Name: 生理活性とエネルギー依存性タンパク質輸送アッセイでの使用の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: 学ぶ、エンドウ豆を用いた生理活性チラコイドの高収率分離法と、葉緑体膜を横断するタンパク質輸送のエネルギー依存性メカニズムを解析するアッセイ手法。精密な環境制御が可能なこのプロトコルは、植物細胞内のプラスチドタンパク質局在の研究に貢献します。

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この原稿は化学専攻、地球科学、生命科学、米国エネルギー省を介してグラント ・ デ ・ SC0017035 の基本的なエネルギー科学の 408 のオフィスで準備されました。

1. 初期の材料
<ol><li>400 mL の水で 3 時間のエンドウ豆の約 55 g を浸漬し、その後、プラスチック製のトレイに種をまく (35 cm × 20 cm × 6 cm) 土バーミキュ ライトの薄層で覆われています。</li>
	<li>12/12 h/暗 (50 Με/m2s) サイクル 9 ~ 15 日の下 20 の ° C でエンドウ豆のトレイを成長します。</li>
	<li>推奨される方法に従ってタンパク質基板を準備します。 注: さまざまな 1 を含む方法を使用して蛋白質の基板を用意) コムギ胚芽抽出または [3H] の存在下でウサギ網状赤血球ライセートを用いた翻訳続く精製プラスミドからの in vitro転写-ロイシンまたは [35S]-メチオニン、2) TnT など結合転写/翻訳キットを使用しての in vitro翻訳キットから上記のように、カイネティックスと Promega、3)大腸菌発現タンパク質の精製。放射性の in vitro翻訳製品一般に 50 mM 冷たいアミノ酸輸送反応における使用前に癒されています。これらの各メソッドは通常各の新しい蛋白質の基質のためのいくつかの最適化を必要です。結合の in vitroシステムの例として、玲とジャービスを参照してください。 (2016)9。</li>
</ol>2. 葉緑体の分離と定量
注: チラコイドの準備のために最初のステップは、無傷葉緑体10の分離です。すべての材料は、準備中に冷たい保管すべき。この手順で破損することができます以降チラコイド収量を制限して深刻な葉緑体の巻き上がりが優しく、処理必要があります。
<ol><li>以下のソリューションを事前準備します。<ol>
<li>研削バッファー (2xGB) x 2: 100 mM K HEPES pH 7.3, 660 mM ソルビトール、MgCl2、2 mM 2 mM MnCl2, 4 ミリメートルの EDTA、0.2 %bsa。</li>
		<li>インポート バッファー (2xIB) x 2: 100 mM K トリシンまたは K HEPES pH 8.0、660 mM ソルビトール、8 mM MgCl2。 注: MgCl2 3 mM から 10 mM までの濃度は、観測可能な違いなしに使用されています。</li>
	</ol>
</li>
	<li>連続密度勾配を準備するには、オフ、ブレーキ付け Percoll の 15 mL と 15 mL の 4 ° C で 30 分間固定角ロータで 30,900 gで 2xGB の混合物を遠心分離します。</li>
	<li>9 15 日古い豆の約 25 g を収穫し、1xGB 95 mL にホモジナイズしてください。尖った刃をミキサーまたは、ポリトロンが正常に使用されています。目標到達プロセスの Miracloth の少なくとも 2 層を介してこの混合物をフィルター処理します。 注: 茎組織の量を制限する必要はありませんが、均質化プロセスを簡単、長時間ブレンドで発生する葉緑体破損を減らすことができます。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間スイング バケツ ローターで 3,000 gでペレットし、1xGB の 1 つの mL で優しく再懸濁します。絵筆は、最も穏やかな再懸濁法にあります。</li>
	<li>慎重にブレーキをオフ パーコールと 4 ° C で 10 分間スイング バケツ ローターで 8,000 gで遠心分離機の上に緑の懸濁液を層します。</li>
	<li>新鮮なチューブに葉緑体を含む下の緑バンドを慎重に収穫します。4 ° C で 5 分間スイング バケツ ローターで 1,800 gで回復した葉緑体をスピン、上澄みを廃棄し、軽く 1xIB でペレットを再懸濁します。この手順を繰り返します洗ってもう一度 1xIB の 1 mL に最終的な再懸濁のたびに 1xIB 30 mL に再します。</li>
	<li>葉緑素 (クロロフィル) 含量を定量化するには、80% アセトン 5 mL、ワットマン 1 ろ紙 (公称厚さ 180 μ m) を介してフィルターを完全に再懸濁の葉緑体の 10 μ L をミックスします。720 で吸光度を記録 nm, 663 nm、および 645 nm の分光光度計11次式を用いたクロロフィル濃度を計算します。 [クロロフィル] mg/mL = [40.2* (、663 -720) + 101.4* (645 -720)] * 0.1</li>
	<li>1 mg/mL 1xIB とクロロフィル同等に葉緑体を調整します。</li>
</ol>3. チラコイドの単離
注: チラコイドは、葉緑体の低張性換散によって準備されます。これはソルビトールを欠けている低張性バッファーに葉緑体を公開することによって達成されます。分離チラコイドは試金の転流経路のいずれかを使用ことができます、間質抽出 (SE) もあります分離この準備中 cpSec1 または cpSRP のいずれかの経路を調査する場合。
<ol><li>次の解決策を事前に準備します。<ol>
<li>低張性の換散バッファー: 50 ミリメートル K トリシンまたは K HEPES pH 8.0、8 mM MgCl2。</li>
		<li>(SE の濃度) の原油の質バッファー x 2: 100 mM K HEPES pH 8.0、660 mM ソルビトール、8 mM MgCl2。</li>
		<li>(SDS-PAGE、EDTA を添加した) の塩化物イオンとサンプル バッファー: 125 mM Tris pH 6.8, 10% SDS 20% グリセロール、0.05 mg/mL ブロモフェノール ブルー、10% β-メルカプトエタノール、10 mM EDTA。</li>
	</ol>
</li>
	<li>遠心分離機 4 ° C で 6 分間スイング バケツ ローターで 1,000 gで葉緑体の SE のリカバリに必要な場合<ol>
<li>上澄みを廃棄し、1 mg/ml 低張の換散バッファーに再懸濁します。時折混合との 10 分のため暗闇の中で氷の上を孵化させなさい。</li>
