Name: 低血清条件下で心臓前駆細胞の内皮への分化の誘導 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: 学ぶ心臓前駆細胞の内皮分化プロトコル。低血清・低密度・ラミニン基質で効率的に内皮系へ誘導し、心臓再生医療や疾患メカニズム研究への応用を可能にする標準化手法です。

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著者実験と生物医学部 (DBM)、大学、バーゼル大学病院から流れ Cytometry 施設からスタッフの中には彼女の役に立つサポート ベラ ローレンツをありがちましょう。この作品は、滞在のトラック プログラム バーゼル大学から (享香望月) によって支えられました。ガブリエラ m. 型は、スイスの全米科学財団 (許可番号 310030_156953) からの助成金によってサポートされます。

細胞分離目的でマウスの使用スイスの動物保護法とケアと実験動物の使用のためのガイドに従ってされ、スイスのカントン当局によって承認されました。
注: Sca 1+/CD31 の分離-マウスの心臓から SP 単価本質的として行われていたいくつかの変更と前述の34 。材料および使用試薬、材料表を参照してください。すべての実験マウスから分離した心臓の SP クリック単価が増幅、継代、および細胞ラインのような方法で使用されます。7-20 の通路は、この研究に使われました。
1. ティッシュの準備
注: マウスを使用してすべての実験遂行されなければならないガイドラインや規制によると。このプロトコルは、4 個のマウスを使用します。直径 100 mm 培養皿は P100 と呼ばれ、直径 60 mm は、培養皿のプロトコルの次の部分の P60 として記述されます。
<ol><li>200 mg/kg のペントバルビ タールを各マウスに腹腔内注入 (i. p.)、それは完全に摘心をつま先への応答を確認することによって麻酔まで待ちます。</li>
	<li>70% エタノールで胸を拭いてください。皮膚や胸壁を胸腔内を公開するハサミでカットします。</li>
	<li>ピンセットで中心を持ち上げ、はさみを使用してベースでカットします。冷たいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (P100 あたり 3 〜 5 心) または P60 あたり 1 ~ 2 心の 25 mL (P60 の 5 mL) と P100 の心を置きます。</li>
	<li>虫歯 (図 1 a) から血を取り出すに鉗子で心臓をポンプします。</li>
	<li>洗浄用冷 PBS の 25 mL (P60 の 5 mL) と P100 の心を置きます。小さなはさみを使用して心房を削除します。2 つの縦の部分に心をカットし、氷冷 PBS (25 mL/P100, 5 mL/P60) でもう一度洗いましょう。</li>
	<li>25 mL (P60 の 5 mL) の冷 PBS と新しい P100 に作品を転送します。小さいはさみ (図 1 b) を使用してより小さな部分に部分をカットします。1 mg/mL コラゲナーゼ ハンクの平衡塩溶液 (HBSS) で希釈した B のドロップを追加し、剃刀 (図 1) で徹底的に小片をミンチします。</li>
</ol>2. 消化
<ol><li>1.6 のステップから皿に 1 mg/mL のコラゲナーゼ B 溶液の 10 mL (P60 の 2.5 mL) を追加します。</li>
	<li>コラゲナーゼ B 液 (約 30 °) の傾斜でみじん切りにした中心部分を入れて P100 (または P60) 37 ° C の定温器 (図 1)。</li>
	<li>みじん切りにした心最大 30 分の小品を孵化させなさい繰り返しにすべて 10 分パスツール ピペットを孵化 (図 1E) の間にそれらを渡すことによって均質化します。 注: 手順 1.3 の合計のインキュベーションの 30 分を超えないようにすることが重要です。</li>
</ol>3. ろ過
<ol><li>2% を添加した冷たい HBSS の 10 mL (P60 の 5 mL) を追加みじん切りと均質化の中心部分に FBS。 注: HBSS 2 %fbs 渇きコラゲナーゼ B を添加しました。</li>
	<li>未消化の組織と 470 × gで遠心する部屋の温度 (RT) (図 1 階、黄色フィルター) で 5 分間を削除する 100 μ m のフィルターを通しての心の部分をフィルターします。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、赤血球細胞換散バッファーの 5 mL (P60 の 3 mL) でペレットを再懸濁します時折揺れ氷の上で 5 分のペレットを孵化させなさい。</li>
	<li>(溶解反応を停止) する PBS の 10 mL (P60 の 5 mL) を追加し、残存心筋細胞 (図 1 f、青のフィルター) を含むより大きい細胞を除外する 40 μ m のフィルターを通してサンプルをフィルターします。</li>
	<li>(ブレーキ無) 常温 5 分 470 x gでチューブを遠心します。上澄みを廃棄し、10% を含む DMEM の 1 mL にペレットを再懸濁します FBS。</li>
	<li>診断と因数のセルをカウントします。10% を含む DMEM に細胞を再懸濁します FBS、1 x 106セル/mL の最終的な細胞濃度を目指してします。 注: 約 5 × 106心筋細胞と赤血球減らさセルをマウスあたり推定できます。</li>
	<li>2 つの管 (図 2) にセルを配布:管 A、ヘキスト 33342 染色ベラパミル; 1.5 mL を追加チューブ Bのヘキスト 33342 染色 18.5 mL を追加し、染色やフローサイトメトリーによる (手順 4.1 と 4.2) 心臓 SP セルを並べ替えるに進みます。</li>
</ol>4. フローサイトメトリーによる心臓 SP 細胞の並べ替え
