Name: 潜在的な軟骨再生のための脂肪組織由来間質血管分数の生産の臨床プロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: 学ぶ、脂肪組織由来間質血管分数を用いた膝変形性関節症のための軟骨再生プロトコル。この最小侵襲的手法は患者の膝機能改善と組織修復に有効です。

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著者は、ミプロ診療・ Jaepil/デヴィッド ・ リーによる図設計のスタッフからのサポートを認めています。この作品はバイオ ・ MSIT (番号 NRF 2017M3A9E4078014) によって資金を供給された NRF の医療の技術開発プログラムからの研究補助金によって支えられました。国立研究財団の韓国 (NRF) 科学 (番号 NRF 2017R1A2B4002315 と NRF 2016R1C1B2010308) ICT 省によって資金を供給します。

承認および次の症例報告を報告することに同意は、明知大学制度検討委員会委員 (MJUIRB) によって放棄されました。さらに、この臨床プロトコルは、KFDA のヘルシンキ宣言と規制ガイドラインに準拠していました。手順については、本人の同意は患者から得られました。
1. 脂肪吸引
注: 生殖不能の技術で実行します。
<ol><li>次の基準を使用して: ステージ 3 の (1) の MRI 証拠 OA。(2) いずれかの男性または女性である;(18 歳 3) 以上の;(4) 十分な (100-110 g) 脂肪組織脂肪吸引。(5) 外科的介入を続行する気力の無さ(保守的な管理の失敗 6)(7) の継続的な無効にする痛み。</li>
	<li>以下の除外基準を使用します: (1) アクティブな炎症性または結合組織病が (すなわち、狼瘡、慢性関節リウマチ、線維筋痛) の痛みの状態に影響を与えると考えられて(痛みの状態 (すなわち甲状腺機能低下症、糖尿病) に影響を与えるかもしれない 2) アクティブの内分泌疾患(痛みの状態 (すなわち末梢神経障害、多発性硬化症) に影響を与えるかもしれない 3) アクティブの神経疾患(薬の使用を必要とする 4) アクティブな肺疾患(5) とステロイド関節注射過去 3 ヵ月の歴史無し。</li>
	<li>バイオハザード クラス A フードが手術室に患者をもたらすし、仰臥位で彼 (または彼女) を配置します。</li>
	<li>きれい betadine 5% (ポビドン ヨード) 患者の腹部と腹部脂肪吸引のための洗浄の領域を公開する生殖不能の技術を使用して、患者をドレープします。</li>
	<li>Infero 横方向に臍から約 5 cm 麻酔切開に-する-5 mL の注射器 (25 g、1 インチ) 針 2 mL エピネフリン無添加 2% リドカインを使用しての 2 つのサイト (左や臍の右側にある他の 1)表皮のレベルで各サイトを注入。</li>
	<li>麻酔切開に-する-10 mL の注射器の針 (25 ゲージ、1 インチ) で腫れ上がった溶液 (2% リドカイン、0.5% ブピバカイン、エピネフリン 1: 1000 の 0.5 mL の 20 mL の生理食塩水、40 mL の通常の 500 mL) 5 mL を使用してのサイト。</li>
	<li>皮下レベルの深さを高めるために皮膚をつまんで横に臍から下の 0.5 cm 約 5 cm の切開を 2 を作る。</li>
	<li>11 番を使用すると、発生皮膚腹壁を貫通はなく皮下レベルに貫通を突きます。</li>
	<li>20 cm 16 ゲージ カニューレを使用して腫れ上がったソリューションの 700 に 800 ml に-する-による誤嚥は、全体のより低い腹部区域の皮下レベルを麻酔します。</li>
	<li>後に接続されている 3.0 mm のカニューレを接続することによって脂肪吸引装置を準備腫れ上がったソリューション全体の下腹部の浸潤を仕上げ 60 mL (または 30 mL) シリンジ脂肪吸引マニュアルまたは特別に設計された 3.0 mm カニューレに接続されている、遠心分離機キット、不妊を保つことを目的として閉鎖系注射器は、真空吸引を真空マシンに接続。</li>
	<li>脂肪吸引脂肪腫れ上がったソリューションを除く 100 110 g を取得するを実行します。脂肪吸引の際に、脂肪を分離、削除する必要があります腫れ上がった解決策と共に取得します。</li>