		<li>4 ° C で 8 分のバケツの回転子をスイング 3,200 gで遠心分離によってチラコイドを回復します。換散バッファーの 1 ~ 2 mL で再するたびに二回、チラコイドを洗います。1xIB 1 mL で再懸濁し、葉緑体の隔離のプロトコルの上としてクロロフィルを requantify します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 間質抽出物の回復と濃度
<ol><li>SE の回復が必要な場合、無傷葉緑体を分割で 1.5 mL 容マイクロ チューブ 600 μ 因数と 4 ° C で 6 分のバケツの回転子をスイングで 1,000 gで各チューブを遠心分離 注: このボリュームは便利な 1.5 mL 遠心管を使用するとき残留膜の最終的なペレットの妨害を防ぐことができます。<ol>
<li>低張性の換散バッファーのクロロフィルの 1 mg/mL に再懸濁します、3.2.1 のステップのように、10 分間暗闇の中で氷の上を孵化させなさい。</li>
		<li>4 ° C で 8 分のバケツの回転子をスイングで 3,200 x gで各チューブを遠心分離し、光緑または黄色清次葉緑体換散を粗質バッファー x 2 の等量と新しい微量遠心チューブに転送します。</li>
		<li>(0.5 mg/mL の近似) 換散バッファーの 2 つの容積とチラコイドを洗って、4 ° C で 8 分のバケツの回転子をスイング 3,200 gでの遠心分離によって収集1xIB 氷の上でクロロフィルの 1 mg/mL に再懸濁します。</li>
		<li>42,000 g残留膜を削除する 4 ° C で 30 分間固定角ロータで原油の質を遠心します。外側と内側のエンベロープ蛋白の免疫ブロットは、上澄みの純度を確認する使用できます。</li>
		<li>黄緑色の小球を乱すことがなく、各チューブから量の 95% を収集します。各チューブからボリュームに注意してください。</li>
		<li>集中して間質の抽出 (SE) を準備するには、収集した培養上清をプール、5 倍 4 mL 30 kDa MWCO コンセントレーターを使っても集中。 注意: この方法で用意する SE、2.5 mg/mL 海域で葉緑体由来間質に相当必要に応じて、SE が 5 mg/mL クロロフィル同等物を 10 倍濃縮することができます。SE は黄金色と粘性になります。バケツの回転子を揺動ラボの伝説 RT 遠心分離機に集中して mL あたり約 10 分が必要です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. cpTat 経路を通る輸送します。
注: とは異なり、cpSec1 または cpSRP、cpTat 経路水溶性成分を必要としないまたは外因エネルギー源を追加光駆動プロトン動機力だけは必要な3です。したがって、のみ分離チラコイドと基質のタンパク質は、アッセイに必要です。典型的な基板は、それぞれ、(図 1で見られる)、17 kDa の中間フォームと酸素、iOE17、iOE23、23 kDa サブユニットが、前駆体フォーム、prOE17、prOE23、また正常に転送できます。前駆体フォーム中間フォームがターゲット シーケンス チラコイドだけ二部 N ターミナル ターゲット シーケンス全体があります。
<ol><li>クロロフィル チラコイド、1xIB と 1xIB、氷の上で準備在庫から 8 mM ジチオトレイトール (DTT) 準備在庫から 5 mM ATP cpTat トランスポート混ぜ 0.33 mg/mL を準備します。照明の下で実施される場合、ATP はこの反作用のため厳密には必要ありません。</li>
	<li>1:30 を導入することによる開始の輸送によってボリューム輸送基質タンパク質ミックスします。基質タンパク質は、1xIB の準備ができていない場合は、1:1 希釈 2xIB 最初を使用して 1:30 ボリュームによって希薄化後の基板のトランスポート ミックスでを準備します。 注: 基板の濃度調製法に基づいて異なります。通常、体外の準備は、マイクロモル金額にナノモル過剰発現は、マイクロモル millimolar 量にしながら。検出方法はまた、放射線写真法と透視が免疫ブロットより敏感考慮されなければなりません。</li>
	<li>室温で 10 分間の光合成有効放射 (PAR) の 80-100 Με/m2s のサスペンションを照らします。輸送速度が必要な場合あらかじめ室温にチラコイドと反応の両方のミックスを平衡し、最大で 30 分間点灯します。</li>
	<li>冷たい 1xIB の 8 希釈で輸送反応を停止し、4 ° C で 5 分間遠心で 3,200 gでの遠心分離によってチラコイドを回復</li>
	<li>運ばれていない残留の基板を取り外して 1xIB の 120 μ L でチラコイド ペレットを再懸濁します 2 mg/mL サーモライシンと 10 mM CaCl2 1xIB で 6 μ L 添加による外部のタンパク質を消化します。</li>
	<li>40 分間氷の上プロテアーゼ反応を孵化し、25 mM 1xIB で準備 EDTA を使用してボリュームを倍にして、プロテアーゼを消します。</li>
	<li>3,200 g 4 ° C で 5 分間遠心機で遠心分離によってチラコイドを回復します。1xIB、新しい管への転送 5 mM EDTA の 120 μ L で回復したチラコイドを洗浄します。</li>
	<li>3,200 g 4 ° C で 5 分間遠心機で遠心します。10 mM EDTA を添加した塩化物イオン サンプル バッファーの適切なボリュームで再懸濁します。40 μ L のボリュームは通常は十分に SDS ページのゲルの基板を検出し、繰り返しゲルの必要があるときにサンプルを節約できます。</li>
	<li>10 分の沸騰水のお風呂でサンプルを置き、SDS-PAGE により分析します。放射線写真法、透視、または非ネイティブまたはタグ付きのエピトープの蛋白質の西部のしみは、輸送タンパク質の検出のため正常に使用されています。</li>
</ol>6. cpSec1 経路を通る輸送します。
注: cpSec1 トランスロコンを通じてトランスポート間質蛋白 cpSecA112,13、エシェリヒア属大腸菌14,15の過剰発現による調達または間質を集中することによって回復できるが必要です。中にチラコイドの分離。典型的な基板は、図 2に見られるように複雑な進化する酸素 (prOE33) の 33 kDa のサブユニットです。
<ol><li>クロロフィル チラコイド、0.83 mg/mL クロロフィル相当 SE または組換え cpSecA1 と 5 mM 氷上では、ATP の 1.5 μ g cpSec1 トランスポート混ぜ 0.33 mg/mL を準備し、10 分間インキュベートします。典型的な輸送反応混合物ここは SE 添加による 60 μ L から最大 72 μ L です。<ol>