注: ベラパミルは、多剤耐性 (MDR) ABC トランスポーターの活性をブロックすることによってヘキスト流出を抑制します。Hoechst 33342 は DNA 結合色素細胞内 DNA 量と相関するそれとして細胞周期を検出する使用できます。ヘキスト 33342 押し出しセル両方放出チャネルのヘキストの低い部分に表示 (450 nm、ヘキスト ブルー; 650 nm、ヘキスト ・赤)、ヘキスト-保持「主な人口」、その名前「側人口」を与えての脇は、。SP 細胞性前駆細胞で濃縮され、(MDR1 と ABCG2) などの多剤耐性の ABC トランスポーターの高発現を示します。Hoechst 33342 はプロトコルの次の部分のヘキストとして書き込まれます。理想的な結果を得るのための光に敏感な材料を保護するために重要です。
<ol><li>
ベラパミルの有無でヘキスト染色
	<ol>
<li>携帯ソリューション (83.3 μ M の最終的な集中) とベラパミルとヘキスト (最終濃度 5 μ g/106セル) を追加します。チューブ A、ベラパミルとヘキスト; を使用します。チューブ B、ヘキストをのみ使用します。90 分 (37 ° C) で水浴の孵化し、チューブ 20 分毎に (図 1) を元に戻します。</li>
		<li>破棄した上清で 5 分間 470 x gでチューブを遠心し、HBSS (1 x 10 の6セル/mL) でペレットを再懸濁します。</li>
		<li>単一の染色、ネガティブ コントロールチューブ B (図 2) からの分注 1.5 mL を取る: (i) かに (FITC)-共役アンチ-Sca-1;(ii) アロフィコシアニン (APC)-共役アンチ CD31;(iii) nonstained 細胞 (マイナス コントロール)。 注: アイソタイプ コントロールを使用ここで隔離のプロトコルを設定するため。</li>
		<li>遠心分離機管と RT で 5 分間 470 x gで単一染色およびネガティブ コントロール因数のヘキストとベラパミルを洗浄するため。</li>
		<li>上澄みを廃棄し、管 A及び (iii) HBSS の 250 μ L のネガティブ コントロールのペレットを再懸濁します並べ替えまで暗闇の中で氷の上にそれらを保ちます。</li>
		<li>再懸濁しますチューブ Bのペレット HBSS の 200 μ L と (i、ii) ペレット HBSS の 100 μ L の単一染色因数。FITC 結合抗-Sca-1 (0.6 μ g/107セル) と APC 共役アンチ CD31 (0.25 μ g/107セル) を追加します。氷の上で 30 分間ペレットを孵化させなさい、時から暗闇の中でそれらを振る。</li>
		<li>チューブに HBSS の 2 mL を追加します。室温 5 分 470 x gでチューブを遠心分離します。</li>
		<li>上澄みを廃棄し、HBSS の上として遠心 1 ml すべてペレットを再懸濁します。培養上清を捨てます。HBSS の 200 μ L で単一染色因数のペレットを再懸濁します。HBSS (20 × 10 の6セル/mL) にチューブ Bのペレットを再懸濁します。</li>
		<li>氷のサンプルを維持し、選別までの光から保護します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
フローサイトメトリーによる並べ替え
	<ol>
<li>滅菌 1.5 mL 500 μ L 2% を含む HBSS のチューブを並べ替えを準備政府短期証券。</li>
		<li>死んだ細胞を除外する 10 分間氷の上 7 aminoactinomycin D (7 AAD) (0.15 μ g/106細胞) の細胞を染色します。</li>
		<li>次の設定を使用して心臓の SP を並べ替える: 350 nm (紫外線) 励起を使用してヘキストをエキサイト 450/50 nm バンドパス フィルター (ヘキスト ・青) と 670/30 nm バンドパス フィルター (ヘキスト ・ レッド)、蛍光性の放出を収集し、ノズル径は 100 μ m との圧力を使用15 psi。</li>
		<li>分析のため並べ替えのサンプル 5 x 105イベントとネガティブ コントロール、ベラパミルの制御、およびシングル染色の 1 x 10 の5イベントを記録のサンプル。 注意: SP は約 0.5% - 心臓 2% (図 1 H) であるが、研究所および隔離集団の間で変わる。Sca 1+/CD31-の割合は約 1% の合計心臓 SP (図 1I) の 11% が研究所と分離株の間に異なる場合があります。Sca 1+/CD31- SP クリック単価は、SP - プロトコルの次の部分のクリック単価として書き込まれます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 培養分離 SP 単価
注: 3 つの異なる種類のメディアは、このプロトコルで使用されました。(Nosedaら) によると中の 1 として呼ばれます8中 2 と中 3 はその組成に関する材料の表に記載されています。
<ol><li>媒体を使用する前に 1 に 37 ° C をウォーム アップし、4 ° C に冷却4 ° C および 470 x g 6 分で並べ替えのチューブを遠心し、中 1 の細胞を再懸濁します。</li>
	<li>中 1 の 4 ml ガス透過性 P60 皿の上のセルを置きます。セルが 70-80% の合流点に達するまでは、媒体ごとの 3 d を変更します。 注: ステップ 5.2 は約 2-3 週間かかります。</li>
</ol>6. 拡張と SP クリック単価の分化
<ol><li>
細胞培養
	<ol>
<li>3 x 105 8 T75 フラスコで培地 1 mL SP クリック単価の文化.</li>
		<li>SP クリック単価を 5% CO2と 37 ° C で 70-80% の合流点、媒体ごとの 2-3 d を変更するまでインキュベートします。 注: セルの数は、使用単価の種類、倍加時間とセル サイズに従って修正されるべき。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SP のクリック単価の成長と異なる血清濃度下での生存率
	<ol>
<li>文化の SP-クリック単価 8 ml 中 1 の T75 フラスコ 2 3 d。慎重に培地を吸引し、暖かい (37 ° C) HBSS の 5 mL で軽くすすいでください。</li>
		<li>5 ml のトリプシン-EDTA のセル インキュベーターで 5 分のセルを扱うトリプシン処理を停止する中 1 の 5 mL を追加し、15 mL チューブに細胞懸濁液を転送します。</li>