	<li>腫れ上がったソリューションを分離する最初に重力、遠心分離機キットで脂肪組織を 60 mL の注射器に転送し、(すなわち、注射器の部分は下部) を注射します。5-6 分を待機することによって、脂肪組織と腫れ上がった液が分離します。シリンジのプランジャーの上の部分に、注射器の下部に流体を取り外します。</li>
	<li>脂肪組織 (成人) 膝あたりの 100-110 グラムの合計を蓄積されているまでは、1.9 1.11 の上記の手順を実行します。</li>
</ol>2. 滅菌のクローズド システムを ASC/ECM 混合物の調製
<ol><li>分離後重力と各 60 mL 遠心分離機キット、滅菌のクローズド システムあたり成人の 50-55 g を蓄積して腫れ上がったソリューション配置遠心容器バケツに凝縮、5 分間 1600 x gでスピン 2 遠心分離機キット、成人と脂肪組織から液体を分離します。これのそれ以上のプロセスに凝縮、特定のケースで油脂が生じる場合、成人。</li>
	<li>振る、安全キャップを取り外して、遠心分離機キットの下部にプラグ慎重にされます。</li>
	<li>遠心分離機キットのピストンの上にゆっくりと押し込んで下の流体を削除します。</li>
	<li>別の 60 mL の注射器に 50 ml の生理食塩水入りのコラゲナーゼ (コラゲナーゼ膠原病24特定の 5 mg) とコラゲナーゼ脂肪25特定の 5 mg の 10 mg を溶解します。</li>
	<li>凝縮した lipoaspirate のおよそ 25-30 mL 1:1 (v: v) の割合で溶存コラゲナーゼ (コラゲナーゼ結合組織に固有の 5 mg) とコラゲナーゼ脂肪組織に固有の 5 mg を混ぜて使用して遠心分離機キット 60 mL 注射器を接続し特殊なコネクタです。</li>
	<li>60 mL シリンジと遠心分離機キット ロッドまたはプッシャーを使用してコンテンツを押すことにより、凝縮した lipoaspirate と、コラゲナーゼを徹底的に混ぜます。</li>
	<li>混合物、lipoaspirate と、コラゲナーゼを 60 mL の注射器に転送します。</li>
	<li>ブレードを含む組織ホモジナイザーとの混合物を含む各 60 mL 注射器を接続します。</li>
	<li>空 60 mL シリンジをホモジナイザーのもう一方の端に接続します。</li>
	<li>4 -6 回、ホモジナイザーで、他の 60 mL の注射器に混合物を押して切ると、lipoaspirate のミンチの結果します。</li>
	<li>均質化の lipoaspirate とコラゲナーゼ混合物を特殊なコネクタを介して 60 mL 遠心分離機キットに転送します。</li>
	<li>37 ° C で予熱されているインキュベーターに配置するためのコンテナーに遠心分離機キット</li>
	<li>45 rpm で回転させながら 40 分の 37 ° C で均質混合物 2 つの遠心分離機キットを孵化させなさい。</li>
	<li>インキュベーションの 40 分後に、滅菌方法でインキュベーターからコンテナーを削除します。遠心分離機キットを削除し、遠心機でそれらを配置します。</li>
	<li>脂肪組織由来 SVF を分離する 5 分間 800 x gで混合物を遠心分離機します。</li>
	<li>遠心分離機後、各遠心分離機キットからプランジャーの上にシリンジ キャップを取り外し、注射器ロック経由でを開くプランジャー 30 mL シリンジを配置することによっての (これはコラゲナーゼを含む脂肪組織を消化) 上清を除去する.接続します。</li>
	<li>ゆっくりと 30 mL シリンジ 30 mL の注射器にいっぱいに上清のバレル部を押してください。</li>
	<li>脂肪組織由来の SVF の最後の 3-4 mL のみを残して、遠心分離機キットの下の最後の 3-4 mL まで 30 mL シリンジ バレルを押してください。上清は破棄されます。</li>
	<li>プランジャーの上部から 30 mL シリンジを外し、リンゲル液 (D5LR) で 5% ブドウ糖で注射器を埋めます。</li>
	<li>満ちている D5LR を開くプランジャーの上に 30 mL シリンジを取り付けたいで埋める D5LR と、脂肪組織由来の SVF の 3-4 mL を含む遠心分離機キット 55 mL。</li>
	<li>30 mL シリンジを取り外して、プランジャーをキャップ 4 分の 300 × gで遠心分離キットを遠心分離します。</li>