<li>SE ではなく遺伝子組換え cpSecA1 を使用する場合 2xIB の等量と精製 cpSecA1 を調整し、輸送反応 (例えば0.75 μ g/μ L) に追加する便利な濃度に希釈します。 注: の長期的なストレージ、cpSecA1 に格納されます制御、冷凍室の氷として精製後凍結廃止活動。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1:10 の導入による輸送を開始ボリュームによって輸送基質タンパク質を混ぜます。基質タンパク質は 1xIB の準備ができていない、2xIB と 1:1 希釈を準備し、トランスポート ミックスに 1:10 ボリュームによって希薄蛋白質を追加します。</li>
	<li>下で 10 分間室温で反応をインキュベート 80-100 Με/m2のパー。また、長い時間速度または特定の基板の必要があります。</li>
	<li>光治療後 8 倍希釈 4 ° C で 5 分間遠心で 3200 gで 1xIB と遠心の冷たい反応</li>
	<li>サーモライシンと扱うし、5.7 を介して手順 5.5 上として EDTA を消します。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間遠心で 3,200 gで遠心し、10 mM EDTA を添加した塩化物イオン サンプル バッファーの適切なボリュームでペレットを再懸濁します。沸騰水浴 SDS ページのゲルにロードする前に 10 分間に配置します。</li>
</ol>7. cpSRP 経路を介して挿入
注: cpSRP54、cpSRP43、および cpFtsY16に集光性複合タンパク質 (LHCP)図3 の cpSRP を介した統合が必要です。これらのコンポーネントは、cpSec1 トランスポート プロトコルのとおり濃縮管間質エキス、を通じて輸送反応に供給されます。
<ol><li>準備、cpSRP 0.33 mg/mL クロロフィル、0.83 mg/mL クロロフィル相当 SE と 5 mM ATP の氷の上でミックスを輸送し、10 分間インキュベートします。</li>
	<li>1:10 の導入による輸送を開始ボリュームによって輸送基質タンパク質を混ぜます。基質タンパク質は 1xIB の準備ができていない、2xIB と 1:1 希釈を準備し、トランスポート ミックスに 1:10 ボリュームによって希薄蛋白質を追加します。</li>
	<li>80-100 Με/m2のパーで 10 分間室温で反応を孵化させなさい。</li>
	<li>光治療後 8 倍希釈 4 ° C で 5 分間遠心で 3,200 gで冷たい 1xIB と遠心分離機の反応上澄みを廃棄し、1xIB の 120 μ L でペレットを再懸濁します。</li>
	<li>5.5 5.7 からのセクションで上記としてサーモライシンを扱います。サーモライシン消化ここで成功した膜の統合を評価するために必要です。1xIB、新しい管への転送 5 mM EDTA の 120 μ L で回復したチラコイドを洗浄します。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間遠心で 3,200 gで遠心し、再び 10 mM EDTA を添加した 2 x Laemmli バッファーの適切なボリュームでペレットを再懸濁します。沸騰水浴 SDS-PAGE による分析の前に 10 分間に配置します。 注: 成熟 LHCP (mLHCP) の統合は、プロテアーゼで保護された分解産物 (mLHCP D) の出現によって評価は約 1.5-2 kDa 分解されていない mLHCP17より小さい。</li>
</ol>

<ol><li>Ellis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+protein+synthesis%3A+principles+and+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Sub-cellular+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chloroplast protein synthesis: principles and problems.</a> Sub-cellular biochemistry. 9, 237(1983).</li>
<li>Li, H. -m, Chiu, C. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+transport+into+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+plant+biology%22%5BJournal%5D)">Protein transport into chloroplasts.</a> Annual review of plant biology. 61, (2010).</li>
<li>Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-specific+energy+requirements+for+protein+transport+across+or+into+thylakoid+membranes.+Two+lumenal+proteins+are+transported+in+the+absence+of+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).</li>
<li>Skalitzky, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastids+contain+a+second+sec+translocase+system+with+essential+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Plastids contain a second sec translocase system with essential functions.</a> Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).</li>
<li>Dabney-Smith, C., Storm, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDabney-Smith%2C+C+%22Plastid+Biology%22">Plastid Biology</a>. , Springer. 271-289 (2014).</li>