		<li>470 x g室温に 5 分で細胞を遠心分離します。</li>
		<li>中 1 中 2 (リネージュ誘導培地) やプレート 2.5 x 105 SP-クリック単価の異なる血清を含む培地 3 ml P60 料理に細胞を再懸濁します。</li>
		<li>中 1 か中 2 で養殖の 2 d の後ステップ 6.2.4 15 mL チューブに死んだ細胞のコレクションのための皿から媒体を収集します。</li>
		<li>6.2.2 の手順と付着性のセルを trypsinize し、ステップ 6.2.5 15 mL のチューブに細胞懸濁液を収集します。840 x g室温に 5 分で細胞を遠心分離します。</li>
		<li>上清を吸引し、1 mL 中 1 か中 2 のセルをカウントするを追加します。SP-クリック単価トリパン ブルー (0.4%) とカウント トリパン ブルー陽性 (死んだ) とトリパン ブルー陰性 (実行可能な) 細胞を染色します。 注: セル実行可能性 (ステップ 6.2.7) は総細胞数との相対トリパン ブルー負のセル数として与えられます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
内皮への分化の誘導
	<ol>
<li>ラミニン (LN), フィブロネクチン (FN) の 10 μ G/ml (6 ウェル) 培養プレートをプレコートします。<ol>
<li>LN または FN の 10 μ G/ml F12 媒体 (または PBS) を含む基板の解決を確認します。基質溶液 2 mL を各ウェルに加えます。37 ° C で 30 分間プレートを維持します。</li>
			<li>プレートから洗浄液を吸引し、それを使用してまで各ウェルに 2 mL の PBS を追加します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>ステップ 6.1.2 から細胞から培地を吸引、優しく暖かい (37 ° C) HBSS の 5 mL で洗浄し、細胞のインキュベーターで 5 分トリプシン-EDTA の 5 mL とそれらを扱う、トリプシン処理を停止する中 1 の 5 mL を追加し、15 mL チューブに細胞懸濁液を転送します。</li>
		<li>470 x g吸引した上清を 5 分で細胞を遠心し、細胞数の中 2 を追加します。</li>
		<li>シード 8 × 104セルあたり 3 ml 中 2 のコーティング プレートによく 3 培地 3 mL に 20-24 変更媒体のための 37 ° C で保管してください。 注: 低血清を含む培地を使用してお勧め-サプリメントなし -最初の 20-24 時間。使用を推奨します < 60% セル合流 (すなわち、ステップ 6.3.4 のセル数はセルのサイズと成長率に応じて調整する)。</li>
		<li>21 d 細胞の培養、培地ごとの 3 d を変更します。</li>
		<li>フォンヴィレブランドなど血管内皮マーカーとそれらの汚損によって分化した細胞の内皮細胞の性質を確認因子 (vWF) と実行する蛍光顕微鏡。<ol>
<li>1 ml の PBS のセルを洗浄し、右で 2 分間 3.7% ホルムアルデヒドのセルを修復します。</li>
			<li>0.1% トリトン X ddH2O (または PBS) で 30 分でセルを permeabilize し、ブロックは、室温 1 時間 10% ヤギ血清</li>
			<li>抗 von Willebrand 因子抗体 (1: 100) 4 ° C で 48 時間で細胞をインキュベートします。</li>
			<li>3 セルを洗って 10 分たびに 1 mL の PBS、x。暗闇の中で常温に 1 時間は、Alexa Fluor 546 ヤギ抗うさぎ二次抗体 (1: 500) とそれらを孵化させなさい。</li>
			<li>洗って再び 3 倍、10 分の 1 ml の PBS の。暗闇の中で常温の 5 分の 4'6-diamidino-2-phenylindole、塩酸 (DAPI; 1: 500) と細胞核を染色します。</li>
			<li>洗浄セル 3 x、5 分ごとに、1 ml の PBS の。セルをマウントし、4 ° C で保存 注: 手順 6.1 と 6.3 の培養条件 (基板、媒体、補足的な試薬、FBS 濃度) は図 3のとおりです。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
管形成アッセイ
	<ol>
<li>基底膜マトリックス (例えばマトリゲル、今後マトリックスと呼ばれる) を準備板。<ol>
<li>4 ° C で行列を一晩解凍します。</li>
			<li>氷の上のマトリックスの 100 μ L で 96 ウェル プレートをコートします。 注: マトリックス内のすべての泡を避けるために重要です。プレートはマトリックスの jellification を避けるために氷の上にコーティングする必要があります。</li>
			<li>30 分の 37 ° C でプレートを維持します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>(ステップ 6.3.5 の完了) 後細胞から培地を吸引、優しくリンス暖かい (37 ° C) HBSS、5 mL の細胞と細胞のインキュベーターで 5 分トリプシン-EDTA とそれらを扱います。トリプシン処理を停止し、15 mL チューブに細胞懸濁液を転送中 3 を追加します。</li>
		<li>470 x g吸引した上清を 5 分で細胞を遠心分離機、優しく中 3 のピペット 1 mL を追加します。</li>
		<li>セルの集計の場合は、35 μ m の細胞ストレーナー付けセルを抽出します。</li>
		<li>セルをカウントでマトリックス コートもそれぞれで中 3 の 100 μ L の 4 x 103セルに 2 x 103をシードします。37 ° c 16 h のため細胞のインキュベーターでプレートを維持します。</li>
		<li>2 倍の倍率に明視野顕微鏡で写真を撮る。 注: 場合、不完全な trypsinization トリプシン-EDTA を最大 7-8 分の露光時間を長引かせます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