	<li>4 洗浄液の合計は 2.17 2.21 の手順を繰り返します。使用されるコラゲナーゼは異種です。したがって、ほとんどのコラゲナーゼが 4 洗浄液によって削除されます。しかし、FDA の承認プロトコルの微調整必要があります最終巻でコラゲナーゼ残留物を完全に除去するコラゲナーゼ残留量は、臨床を持っていない患者のため十分無視できるが副作用。</li>
	<li>4回遠心分離後注入の最終的な SVF を得るために安全キャップと遠心分離機キットの下部の開口部にプラグインせず削除揺れや遠心分離機キットを回します。</li>
	<li>遠心分離機キット下部の特別に設計されたコネクタを使用して開口部に 20 mL 注射器を接続します。</li>
	<li>遠心分離機キットの下部に定住している細胞を揺るがす、前後数回注射器のプランジャーを引きます。</li>
	<li>他のセルおよびティッシュと一緒に Asc と ECM の両方を含む SVF の目的の合計ボリュームを削除 (通常各遠心分離機用膝関節注射から約 3-4 mL)。</li>
</ol>3. 生殖不能の技術、PRP 作製
<ol><li>Asc と ECM 準備中、自家血液抗凝固薬クエン酸デキスト ロース溶液 2.5 mL と 30 mL を描画します。</li>
	<li>60 mL 遠心分離機キットに描かれた血を転送します。</li>
	<li>730 x gで 5 分で描かれた血液を遠心し、新しい 60 mL 遠心分離機キットに上澄みを除去します。PRP の 3-4 mL の結果、4 分間 1300 x gで上清を遠心します。</li>
	<li>10:2 の比率で 3% (w/v) 塩化カルシウムを追加注入の直前 (PRP: 塩化カルシウム, v: v) アクティブに PRP を。</li>
	<li>塩化カルシウムとアクティブ PRP に 0.5% (w/v)、足場としての HA を追加します。塩化カルシウム、アクティブ PRP、と共に、ECM とこれらの Asc、HA ASC/ECM 混合物の略します。</li>
</ol>4. ASC/ECM 混合ベースの治療法
<ol><li>5 %betadine で患者の膝をきれいにし滅菌方法でドレープします。</li>
	<li>脛骨と大腿骨の骨間関節腔の膝の前部を触診します。</li>
	<li>関節包外だけ皮膚から希薄リドカイン (通常生理食塩水 4 mL で希釈し 1% リドカイン 1 mL) を表面的に注射部位を麻酔します。</li>
	<li>(1 mL 0.75% ロピバカイン通常生理食塩水 3 mL で希釈) 希釈ロピバカインによる関節包の中を麻酔します。</li>
	<li>SVF の注射器・注射器・ コネクタを 20 mL の注射器に含まれる 6-8 mL に HA のミックス 2 mL。</li>
	<li>注射器・注射器のコネクタを使用して、自家既に準備されている PRP と 5 mL の注射器に準備ができている 3-4 mL に塩化カルシウム 0.4 mL を追加します。</li>
	<li>8-10 ml の注射器に注射器コネクタ経由で20 mL の注射器で HA/SVF 混合物の 5 mL シリンジで PRP/カルシウム塩化物の 3.5 から 4.5 mL を組み合わせます。</li>
	<li>すぐに超音波ガイダンスの有無、38 mm 18 ゲージ針を使用して膝の前方脛骨大腿関節にゆっくり混合物 (約 12-15 mL) を注入します。</li>
	<li>注入後 4 回 4 x 4 綿ガーゼを折りたたみして折り返しの 4 x 4 ガーゼ上にテープを置く圧力で注入部位を包帯します。</li>
	<li>細胞接着のように 60 分間まだ残るように患者に指示します。</li>
	<li>ための活動を制限するように患者に指示クリニックから退院後 1 週の最小限。</li>
	<li>PRP の 3 週間にわたって塩化カルシウムによる活性化の 3 つの追加の注射のためにクリニックに戻ります。</li>
</ol>5. 治療後のフォロー アップ
<ol><li>2、4、および 16 (18 または 22) の視覚アナログ スケール (VAS) の面で痛み改善と理学療法のパラメーターの点で機能改善のための週で患者を評価します。前述の26,27と機能性評価指数 (金)、VAS、・運動 (ROM) の範囲を決定します。</li>
	<li>治療後治療後 MRI 3 ヶ月で患者に従ってください。</li>
</ol>