<li>Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+%26%2334%3Bassisted%26%2334%3B+and+%26%2334%3Bspontaneous%26%2334%3B+mechanisms+for+the+insertion+of+polytopic+chlorophyll-binding+proteins+into+the+thylakoid+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct &#34;assisted&#34; and &#34;spontaneous&#34; mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).</li>
<li>Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. hloroP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChloroP%2C+a+neural+network-based+method+for+predicting+chloroplast+transit+peptides+and+their+cleavage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites.</a> Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).</li>
<li>Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locating+proteins+in+the+cell+using+TargetP%2C+SignalP+and+related+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools.</a> Nature protocols. 2 (4), 953(2007).</li>
<li>Ling, Q., Jarvis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+import+into+chloroplasts+isolated+from+stressed+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54717(2016).</li>
<li>Lo, S. M., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLo%2C+SM+%22Photosynthesis+Research+Protocols%22">Photosynthesis Research Protocols</a>. , Springer. 139-157 (2011).</li>
<li>Vernon, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+determination+of+chlorophylls+and+pheophytins+in+plant+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts.</a> Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).</li>
<li>Knott, T. G., Robinson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secA+inhibitor%2C+azide%2C+reversibly+blocks+the+translocation+of+a+subset+of+proteins+across+the+chloroplast+thylakoid+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).</li>
<li>Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SecA+homolog+in+protein+transport+within+chloroplasts%3A+evidence+for+endosymbiont-derived+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting.</a> Science. 266 (5186), 796-798 (1994).</li>
<li>Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+the+cDNA+for+pea+chloroplast+SecA+Evolutionary+conservation+of+the+bacterial-type+SecA-dependent+protein+transport+within+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts.</a> FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).</li>
<li>Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-assisted+post-translational+transport+of+plastidic+type+I+signal+peptidase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).</li>
<li>Luirink, J., Sinning, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRP-mediated+protein+targeting%3A+structure+and+function+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).</li>
<li>Yuan, J., Henry, R., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+factor+plays+an+essential+role+in+protein+integration+into+thylakoids+that+cannot+be+replaced+by+unfolding+or+by+heat+shock+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Hsp70.+Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein.</a> Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).</li>