このプロトコルの利点:
このプロトコルは、クリック単価の内皮への分化技術を提供します。低血清濃度と細胞密度が低いが LN がこれらの条件の下で FN よりもより適切な基質をあることを証明という内皮への分化の効率を改善できるとわかった。クリック単価の 2 つのタイプを使いました: ラット分離され拡大した単価を細胞ラインのような方法とマウス SP クリック単価で使用されました。特に、プロトコルが両方の種類に該当する単価。 現在の技術は分離し、遺伝子改変マウス、前臨床の疾患モデルおよび人間28,36からプライマリ クリック単価を展開する科学者を許可します。分離のクリック単価にこのプロトコルを使用してだけでなく疾患のメカニズム解明に新たな治療標的の探索にも役に立つかもしれません。
単価細胞療法4、5細胞は<e...

最近の研究は大人の哺乳類心臓1,2,3居住者心臓前駆細胞 (クリック単価) の存在をサポートし、単価後心臓傷害4,細胞療法の有用な源になりうる5します。 さらに、拡張クリック単価が薬剤スクリーニングの有益なモデルを提供する、6、7モデルのまれな心筋症患者やそれぞれの病気から分離したときの疾病のメカニズムの調査研究。
成人の心臓から分離されたクリック単価が幹細胞/前駆細胞特性1,2,3,8を所有している彼らは、多能性、クローン、自己複製の能力を持っているとします。ただし、単価の異なる表面マーカー プロファイルを含む、たとえば、c キット、Sca 1、および他を展示または別の分離テクニック (表 1) によって取得の多くの異なる (サブ) 集団があります。いくつかの文化および分化のプロトコルが確立された1,2,8,9,10、11,12をされています。 13,14,15,16,17,18。これらのプロトコルは、主に対して、成長因子と血清量、培養の目的に応じて調整して、結果と分化効率を含む成果の違いにつながることができる変化します。
マーカーに基づく分離技術:
クリック単価は、特異的表面マーカー式1,2,8,9,10、11,12,13 に基づいて分離することができます。、14,15,16,17,18。以前の研究では、c キットと Sca 1 に常駐単価1,11,14,19,20を分離する最高のマーカーをかもしれないことを示唆しています。これらのマーカーのどれもが本当にクリック単価の特定、別のマーカーの組み合わせが通常適用されます。たとえば、クリック単価は、c キット21の低レベルを表現するのに対し c キットはまた22マスト細胞、血管内皮細胞23、および造血幹細胞/前駆細胞24を含む他の細胞型で表されます。その他の問題は、いないすべてのマーカーがすべての種の間で表されること事実です。これは、Sca 1、マウスではなく、人間25を表現するためのケースです。したがって、分離マーカーに依存しないプロトコルを使用した臨床試験やひと試料を用いた研究の観点から有利であるかもしれません。
マーカーに依存しない分離手法:
表面マーカー式の主に独立系であるが、これは、特定のマーカー陽性の亜分画の連続選択が (表 1を参照してください) を必要に応じてに洗練、CPC 分離のいくつかの主要な技法があります。(1) サイドの人口 (SP) 技術はもともと造血幹細胞による流出 DNA 色素ヘキスト 3334226機能 ATP 結合カセット (ABC) トランスポーター27の原始的な人口で特徴づけられています。心臓 SP 細胞は異なるグループによって分離されさまざまなレポート2,8,13,14のいくつかのマイナーな違いを使用してマーカーを表現する報告します。(2) コロニー形成線維芽細胞 (CFU Fs) もともと上で定義されたベース間葉系間質細胞 (MSC)-表現のような。コロニー形成を誘導するために料理に分離 MSCs を培養しています。このような MSC のような CFU Fs のコロニー形成は大人の心から分離できるので、心臓系統15に区別することができます。(組織生検から育つセルのクラスターから得られる単一のセルまたは28,29,30,31を外植体 3) 丹治派生セル (CDC)。主に CD105 最近示された+/CD90 cardiomyogenic と再生の潜在的な32-/c-kit-細胞画分を展示します。
ここで、マウスから隔離された SP クリック単価を使用して、クリック単価ラット、マウス SP 単価33の以前の研究に基づく内皮細胞系列の効率的な誘導プロトコルを提供します。プロトコルには、特定文化適応と拡張法細胞密度に対して、媒体、及び基板の血清量が含まれています。それはマウス SP 単価だけでなく、適用することができますが、内皮コミットのクリック単価を増幅するから運命のスイッチを誘発する目的のためのクリック単価の種類は、これらの細胞やその機構の in vitro研究用の移植の観点からします。