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著者が明らかに何もありません。

2001 年、Zukら。コラゲナーゼ6コラーゲン マトリックス分解による脂肪組織から幹細胞を分離。その後、グループは示した証明これらの幹細胞が起源の間葉系軟骨と中胚葉起源の他の組織に脂肪組織由来幹細胞を変えるかもしれないことでしょう。
同様に、この資料に示す手順は、人間の患者に同じような方法を適用する変更されたプロトコルです。プロトコルの主要な変更を取得し、手順を実行の容易さを維持しながら空気の接触を最小限に抑えるために、成人の処理でクローズド システム注射器の混入であります。このような閉鎖系の注射器を使用して、脂肪組織で脂肪吸引が得られました。その後、成人クローズド システム注射器内のコラゲナーゼと混合。その後、コラゲナーゼはクローズド システム シリンジ内コラゲナーゼ濃度を希釈して混合物から削除されました。最終的な結果は、プロセスを容易に得られる滅菌脂肪組織由来の SVF です。
同様のメソッドを使用して、朴を示した 2011 年初めて、潜...

間葉系幹細胞 (Msc) は、軟骨1,2,3,4,5,6を再生成する機能を持っている知られています。さまざまなソースから簡単に取得することができます: 骨髄、臍帯血、および多くの他の中の脂肪組織。これらのソースの中から脂肪組織は臨床設定7,8で軟骨を再生する文化拡張なし MSCs の十分な数を得ることが、唯一の情報源です。自家骨髄間質血管の分数 (SVF) は、同様に簡単に取得できます。ただし、非文化拡大骨髄に含まれる幹細胞の数は非常に低い7,8です。臍帯血は、MSCs の十分な数を含めることができます。しかし、臍帯血は、自家の SVF の容易に利用可能なソースではありません。
臨床応用には、SVF を取得する処理脂肪組織の多数の方法があります。このうち、コラゲナーゼを使用して脂肪組織から MSCs を得る方法を開発し、Zukらによって確認5,6が非常によく受け入れられます。コラゲナーゼを使用してこのメソッドは、整形外科領域における臨床応用のために変更されています。臨床現場に適用するためにシステムは、利便性を保ちながら、無菌性を維持するためにクローズド システムをする必要があります。この記事で示す 1 つの特定の変更には、成人の均質化が含まれます。小さい大きさで分類された成人は脂肪組織の不均一な破壊の結果として大きいものよりも比較的速く消化されます。また、これらのより大きい大きさで分類された成人関節注射9,10を実行しながら注射器や針を詰まらせることができます線維性の組織を生成可能性があります。成人はこれらの問題を防ぐために、切削し、コラゲナーゼの孵化前に成人をミンチが均質にする可能性があります。結果脂肪組織由来 SVF は、均質化11ではない成人と比較してより均一の細胞外のマトリックス (ECM) を含めることができます。SVF に含まれる壊れた ECM は、足場12として動作可能性があります。
2009 年に韓国食品・医薬品管理 (KFDA) 医師13によって最小限の処理と医療施設内で処理されるとき自家脂肪組織由来 SVF を許可されています。その後、自家脂肪組織由来 SVF は、潜在的再生軟骨様組織10,14,15によって変形性関節症 (OA) 患者の膝関節機能を改善するために潜在的なエージェントとして利用されています。,16,17,18. 
2011 年、朴は最初に示した, 脂肪組織由来幹細胞 (Asc) 脂肪組織由来 SVF に含まれる血小板を注射されたとき人間の OA 患者の軟骨のような組織を再生可能性がある膝機能を改善できること血漿 (PRP) 14。さらに、朴らは 2013 含む 91 患者における安全性データを報告しています。この安全性データで報告された平均有効率は 6715だったその後、朴らによる追加研究はメニスカス涙と軟骨軟化症蓋10,16,17 患者の軟骨様組織の再生のために可能性がある改善膝機能を示した ,18。報告の記事に基づいて、それはこの記事で示されるプロトコルによって処理される脂肪組織の 100 g に含まれる幹細胞の数が患者の特性8,によって 1,000,000 40,000, 000 から及ぶかもしれない知られています。19,20,21,22,23。
HA と塩化カルシウムとアクティブ PRP 自家脂肪組織由来 SVF を使用して人間の膝 OA の臨床プロトコルを紹介します。201114に、無菌性を維持するために、手動閉鎖系を含む、この臨床プロトコルの最初のバージョンが報告されました。同一のプロトコル、不妊を維持することに最適化された、2013 と 201610,15で報告されました。ここでは、最適化されたプロトコルが表示されます。プロトコルの概略概観は、図 1で示されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58363/58363fig1.jpg"> 図 1: プロトコルの図式的な概観します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58363/58363fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table><tbody><tr><td><強い>素材</強い></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5%ベタジン(ポビドンヨード)&nbsp;</td><td>ファーソン(株)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>657400260 2%リドカイン&nbsp;</td><td>大韓製薬(株)</td><td></td><td></td>670603480</tr><tr><td>Tumescent ソリューション&nbsp;</td><td>(株)明文製薬</td><td>N01BB01</td><td>溶液は、500 mL の生理食塩水、40 mL の 2% リドカイン、20 mL の 0.5% マルカイン、および 0.5 mL のエピネフリン 1:1000 で構成されていました。</td></tr><tr><td>Liberase TLおよびTM研究グレード&nbsp;</td><td>ロシュ・アプライド・サイエンス</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>D5LR</td><td>Dahan Pharm. Co., Ltd.</td><td>645101072</td><td>デキストロース 5% 乳酸リンゲル液&nbsp;</td></tr><tr><td>抗凝固剤クエン酸デキストロース溶液&nbsp;</td><td>フェンウォル株式会社</td><td>NDC:0942-0641</td><td>溶液は、0.8%のクエン酸、 、0.22%のクエン酸ナトリウム、および0.223%のデキストロースで構成されていました。</td></tr><tr><td>3%(w / v)塩化カルシウム&nbsp;</td><td>Choongwaeファーマシューティカル株式会社</td><td></td><td></td>644902101</tr><tr><td>0.5% (w/v) HA (ヒアルロン酸)</td> <td>Dongkwang pharm. Co., Ltd.</td><td></td><td></td>645902030</tr><tr><td>0.25% ロピバカイン</td><td>Huons Co., Ltd.</td><td>670600150</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.0mmカニューレ&nbsp;</td><td>ウジュウジュメディカルインスツルメンツ(株)</td><td></td><td></td>ML30200</tr><tr><td>60mLルアーロックシリンジ</td><td>BD(ベクトン・ディキンソン社)&nbsp;</td><td></td><td></td>309653</tr><tr><td>遠心分離機バレルキット&nbsp;</td><td>CPL株式会社</td><td>30-0827044</td><td></td></tr><tr><td>ブレード入り組織ホモジナイザー</td><td>CPL株式会社</td><td>30-0827045</td><td></td></tr>回転<tr><td>インキュベーターミキサー</td>メディ<td>カン株式会社</td><td>MS02060092</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Hanil</td><td>Scientific Inc.</td><td>CE1133</td><td></td></tr><tr><td>磁気共鳴画像法フィ</td><td>リップスメディカルシステムズ株式会社</td><td>18068</td><td></td></tr><tr><td>超音波画像診断システム</td><td>Samsung Medison co., Ltd</td><td>CT-LK-V10-ICM-2007.05.09</td><td></td></tr></tbody></table>