<li>Tjalsma, H., van Dijl, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics-based+consensus+prediction+of+protein+retention+in+a+bacterial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane.</a> Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).</li>
<li>Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Facile+Reporter+System+for+the+Experimental+Identification+of+Twin-Arginine+Translocation+%28Tat%29+Signal+Peptides+from+All+Kingdoms+of+Life%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life.</a> Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).</li>
<li>Yuan, J., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastocyanin+and+the+33-kDa+subunit+of+the+oxygen-evolving+complex+are+transported+into+thylakoids+with+similar+requirements+as+predicted+from+pathway+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).</li>
<li>Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., Büchel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transversal+and+lateral+exciton+energy+transfer+in+grana+thylakoids+of+spinach%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach.</a> Biochemistry. 43 (45), 14508-14516 (2004).</li>
<li>Frielingsdorf, S., Jakob, M., Klösgen, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stromal+pool+of+TatA+promotes+Tat-dependent+protein+transport+across+the+thylakoid+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).</li>
<li>Tu, C. -J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+FtsY%2C+chloroplast+signal+recognition+particle%2C+and+GTP+are+required+to+reconstitute+the+soluble+phase+of+light-harvesting+chlorophyll+protein+transport+into+thylakoid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).</li>
</ol>

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葉緑体とチラコイドの分離
過度の破損が発生することができます貧しい葉緑体の分離そしてこうして貧しいチラコイドをグラデーションで分離後もたらします。優しくブレンドと完全に均質になるまで 15 秒サイクルでパルスの前にすべての材料を浸漬を確保することによって収穫された組織を均質化することをお勧めします。必要に応じて、各ラウンドで以下の組織とブレンドの複数の短いラウンドを使用します。
収穫された組織と接触するすべての材料を冷凍隔離された葉緑体を 2 時間活動を保持することができます。同様の分離後暗闇の中氷の葉緑体を保持することが重要です。
マグネシウムは、バッファーを分離チラコイドに連絡することが重要です。そうしないグラナ destacking の結果し、批判的に照明21にプロトン動機力の生成に影響します。チラコイドは、氷の上と暗闇の中で保持するとき分離後 2 時間輸送反応に使用されています。
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適切な葉緑体機能の責任タンパク質機械のほぼすべては細胞質1から移行する必要があります。葉緑体エンベロープでタンパク質は、トランスロコン (TOC) の外側の膜と内膜 (TIC)2トランスロコンを通じてインポートされます。さらに、チラコイドにターゲット膜と内腔がツイン アルギニン転 (cpTat)3、分泌 (cpSec1)4、信号認識粒子 (cpSRP)5自発挿入経路6 を通じて行われます。.生理活性の葉緑体のチラコイド膜高収率分離法はエネルギー論および転流イベント、各経路で多様なトランスポート機構を理解し、ローカライズの体内動態を測定するために必要な葉緑体の六つの異なる区画のいずれかに関心の特定のタンパク質基質です。
葉緑体膜の分離は、輸送エネルギーの測定に影響を与える要因 (塩と基質濃度 ATP/GTP と pH 条件の存在など) をより実験的制御を提供していて、速度論。この体外環境は同じ理由のための転流機構詳細の探査に適しています。さらに、葉緑体タンパク質の局在化の予言するソフトウェアは、7、8をしましたが、輸送の in vitroアッセイでは、確認のため高速な方法顕微鏡蛍光アッセイ遺伝的コード化蛍光タグ、植物形質転換および/または特定の抗体が必要です。ここでは、輸送アッセイごとエネルギー依存チラコイドの転流経路の最適化のためだけでなく、エンドウ豆 (エンドウ) から葉緑体とチラコイドの隔離のためのプロトコルを提案する.