<table><tbody><tr><td>培養培地</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>ThermoFisher</td><td>#12440</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td><td>Merck</td> <td>#D8437</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td><td>ThermoFisher</td><td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine血清(FBS)</td><td>ハイクロン</td> <td>#SH30071</td><td>3.5%(系統誘導0.1%)</td></tr><tr><td>L-グルタミン&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>#25030</td><td>最終濃度 2 mM</td></tr><tr><td>グルタチオン</td><td>メルク</td> <td>#G6013</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト上皮成長因子 (EGF)</td><td>Peprotech</td> <td>#AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>組換え塩基性線維芽細胞増殖因子 (FGF)</td><td>Peprotech</td> <td>#AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>B27 サプリメント</td><td>ThermoFisher</td><td>#17504044</td><td></td></tr><tr><td>カルジオトロフィン1&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>#250-25</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Diagontech AG, Switzerland</td><td>#100-125</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td><td>ThermoFisher</td><td>#14170</td><td></td></tr><tr><td>0.05 % Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>#25300</td><td></td></tr><tr><td>T75 Flask</td><td>Sarstedt</td><td>#83.3911</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial differentiation&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit</td><td>Lonza</td> <td>#CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12K (Kaighn's) Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>#21127</td><td></td></tr><tr><td>Laminin&nbsp;</td><td>メルク</td> <td>#L2020</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン&nbsp;</td><td>Merck</td> <td>#F4759</td><td>ddH2O</td></tr><tr><td>6 Well Plate</td><td>Falcon</td><td>#353046</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde Solution</td><td>Merck</td> <td>#F1635</td><td>Diluite 1:10 in PBS (3.7% 最終濃度)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>#93420</td><td>0.1% in ddH2O</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum (10%)</td><td>ThermoFisher</td> <td>#50062Z</td><td></td></tr><tr><td>Anti-von Willebrand Factor 抗体</td><td>Abcam</td> <td>#ab6994</td><td>1:100 in 10% ヤギ</td></tr><tr><td>血清 ヤギ抗ウサギ IgG, Alexa Fluor 546</td><td>ThermoFisher</td> <td>#A11010</td><td>1:500 in 10% ヤギ血清</td></tr><tr><td>4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール, 二塩酸塩 (DAPI)</td><td>ThermoFisher</td><td>#62247</td><td>1:500 in ddH2O&nbsp;</td></tr><tr><td>SlowFade 退色防止キット</td><td>ThermoFisher</td> <td>#S2828</td><td></td></tr><tr><td>BX63 広視野顕微鏡</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube formation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 ウェルプレート</td><td>Falcon</td><td>#353072</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 丸底チューブ、ストレーナーキャップ付き</td><td>Falcon</td><td>#352235</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル成長因子の低減</td><td>Corning</td><td>#354230</td><td></td></tr><tr><td>IX50広視野顕微鏡</td>オ<td>リンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sca-1+/CD31-心側集団隔離34&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet.</td><td>インハウスホスピタル薬局</td><td>#9077862</td><td>作業溶液:200 mg/kg</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td><td>ThermoFisher</td><td>#20012</td><td></td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液 (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), フェノールレッド (-)</td><td>ThermoFisher</td><td>#14175</td><td>HBSS 500 mL + 2% FBS&nbsp; コラゲナーゼB活性をクエンチング用&nbsp;</td></tr><tr><td>ダルベッコの修正されたイーグルの媒体(DMEM)1g/L D-グルコース、L-グルタミン、ピルビン酸</td><td>サーモフィッシャー</td><td>#331885</td> ヘキストスタニングペニシリン-ストレプトマイシン<td>のためのDMEM + 10% FBS&nbsp; + 25 mM HEPES+ P / Sを準備し</td></tr>ます<tr><td>。