潜在的な軟骨再生のための脂肪組織由来間質血管分数の生産の臨床プロトコル

Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration

変形性関節症 (OA) は、最も一般的な衰弱性疾患の一つです。最近では、間葉系幹細胞 (MSCs) の別のフォームを使用して、膝の機能を向上する多数の試みがされました。韓国・濃縮骨髄・臍帯血由来幹細胞は、軟骨再生の韓国食品や薬剤の管理 (KFDA) によって承認されています。さらに、脂肪組織由来の間質血管分数 (SVF) は、人間の患者に関節注射の KFDA によって許可されています。自己脂肪組織由来の SVF では、間葉系幹細胞に加え、細胞外マトリックス (ECM) 含まれています。ECM は、ヒアルロン酸 (HA) と多血小板血漿 (PRP) 塩化カルシウムによって活性化されると共に、MSCs は、軟骨を再生し、膝の機能を向上するさまざまなサイトカインを排泄します。この記事では OA の人間の患者の軟骨様組織の再生によって膝の機能を向上するためのプロトコルを提案します。プロトコルの結果は、いくつかの追加の出版物によって 2011 年に初めて報告されました。プロトコルには、コラゲナーゼを混ぜて自家の成人を取得する脂肪吸引が含まれます。この成人コラゲナーゼの混合物はカットし、注入時に針を詰まらせる可能性があります大規模の線維性組織を除去する均質化します。その後、混合物は、脂肪組織由来の SVF を取得する培養です。HA と組み合わせて、患者の膝に脂肪組織由来 MSCs と ECM の残党を含む結果脂肪組織由来 SVF を注入し、塩化カルシウムは、PRP を活性化します。膝の痛み, 腫れ, と硝子軟骨様組織の MRI 証拠とともに可動域が改善された私たちのプロトコルによる治療を受けた患者の 3 例には含まれます。

3 人の患者 (87 歳女性とステージ 3 OA、1 つの 68 歳の男性で 1 ステージ 3 OA と 1 つの 60 歳女性とステージ 3 OA) 潜在的な重要な過去病歴永続的な膝の痛みでクリニックに提示、必要のないです。自己脂肪組織由来の「svf」治療。3 例はすべて整形外科医によって検討した自分の膝を持っていた人工膝関節置換術 (TKR) に提供され、手術を受けることに消極的であった。前の手順、すべての 3 人の患者は長期改善せずステロイドと HA の複数の注射を受けていた。
87 歳の韓国女性患者, 検査時間激痛を訴えた (VAS スコア 8;図 2 a)残りの部分で。彼女は増加する痛みを説明 ([金: 37;図 2 a)ときに階段の昇降。物理の試験で軽度の関節 ROM 低下、屈曲 (<strong class="xfig"...

ここでは、脂肪組織由来の間質血管分数と変形性関節症の軟骨様組織の再生によって膝機能の改善への応用を生成するプロトコルを提案する.

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the ...