<table><tbody><tr><td>Pisum sativum種子</td><td>Seedway LLC、ホール、NY</td><td>8686 - リトルマーベル</td><td></td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Calbiochem、ギブスタウン、ニュージャージー州</td><td>475855-1</td><td></td></tr><tr><td>80%アセトン</td><td>シグマ、セントルイス、ミズーリ</td>州<td>67-64-1</td><td></td></tr>鋭<tr><td>利なブレード付きブレンダーWaring</td><td>コマーシャル</td><td>BB155S</td><td></td></tr><tr><td>ポリトロン10-35</td>フィ<td>ッシャーSci</td><td>13-874-617</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>GE17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Beckman J2-MC with JA 20 rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>8043-30-1180</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC-5B with HB-4 rotor</td><td>Sorvall</td><td>8327-30-1016</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB</td><td>Sigma, Saint Louis</td>, <td>MO 12/3/83</td> 将来の<td>使用のためにアリコートで凍結可能</td></tr><tr><td>1xIBで200 mM MgATP</td><td>シグマ、セントルイス、ミズーリ</td>州 <td>74804-12-9</td><td>将来の使用のためにアリコートで凍結することができます</td></tr><tr><td>1xIB (2mg/mL) のサーモリシン</td> <td>シグマ、セントルイス、ミズーリ</td>州 <td>9073-78-3</td><td>将来の使用のためにアリコートで凍結することができます</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ、セントルイス、ミズーリ</td>州 <td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>K-トリシン</td><td>シグマ、セントルイス、ミズーリ</td>州 <td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>ソルビトール</td><td>シグマ、セントルイス、ミズーリ</td>州 <td>50-70-4</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>シグマ、セントルイス、ミズーリ</td>州 <td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>塩化マンガン</td><td>シグマ、セントルイス、ミズーリ</td>州 <td>13446-34-9</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>シグマ、セントルイス、ミズーリ</td>州 <td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>シグマ、セントルイス、ミズーリ</td>州 <td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>トリス</td><td>シグマ、セントルイス、ミズーリ</td>州 <td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>シグマ、ミズーリ州セントルイス</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>シグマ、セントルイス、ミズーリ</td>州 <td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>シグマ、セントルイス、ミズーリ</td>州 <td>115-39-9</td><td></td></tr><tr><td>B-メルカプトエタノール</td><td>シグマ、セントルイス、ミズーリ</td>州 <td>60-24-2</td><td></td></tr></tbody></table>

生理活性とエネルギー依存性タンパク質輸送アッセイでの使用の分離

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