(P/S)</td><td>ThermoFisher</td><td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>ThermoFisher</td><td>#15630080</td><td>最終濃度 25 mM</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Hyclone</td> <td>#SH30071</td><td></td></tr><tr><td>RBC LysisBuffer (10X)</td><td>BioLegend</td><td>#420301/100mL</td><td>ddH2O で 1X に希釈し、0.2 &micro;m filter</td></tr><tr><td>Collagenase B</td><td>Merck</td><td>#11088807001</td><td>HBSS 中の最終濃度 1 mg/mL、0.2 &micro;m フィルター</td></tr><tr><td>ビスベンズイミド H33342 三塩酸塩 (Hoechst)</td><td>Merck</td> <td>#B2261</td> ddH2O ベラパミル塩酸塩<td>で 1 mg/mL を調製</td></tr>します<tr><td>&nbsp;</td><td>メルク</td> <td>#V4629</td><td>最終濃度83.3 &M&nbsp;</td></tr><tr><td>APC ラット抗マウス CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>#551262</td><td>0.25 &micro;g/107cells</td></tr><tr><td>FITC ラット抗マウス Ly-6A/E (Sca-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>#557405</td><td>0.6 &micro;g/107細胞</td></tr><tr><td>7-アミノアクチノマイシン D (7-ADD)</td><td>ThermoFisher</td> <td>#A1310</td><td>0.15 &micro;g/106cells</td></tr><tr><td>APC ラット IgG2a k アイソタイプコントロール</td><td>BD Biosciences</td><td>#553932</td><td>0.25 &micro;g/107cells</td></tr><tr><td>FITC ラット IgG2a k アイソタイプコントロール</td><td>BD Biosciences</td><td>#554688</td><td>0.6 &micro;g/107細胞</td></tr><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>針 27G</td><td>テルモ</td> <td>#NN-2719R</td><td></td></tr><tr><td>針 18G</td><td>テルモ</td> <td>#NN-1838S</td><td></td></tr><tr><td>単回使用シリンジ 1mL 滅菌済み</td><td>CODAN</td><td>#62.1640</td><td></td></tr><tr><td>トランスファーピペット 3.5mL</td><td>Sarstedt</td><td>#86.1171.001</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー40&マイクロ;m blue</td><td>BDバイオサイエンス&nbsp;</td><td>#352340</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー 100 & マイクロ;m yellow</td><td>BD Biosciences</td><td>#352360</td><td></td></tr><tr><td>Lumox Dish 50</td><td>Sarstedt</td><td>#94.6077.305</td><td></td></tr><tr><td>Culture Dishes P100</td><td>Corning</td><td>#353003</td><td></td></tr><tr><td>Culture Dishes P60</td><td>Corning</td><td>#353004</td><td></td></tr><tr><td>Mouse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Line</td><td>Age</td><td>育種</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6NRj/オス</td><td>12週間</td><td><</td><td></td></tr><tr><td>strong>製品名</td><td>会社名</td><td>カタログNo.<</td><td></td></tr><tr><td>strong>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>#12440</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグルス培地(DMEM)/栄養混合物F12ハム</td>メル<td>ク</td> <td>#D8437</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン&nbsp;(P/S)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>ハイクロン</td> <td>#SH30071</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>#25030</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione</td><td>Merck</td> <td>#G6013</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>ThermoFisher</td><td>#17504044</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト上皮成長因子(EGF)</td><td>Peprotech</td> <td>#AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>組換え塩基性線維芽細胞増殖因子(FGF)</td><td>Peprotech</td> <td>#AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Cardiotrophin 1&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>#250-25</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Diagontech AG, スイス&nbsp;</td><td>#100-125</td><td></td></tr><tr><td>内皮細胞増殖培地(EGM)-2 BulletKit</td><td>Lonza</td> <td>#CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>培地組成の概要。この情報の一部は、上記で提供したものと同じですが、メディア1-3の構成に従ってソートされています。&nbsp;</強い></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><強い>製品名</強い></td><td><強い>中 18</強い></td><td><強い>中 2</強い></td><td><強い>中 3</強い></td></tr><tr><td><強い>試薬</強い></td><td><強い>培養</強い></td><td><強い>系統誘導</強い></td><td><強い>内皮diff.</td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>35%</td><td>35%</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td><td>65%</td><td>65%</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&nbsp;(P/S)</td><td>1%</td><td>1%</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>3.5%</td><td>&le;0.1%</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン&nbsp;</td><td>2 mM</td><td>2 mM</td><td></td></tr><tr><td>グルタチオン</td><td>0.2 nM</td><td>0.2 nM</td><td></td></tr><tr><td>B27 サプリメント</td><td>1.3%</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>組換えヒト上皮成長因子 (EGF)</td><td>6.5 ng/mL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>組換え塩基性線維芽細胞成長因子 (FGF)</td><td>13 ng/mL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カルジオトロフィン 1&nbsp;</td><td>0.65 ng/mL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トロンビン</td><td>0.0005 U/mL</td><td></td><td>キットに含まれるすべての必要なコンポーネント</td></tr><tr><td>内皮細胞増殖培地(EGM)-2 BulletKit</td><td></td><td></td><td>キットに含まれるすべての必要なコンポーネント</td></tr></tbody></table>

