x/y ピクセル座標に基づいて、LED 設定でのアクティブでない赤色の LED の位置を特定します。フライ アリーナの境界の場所を確認するには、アリーナ設定で debug を true に設定し、[保存] をクリックして、ターミナルでスクリプトを実行します。ビデオの画面キャプチャは、アリーナの設定で入力された座標によって形成された青い正方形で表示されます。

次に、アリーナ設定のデバッグを false に変更します。[保存] をクリックし、端末で画面を再度実行して、追跡処理を開始します。典型的な温度行動実験では、16、20、または24°Cにさらされた単一のハエは、実験の開始時に5分後よりも高い移動を示す。

温度制御されたアリーナは、異なる遺伝的背景からのフライ行動応答を動的温度変化と比較するためにも使用できます。例えば、この実験では、温度が上昇するにつれて、テストされたすべての種の速度が、最大性能のポイントに達するまで、独自の応答曲線に従って増加し、その後速度が減衰し、ハエが死んだ。個々のハエが中央と片側のタイルで摂氏40度にさらされたとき、もう一方の側面タイルは快適な22°Cで、ワイルドタイプのハエはすぐにアリーナに沿って動かなくなり、快適な場所にとどまります。

対照的に、古典的なメモリミュータントダンスはアリーナを探索し続け、快適な場所でコントロールよりも少ない時間を費やします。さらに、温度と位置の組み合わせの試験は、動的温度変化時の異なる温度受容体の機能を理解する上でも有用である。この実験で示されるように、個々のdメラノガスター変異体は温度上昇にさらされ、摂氏22度での移動快適な位置も提供された。

これらの手順を実行している間は、できるだけ多くのハエの動作をキャプチャできるように、手順を順番に迅速に実行することを忘れないでください。この手順の横には、負のジオタキシスやヒートチョークアッセイのような他の方法を使用して、ハエが正常に移動したり、通常の耐熱性を持っているなどの追加の質問に答えることができます。この技術の意味は、温度知覚や痛みが役割を果たす神経疾患や突然変異を理解することにまで及びます。

一般的に、この方法に新しい個人は、各ステップが単独で簡単ですが、テクニックを実践する必要があるため、完全に調整する必要があるため、苦労します。