葉緑体は、緑色植物の多数の重要な代謝経路を運ぶための責任で細胞小器官最も特に光合成。葉緑体には、チラコイド膜システムすべての光合成色素、反応中心複合体、電子キャリアのほとんどを住宅と光依存性 ATP 合成のためあります。葉緑体タンパク質の 90% 以上は、核でエンコードされ、細胞質で翻訳、後葉緑体にインポートします。さらにタンパク質輸送やチラコイド膜は、4 つの転流経路の一つを利用しています。ここでは、3 つのエネルギー依存性 cpTat、cpSec1、および cpSRP を介した経路を介して輸送アッセイと一緒に豆 (エンドウ) からトランスポート主務チラコイドの単離のため高収率手法について述べる。これらのメソッドは、生体膜、チラコイドのタンパク質の局在、輸送エネルギーおよびタンパク質輸送のメカニズムに関する実験を有効にします。

正常に輸送基質の量を測定するには、1 つまたは複数の「パーセント入力」車線を含めると便利です。以下に示すデータ、最終輸送反応をせずにチラコイドの 10% 使用しています。この「% 入力」前駆体基板のサイズを視覚化することができます。割合に対して輸送比較基板、基板の知られている、定義された量を表すことができます上下にタンパク質を用意して最初に必要な使用して、.さらに、バンド反りとスミア変換を避けるために 0.75 mm ポリアクリルアミドのゲルの単一の車線にクロロフィル同等の未満 4 μ g をロードすることをお勧めします。以下すべての基板との in vitro翻訳キットを使用して標識します。
CpTat 経路を介して iOE17 の輸送
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生理活性チラコイドの高収率分離のためにここのプロトコルおよび葉緑体ツイン アルギニン転流 (cpTat)、分泌 (cpSec1)、およびシグナル認識粒子 (cpSRP) のための蛋白質輸送アッセイを提案します。

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

この方法は、葉膜を横切るタンパク質輸送のメカニズムとエネルギー、およびプラスティド内のタンパク質の位置に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。チラコイドタンパク質ターゲティングのこの技術の主な利点は、温度、pH、イオン条件、前駆体濃度を含む輸送中のチラコイドの環境を完全に制御できることです。約55グラムのエンドウ豆を400ミリリットルの蒸留水に3時間浸すことから始めます。浸したエンドウ豆を土壌中のプラスチックトレイにまき、薄い層の朱色で覆われ、テキストプロトコルに記載されているように9〜15日間成長します。葉芽体分離の日には、15ミリリットルのポリカーボネート高速遠心管に15ミリリットルのパーコールと15ミリリットルの2xGBバッファーの混合物を遠心分離して連続的な密度勾配を調製し、ブレーキをオフにして摂氏4度で30分間固定角度ローターで900 gs。その後、約25グラムの9〜15日齢のエンドウ豆の芽を収穫します。冷やしたブレンダーで95ミリリットルの冷たい1xGBバッファーに、シャープブレードを加えます。そして均質化する。この混合物を少なくとも2層のチーズクロスでろ過し、冷やしたビーカーの上に漏斗に入れます。3,000 gsのスイングバケットローターに15ミリリットルのポリカーボネート遠心チューブを使用して濾液を摂氏4度で5分間遠心する。上清を捨て、ペイントブラシを使用してペレットを1ミリリットル(1xGB)にそっと再懸濁します。その後、ガラスポスチャピペットを使用して、Percoll勾配の上に画面サスペンションを慎重に重ねるようにします。ブレーキをオフにして摂氏4度で10分間、8,000 gsのスイングバケットローターで遠心分離します。ポスチャピペットを使用して再び慎重に新しい50ミリリットルポリカーボネートチューブに無傷の葉緑のバンドを入れ、1xIBバッファーの30ミリリットルを追加します。1,800 gsのスイングバケットローターのチューブを摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を捨て、1xIBの1ミリリットルのペレットをペイントブラシで静かに再懸濁します。同じ条件下で再び1xIBと遠心分離機の30ミリリットルで洗浄します。最終遠心分離後にペレットを1ミリリットル1xIBで再懸濁する。クロロフィル濃度を決定するには、完全に再懸濁した葉芽細胞の10マイクロリットルを80%アセトンの5ミリリットルと混合する。180マイクロメートルの厚さのフィルターペーパーを通して11マイクロメートルの細孔サイズをフィルターし、分光光度計によってクロロフィル濃度を決定する。冷たい1xIBを使用して、1ミリリットル当たり1ミリグラムに葉ロプラスト混合物を希釈します。cpTat輸送などの間質抽出物が必要ない場合にチラコイドの単離を開始するには、1.5ミリリットルチューブの内の遠心分離の無傷葉芽を1,000 gsで摂氏4度で6分間回転させる。その後、上清を捨て、低張性リシスバッファー内のペレットを再懸濁して、マイクロピペットで1ミリリットル当たり1ミリグラムを達成する。暗闇の中で氷の上でインキュベートし、時折10分間混合します。チロコイドを回復するために、3、200 gsのスイングバケットローターで8分間摂氏4度で遠心分離機。