低血清条件下で心臓前駆細胞の内皮への分化の誘導

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

心臓前駆細胞 (CPCs) 外傷後心臓再生治療の可能性があります。大人の哺乳類の心臓で本質的な単価が極端に乏しいが拡張クリック単価は細胞治療の役に立つかもしれない。使用するための前提条件は、制御された方法で定義され、効率的なプロトコルを使用して様々 な心臓系統に分化する能力です。さらに、体外の拡大、患者から分離されたクリック単価または臨床病モデル疾患のメカニズムの調査のため有益な研究ツールを提供するかもしれない。
現在の研究では、クリック単価を識別するために異なるマーカーを使用します。しかし、それらのすべてはいくつかの臨床研究の橋渡しの影響を制限する人間で表現されます。標準化された拡張と細胞療法の目的のためのクリック単価のプライミングの分離技術とマーカーの発現に関係なく適用される微分のプロトコルになります。ここで述べる低ウシ胎児血清 (FBS) 濃度と低細胞密度条件下でクリック単価のプライミング マウスおよびラットのクリック単価の 2 つの異なる集団を使用してクリック単価の内皮への分化を促進、そのラミニンはよりことを示す次のプロトコルの下でこの目的のためフィブロネクチンより適当な基板: FBS、クリック単価をにおけるラミニンのシードの率を維持するサプリメントを含む培地で 2-3 日培養後と 3.5% < 60% 合流と培養政府短期証券 (0.1%) の内皮への分化培地で分化する前に 20-24 時間低濃度サプリメント自由な媒体。クリック単価は異種集団なので血清濃度とインキュベーション時間はそれぞれクリック単価個体の特性に応じて調整する必要があります。これを考慮し技術は同様にクリック単価の他のタイプに適用できる可能性とそれぞれ疾患モデルから分離されたクリック単価を使用する場合、どのようには病気によって影響と分化のメカニズムを検討する有用な方法を提供しています。

マウスのクリック単価 SP 分離:
本研究ではラット単価から結果を変更およびアクセス許可 (図 8)33で以前のレポートから追加に対し SP 表現型によると分離されたマウスのクリック単価を使用しました。
細胞増殖の血清濃度と高、低細胞密度の下で:
私たちの以前の研究は、心臓系統のマーカーの発現が養殖のステップ最初の 24 時間以内に変更されたことを示した。細胞外マトリックス内皮への分化35を含む、細胞運命の決定に影響を与えることが知られています。クリック単価の内皮細胞系列...