変形性関節症は、高齢者の間で最も一般的な衰弱性疾患の一つです。現在、変形性関節症の根本的な原因に対する明確な治療法はありません。この臨床プロトコルは、組織のような軟骨を再生することによって、ヒト膝変形性関節症の有望で低侵襲的で代替的な治療のための革新的な手順を記述する。変形性関節症は、高齢者の間で最も一般的な衰弱性疾患の一つです。現在、変形性関節症の下線の原因に対する明確な治療法はありません。この臨床プロトコルは、軟骨様組織を再生することにより、ヒト膝変形性関節症の有望で低侵襲で代替治療のための革新的な手順です。バイオハザードクラスAフードを持つ手術室に患者を連れて来て、彼または彼女を説得力のある位置に置きます。5%ベタジン-ポビジンヨウ素で患者の腹部を洗浄し、無菌技術を使用して患者をドレープし、脂肪吸引のために腹部のきれいな領域を露出させます。臍帯から約5センチメートルの陰性に、左と切開の右側の2つの部位を麻酔する。エピネフリンを含まない2%リドカインの2ミリリットルを、表皮レベルで各部位を注入することにより、5ミリリットルシリンジに25ゲージ1.5インチの針を用いた。5ミリリットルのチュームセント溶液と10ミリリットルの注射器と針25ゲージ1.5インチを使用して行われる切開部位を麻酔します。皮膚をつまんで皮下の深さを上げることで、臍の下に約5センチメートル下の0.5センチメートルの2つの切開を行います。番号11の刃を使用して、上げられた皮膚が皮下レベルまで浸透するのに役立ちますが、腹壁を貫通しないようにします。20センチメートル60ゲージカニューレを使用することにより、700〜800ミリリットルの房液で脂肪吸引される下腹部領域全体の皮下レベルを麻酔する。下腹部全体に浸透した後、手動脂肪吸引用または遠心分離キットに接続された3.0ミリメートルのカニューレを手動で使用するために、60ミリリットルまたは30ミリリットルの注射器に接続された3.0ミリメートルのカニューレを接続して脂肪吸引装置を準備します。クローズドシステムシリンジは、真空補助脂肪吸引のために真空機械に接続された無菌性を維持する目的で、FDA CDRHによって開発され、承認されました。脂肪吸引を行い、房液を除いた脂肪組織の100〜110グラムを得た。脂肪吸引を行う場合、脂肪組織は、房状溶液と一緒に得られるが、分離して除去する必要があります。最初に房状溶液を重力によって分離するために、遠心分離機キットの脂肪組織を60ミリリットルのシリンジに移し、注射器を下に置くことができる。例えば、シリンジの開口部部分は底部にあります。5~6分待つことで、脂肪組織と房液が分離されます。シリンジプランジャーの上部を押して、シリンジの底の流体を取り除きます。膝当たりの脂質吸引脂質の100グラムから110グラムの合計が蓄積されるまで、上記のステップ9〜11を行う。火口液を重力で分離し、各60ミリリットル遠心分離キットの無菌閉じたシステムごとに50グラムから55グラムの脂質吸引装置を蓄積した後、2つの遠心分離機キットを遠心分離容器バケツに入れ、1600 Gで5分間回転し、脂質吸引を凝縮し、脂肪組織から液体を分離する。このプロセスは、さらに脂質吸引を凝縮し、特定の場合に脂肪油を産生する可能性がある。振らないために、遠心分離機キットの下部にある安全キャップとプラグを取り外します。遠心分離機キットのプランジャーの上にゆっくりと押し下げて下液を取り除きます。別々の60ミリリットルシリンジで、コラゲザーゼ10ミリグラム、結合組織に特異的な5ミリグラムのコラゲターゼ、および正常な生理食塩水の50ミリリットルの脂肪組織に特異的なコラゲターゼの5ミリグラムを溶解する。約25〜30ミリリットルの凝縮脂質吸気物を溶解したコラゲナーゼと混合コラゲターゼ、結合組織に特異的なコラゲナーゼ5ミリグラム、脂肪組織に特異的なコラゲナーゼ5ミリグラムを1対1の比率で、体積対体積で、60ミリリットルシリンジを遠心分離機キットに特殊なコネクタを使用して混合します。ロッドまたはプッシャーを使用して、60ミリリットルのシリンジと遠心分離機キットの間の内容を押し出すことによって、準備吸引とコラゲナーゼを凝縮するために十分に混合します。脂質吸気とコラゲエーゼの混合物を60ミリリットルのシリンジに戻します。各60ミリリットルのシリンジを、ブレードを含む組織ホモジナイザーと混合して接続します。空の60ミリリットルのシリンジをホモジナイザーのもう一方の端に接続します。混合物をホモジナイザーを通して他の60ミリリットルのシリンジに4〜6回押し込み、脂質吸引の切断とミンチを生じる。均質化された脂質吸気およびコラーゲン混合物を特殊なコネクタを介して60ミリリットル遠心分離機キットに戻します。遠心分離機キットを容器に入れ、摂氏37度で予熱したインキュベーターに入れます。45 rpmで回転しながら、37°Cで均質化した混合物を2つの遠心分離機キットを40分間インキュベートします。40分間のインキュベーションの後、滅菌方法でインキュベーターから容器を取り出します。次に遠心分離機のキットを取り外し、遠心分離機に入れます。800Gで5分間遠心分離し、脂肪組織由来のSVFを分離する。