このプロトコルでは、心臓前駆細胞の内皮への分化技術について説明します。特に、血清濃度と細胞播種密度が内皮細胞の分化に及ぼす影響について焦点を当てています。

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

増幅時の心臓前駆細胞(CPC)の分化には、増殖からコミットされた段階への相切り替えが必要であり、このプロトコルはCPCで効率的な内皮系を使用する。この技術の主な利点は、いくつかの技術に基づいて、異なる種から分離されたCPCに適用可能であるということです。このプロトコルは、細胞治療のためのCPCの治療可能性を高めるために使用することができる。また、分化の可能性とメカニズムを調べ、これらが心臓病によってどのように影響を受けるかを調べることもできます。CPCは、形状、サイズ、および効力が異なる可能性がある細胞の不均一な集団です。したがって、プロトコルは、使用するCPCの特定のサブ人口に応じて調整する必要があります。マウスを麻酔した後、70%エタノールで胸を拭き取ります。はさみを使用して、胸腔を露出させるために皮膚と胸壁を切断します。鉗子を使って心臓を持ち上げ、ハサミを使ってベースで切ります。5ミリリットルの冷たいPBSを含むP60培養皿に心臓を移し、鉗子を使って心臓をポンピングし、空洞から血液を排出する。冷たいPBSの5ミリリットルを含むP60皿に心臓を置き、それを洗います。小さなはさみを使って心房を取り除き、心臓を2つの縦方向に切り、5ミリリットルの氷冷PBSで洗います。小さいはさみを使って、心臓の部分を小さな切り分けに切ります。コラゲターゼBを含むハンクのバランスのとれた塩溶液を1ミリリットル当たり1ミリグラムの濃度で加え、滅菌カミソリブレードを使用して小さな心臓片を十分にミンチします。次に、2.5ミリリットルのコラゲターゼB溶液を皿に加えます。30度の角度で、37度のインキュベーターに置きます。インキュベーション中に10分ごとにパスツールピペットを通して繰り返しそれらを渡しながら、最大30分間インキュベートするひき肉の部分をしてみましょう。まず、2%FBSを補った冷たいHBSSを5ミリリットル加え、細かく均質化された心臓片に加えます。100マイクロメートルのフィルターを使用して、未消化の組織を除去するために心臓片をフィルター処理する。470倍Gで遠心分離機、室温で5分間。上清を捨て、5ミリリットルの赤血球のリシスバッファーでペレットを再中断します。時折揺れで5分間氷の上でインキュベートします。この後、PBSを10ミリリットル加え、40マイクロメートルのフィルターを通してサンプルをフィルターし、残留心筋細胞を含むより大きな細胞を除外します。470倍Gで遠心分離機、休憩なしで5分間室温で。その後、10%FBSを補ったDMEM中の細胞を再懸濁し、1ミリリットル当たり100万個の細胞の最終的な細胞濃度を目指す。染色と選別のために細胞を2つのチューブに分配し、1つのチューブに1.5ミリリットルの細胞溶液を加え、2番目のチューブに3.5ミリリットルを加えます。Hoechst溶液を加え、時折反転して摂氏37度で90分間インキュベートし、色素の均等な分配を確実にし、細胞の凝固を防ぎます。側の人口は、主要な人口の脇のHoechst低い左下隅に表示されます。FACSプロットでは、ベラパミルがサイドの集団を消滅させる負のコントロールに基づいて識別することができます。中程度の1〜37度を温め、遠心分離機を摂氏4度に冷やします。470倍Gで選別管を6分間摂氏4度で遠心分離します。次に、培地1で細胞を再懸濁する。培地1の4ミリリットルを含むガス透過性P60皿に細胞を移します。細胞が各フラスコに8ミリリットルの培地1を使用してT75フラスコで2〜3日間、細胞が70〜80%の培養SP-CPCの合流点に達するまで、3日ごとに培地を変更します。次に、慎重に媒体を吸引し、温かいHBSSの5ミリリットルでフラスコを穏やかにすすります。5%の二酸化炭素で摂氏37度で5分間、5ミリリットルのトリプシンEDTAで細胞を治療します。次いで、ミディアム1の5ミリリットルを加えてトリプシン活性を停止し、細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移した。室温で5分間Gの470倍の遠心分離機。次に、培地1または培地2のいずれかで細胞を再中断する。P60皿に細胞をプレートし、異なる血清濃度を含む3ミリリットルの培地で1皿あたり250,000 SP-CPCをメッキします。培養の2日後、各皿から15ミリリットルのチューブに培地を集めて死んだ細胞を採取する。先に述べたように付着細胞をトリプシン化し、回収された培地を含む15ミリリットルのチューブに細胞懸濁液を集める。840倍Gで室温で5分間遠心分離機を行い、その後上清を吸引し、セルカウント用に1または2個の培地を1ミリリットル加える。SP-CPCをトリパンブルーで染色し、生存可能な細胞と死んだ細胞を数えます。まず、調製した細胞から培地を吸引し、5ミリリットルの温かいHBSSで穏やかにすすいます。5ミリリットルのトリプシンEDTAで細胞インキュベーターで5分間治療します。次に、5ミリリットルのミディアム1を加えてトリプシン活性を停止する。セル懸濁液を15ミリリットルチューブに移し、遠心分離機を470倍Gで室温で5分間移動します。上清を吸引し、セルカウント用にミディアム2を加えます。次に、シード80,000細胞を、培地2の3ミリリットルを用いた事前コーティングされた6ウェル培養プレートの各ウェルに入る。プレートを摂氏37度に20~24時間置き、各ウェルの培地をミディアム3の3ミリリットルに変更します。プレートを21日間培養し、3日ごとに培地を交換する。この後、細胞を内皮マーカーで染色し、蛍光顕微鏡を行い、分化した細胞の内皮性を検証する。まず、調製した細胞から培地を吸引し、5ミリリットルの温かいHBSSで穏やかにすすいます。細胞インキュベーターで2ミリリットルのトリプシンEDTAを5分間処理し、3ミリリットルの培地を加えてトリプシン活性を停止します。セル懸濁液を15ミリリットルチューブに移し、遠心分離機を470倍Gで室温で5分間移動します。上清を吸引し、ミディアム3の1ミリリットルを加え、軽くピペットして混ぜます。96ウェルプレートのウェルをコーティングした各マトリックスに培地3の100マイクロリットルの2,000と4,000の細胞と種子の間の細胞および種子を数える。プレートを摂氏37度で16時間インキュベートします。この後、2倍倍の明視野顕微鏡を使用して細胞の写真を撮ります。本研究では、心臓前駆細胞の内皮系統コミットメントの促進のために適切な条件が検討される。細胞の合流率が60%以下の場合、3.5%FBSで処理したサンプルに有意差は見られない。この合流の細胞を0.1%FBSで処理すると、フィブロネクチンと比較するとラミニンの細胞増殖が減少するが、細胞死の増加は示さない。対照的に、高い合流度の細胞は、2つの条件間の細胞増殖または細胞死のいずれにも有意な差を示さない。細胞形状の変化は、内皮分化が成功する適切な培養条件の指標であるように見える。内皮分化培地において7~14日以内に、異なる形態を有する大きな細胞を含む培養が成功することが分かる。興味深いことに、これらの細胞は分化段階の終わりに向かって消失し、高密度培養においてより低い数および後の時点で出現する傾向があった。チューブ形成は、低密度でめっきし、ラミニンで分化した細胞で一貫して成功していますが、高密度でメッキされた細胞ではほとんど失敗することが見られます。チューブ形成は、細胞密度に関係なくフィブロネクチン上で培養された細胞ではほとんど失敗するが、低密度で分化したものは初歩的なチューブを形成することがある。内皮系統を誘導する血清濃度と細胞密度は非常に重要であり、生存率を維持しながら増殖の減速を保証するように調整する必要があります。系統誘導の際に、ヒトまたは前臨床疾患モデルからのCPCを細胞移植研究に使用して生体内分化の可能性を評価することができる。このプロトコルは、新しい心臓再生ツールの研究や確立に役立つ可能性があり、以前は初期の系統コミットメントの分子メカニズムを研究するために使用されていました。

induction-endothelial-differentiation-cardiac-progenitor-cells-under

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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学ぶ心臓前駆細胞の内皮分化プロトコル。低血清・低密度・ラミニン基質で効率的に内皮系へ誘導し、心臓再生医療や疾患メカニズム研究への応用を可能にする標準化手法です。

低血清条件下で心臓前駆細胞の内皮への分化の誘導

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