遠心分離機の後、コラゲナーゼと消化脂肪組織を含む上清は、プランジャーの上にシリンジキャップを取り除き、シリンジロック接続を介してプランジャー開口部に30ミリリットルの注射器を置くことによって、各遠心分離機キットから取り除かれます。30ミリリットルのシリンジをゆっくりと押し下げて上清を入れ、30ミリリットルのシリンジを充填します。遠心分離キットの底の最後の3〜4ミリリットルまで30ミリリットルのシリンジバレルを押し下げ、脂肪組織由来のSVFの最後の3〜4ミリリットルだけを残します。上清は破棄されます。プランジャーの上部から30ミリリットルのシリンジを取り出し、D5LRとしても知られている5%デキストロースラクチンゲル溶液でシリンジを充填します。プランジャー開口部の上部にD5LRで満たされた30ミリリットルのシリンジを取り付けることで、脂肪組織由来SVFの3〜4ミリリットルを含む遠心分離キットをD5LRで最大55ミリリットルで満たします。その後、30ミリリットルのシリンジを取り出し、プランジャー開口部をキャップし、遠心分離機キットを300 Gで再び遠心分離機を約4分間遠心分離します。合計 4 回の洗浄に対して、手順 17 から番号 21 を繰り返します。4回目の遠心分離機の後、最終的なSVFを射出用に得るために、遠心分離機キットを振ったり回したりすることなく、遠心分離機キットの下部開口部にある安全キャップとプラグを取り外します。特別に設計されたコネクタを使用して、20ミリリットルのシリンジを遠心分離機キットの底口に取り付けます。20ミリリットルのシリンジのプランジャーを数回前後に引っ張り、遠心分離機キットの底に落ち着いた細胞を揺さぶります。ASTとECMの両方を含むSVFの所望の総容積を他の細胞および組織とともに除去する。通常、膝関節注射用の各遠心分離機キットから約3〜4ミリリットル。我々は抗凝固薬クエン酸デキストロース溶液の2.5ミリリットルと一緒に自家血の30ミリリットルを行った。その後、引き出された血液を60ミリリットル遠心分離機バレルキットに移した。その後、730重力で5分間遠心分離した。そして上清を取り除き、新しい60ミリリットル遠心砲身キットに入れました。上清を1350重気で4分間遠心し、PRPの4.4ミリリットルを得た。5%ベタジンで患者の膝をきれいにし、滅菌的な方法でそれをドレープする。脛骨と大腿骨の間の関節空間のために膝の前部を触診する。注射部位を表面的に希釈リドカインで麻酔し、1%リドカインを4ミリリットルの通常の生理食塩水で希釈し、皮膚から関節カプセルのすぐ外に挿入する。次に、関節カプセルの内部を希釈ロピバカイン、1ミリリットル0.75%ロピバカインを3ミリリットルの通常の生理食塩水で希釈して麻酔します。20ミリリットルのシリンジに含まれるSVFの6〜8ミリリットルに2ミリリットルのHAをシリンジコネクタにシリンジを介して混合します。注射器から注射器へのコネクタを使用して、すでに準備され、5ミリリットルの注射器で準備されている自家PRPの3〜4ミリリットルに塩化カルシウムの0.4ミリリットルを追加します。5ミリリットルのシリンジに3.5~4.5ミリリットルのPRP塩化カルシウムを組み合わせ、8~10ミリリットルのHA-SVF混合物を注射器から注射器コネクタまで20ミリリットルのシリンジで組み合わせます。直ちに混合物を注入し、約12〜15ミリリットル、膝の前脛骨-大腿部関節にゆっくりと、超音波誘導の有無にかかわらず38ミリメートル18ゲージ針を使用する。射出後、4x4綿ガーゼを4回折り、折り畳まれた4x4ガーゼの上にテープを置くことによって、注入部位を圧力で包帯する。患者に対して、細胞の付着を可能にするために60分間じっとしているよう指示する。患者に対して、退院後1週間の活動を最小限に抑える。3週間にわたって塩化カルシウムによって活性化PRPの3つの追加注射のためのクリニックに戻ります.第3段階のOAを有する患者は、プロトコルセクションに記載されているように治療を受けた。ASV-ECM混合注射の第2週後、患者の痛みおよびROMは改善した。16週目までに、患者の疼痛およびROMは、16週目以降に採取された70%以上のポスト治療MRIを有意に改善し、膝の内側側の軟骨様組織の厚さの増加を示した。第3段階のOAを有する別の患者は、プロトコルセクションに記載されているように治療を受けた。ASV-ECM混合注射の第2週後、患者の痛みおよびROMは改善した。18週目までに、痛みおよびROMは、18週目以降に採取された80%反復MRIに有意に改善し、膝の前内側側の軟骨様組織の高さの増加を示した。第3のOAを有する第3の患者は、プロトコルセクションに記載されているように治療を受けた。ASV-ECM混合注射の第2週後、患者の痛みおよびROMは第22週までに約50%改善し、疼痛およびROMは22週目以降に採取された80%反復MRIを大幅に改善し、膝の内側側の軟骨様組織の高さの増加を示した。現在、OAの治療には治癒療法は利用できません。しかしながら、塩化カルシウムで活性化されたHAおよび類似PRPとともにASCおよび均質化ECMを用いた幹細胞療法の経皮的注射は、膝OAを治療する現在の治療療法に代わるものであってもよい。

clinical-protocol-producing-adipose-tissue-derived-stromal-vascular

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

このプロトコルは、吸引脂肪や骨格再生を評価するための重要な4ミリメートルサイズの頭蓋冠欠損の作成から脂肪由来の間質細胞の単離を説明します。...

吸引脂肪から採取した脂肪由来間質細胞を使用したクリティカル·サイズの頭蓋冠欠損モデルの修復

2001年には、UCLAの研究者は、成体幹細胞の集団の単離を説明した脂肪組織から、脂肪由来幹細胞またはASCをと呼ばれる。この記事では、コラゲナーゼを使用して手動、酵素消化プロトコルを使用して脂肪吸引物からASCの分離の概要を説明します。...

人間の脂肪吸引物からの脂肪由来幹細胞を手動で隔離

ヒト脂肪由来の間質細胞内の転写の不均一性は、細胞表面マーカーと骨形成遺伝子を使用して単一細胞レベルで定義することができます。...

強化された骨形成のためのヒト脂肪由来間質細胞の単離および濃縮

本研究の目的は、microfractured...

自己 Microfractured と距骨骨軟骨損傷の鏡視下手術の管理のための精製脂肪組織

ここでは、一連の機械的なプロセス、乳化および複数の遠心を含む脂肪組織から間質血管の一部を取得するためのプロトコルを提案する.

成人再生療法のための機械的微細化

本プロトコルは、文献と比較して時間的増加を伴う途方もない細胞収量をもたらすADSC単離のための改良された方法論を記載する。この研究はまた、長期凍結保存後に比較的多数の生細胞を得るための簡単な方法を提供します。...

脂肪組織から間葉系幹細胞を得る技術および長期凍結保存における間質血管画分のキャラクタリゼーション

機械的に単離された間質血管画分(SVF)とフィブリンハイドロゲルの組み合わせは、組織工学や創傷治癒目的など、さまざまな適応症で生存脂肪由来の間質細胞の容易で効率的なキャリアを提供します。ここでは、トランスレーショナルリサーチおよび臨床応用のための機械的SVF(mSVF)-フィブリンハイドロゲルコンストラクトの調製について紹介します。...

機械的に単離されたStromal Vascular画分およびFibrinのヒドロゲルの組合せ:処理のプロトコール

ここでは、自家脂肪組織を異なる物理化学的特性と機能を持つさまざまな脂肪成分物質に変換できるプロトコルを紹介します。...

脂肪を特殊な成分に変換するための革新的な脂肪組織分画

腫瘍間質内に存在する筋線維芽細胞の豊富な癌関連線維芽細胞（CAFS）、腫瘍の進行を推進する上で重要な役割を果たす。我々は実験的にヒト乳腺線維芽細胞からCAFSを生成するためのcoimplantation腫瘍xengraftモデルを開発した。プロトコルは、腫瘍形成を促進する能力を身CAFの筋線維芽細胞を確立する方法について説明します。...

ヒト乳腺線維芽細胞からの癌関連線維芽細胞の実験的生成（CAFS）

レーザーマイクロダイセクションでは、実質の微量から選択された細胞の回復を可能にする技術です。ここでは、トランスクリプトーム研究のために使用される手術標本からヒト膵島を取得するためのプロトコルを記述します。我々のプロトコルは、このように彼らのコレクションを容易にして、ヒトβ細胞の内因自家蛍光を向上させます。...

手術標本からヒト膵島のレーザーマイクロダイセクションのために改良されたプロトコル

学ぶ、脂肪組織由来間質血管分数を用いた膝変形性関節症のための軟骨再生プロトコル。この最小侵襲的手法は患者の膝機能改善と組織修復に有効です。

潜在的な軟骨再生のための脂肪組織由来間質血管分数の生産の臨床プロトコル

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