シロコイドを2回洗浄し、ペレットを1~2ミリリットルのリシスバッファーで再懸濁し、同じ条件で遠心分離します。最終遠心分離後、ペレットを1ミリリットルの1ミリリットルの1xIBバッファーで再懸濁し、先に実証したように分光光度計を用いて分離チロコイドにおけるクロロフィル濃度を決定する。CPSec1およびCPSRPエリクエータートのような間質抽出回復を必要とする経路については、1,000 gsのスイングバケットローターおよび遠心分離機で6分間摂氏4度で分離された葉芽の600マイクロリットル。葉芽細胞のリシスについては、600マイクロリットルの低張性ライシスバッファーでペレットを懸濁します。時折混合して暗闇の中で氷の上で10分間インキュベートします。その後、3、200 gsで4°Cで8分間スイングバケットローターでチューブを遠心分離します。ストロマを保存するには、新しいマイクロ遠心分離管に黄色の上清にライトグリーンを転送し、2倍の粗い間質バッファーの等しい量を追加します。チロコイドを洗うには、3,200 gsで摂氏4度で8分間、2巻のリシスバッファーと遠心分離機を加えます。1xIBでペレットを再懸濁して1ミリリットル当たり1ミリグラムのクロロフィル濃度を達成し、後で輸送アッセイで使用するために氷の上に置きます。42,000 gsの固定角度ローターで希釈した粗質を摂氏4度で30分間遠心して、粗野なストロマから残留膜を取り除きます。その後、各チューブから取られたボリュームに注意しながら、小さな黄色の緑色のペレットを乱さないように各チューブからボリュームの95%を収集します。濃縮された間質抽出物を調製するために、集めた上清をプールする。その後、4ミリリットル30キロリットルの分子量カットオフ濃縮器を使用して、抽出物を5倍に濃縮する。氷上の1.5ミリリットルチューブ内のcpTat輸送をアッセイするために、分離されたチロコイドを1ミリリットル当たり0.33ミリグラムの最終的なクロロフィル濃度に混合し、1xIBで調製した5ミリモルATP、および1xIBで調製した8ミリモルDTTを混合する。輸送を開始するために、輸送ミックスに基質タンパク質を導入する。1平方メートル当たり80~100マイクロインスタインを光合成活性放射線で10分間室温で10分間照射して、反応を行います。輸送反応を停止するには、懸濁液を氷冷1xIBで8倍に希釈する。3,200 gsの遠心分離機をマイクロ遠心分離機で摂氏4度で5分間、チロコイドを回収する。上清を捨て、120マイクロリットルの氷冷1xIBでペレットを再懸濁する。CPSec1またはPSRP経路をアッセイするには、氷上の1.5ミリリットルチューブに以下を混合します。チラコイドは、1ミリリットル当たり0.33ミリグラムの最終的なクロロフィル濃度、1ミリリットルクロロフィル相当の1ミリグラムの間質抽出物、および1xIBで調製された5ミリモルATPに対する。氷冷1xIBで目的の体積まで反応を持ち込み、氷の上で10分間インキュベートします。輸送を開始するために、この輸送ミックスに基質タンパク質の体積によって10%体積を導入する。1平方メートルあたり80~100マイクロアインシュタインで光合成活性放射を室温で10分間照射します。反応を止めるには、懸濁液を氷冷1xIBで8倍に希釈する。マイクロ遠心分離機で3,200gsの遠心分離機を摂氏4度で5分間。上清を捨て、120マイクロリットルの氷冷1xIBでペレットを再懸濁する。輸送されていない残留基質を除去するために、1ミリリットルのサーモリシン当たり2ミリグラム6マイクロリットル、1xIBに10ミリモルの塩化カルシウムを加えて外部タンパク質を消化する。このプロテアーゼ反応を氷上で40分間インキュベートします。1xIBで25ミリモルEDTAで容量を倍増させることでプロテアーゼをクエンチする。3,200 gsの遠心分離機をマイクロ遠心分離機で摂氏4度で5分間、チロコイドを回収する。上清を除去した後、回収したチロコイドを1xIBで5ミリモルEDTAの120マイクロリットルで回収し、新しい1.5ミリリットルチューブに移す。3,200 gsで再びマイクロ遠心分離機で摂氏4度で5分間遠心分離した後、上清を捨て、ペレットを適切な量のレムリサンプルバッファーに再懸濁させ、10ミリモルEDTAを補う。熱湯浴にサンプルを10分間入れます。SDS ページでサンプルの分析に進みます。cpTat経路を介したiOE17タンパク質の輸送は、導入された基質と成熟した処理された形態との間に2〜3キロダルトンのサイズシフトをもたらした。これは、cpTat輸送の成功を示すn末端シグナルペプチドの切断によるものである。サーモリシン処理は、正常に輸送され、したがってプロテウス耐性成熟バンドのみを残します。CPSec1経路を介したOE33前駆体の輸送は、成熟した基質におけるサイズシフト、および輸送された基質のプロテウス保護をもたらした。cpSRP経路を介してチロコイド膜にLHCP前駆体を挿入し、サーリシン消化を通じて評価し、1.5〜2キロダルトンのサイズシフトにつながった。これは、膜が完全なタンパク質分解から成熟したLHCP分解産物の未切断を保護するので、膜挿入に成功したことを示した。このビデオを見た後、エネルギー依存性cpTat、cpSec 1およびcpSRP経路を介してチロコイドとアッセイトランポーティを分離する方法をよく理解する必要があります。この技術を習得したら、3~4時間で適切に実行できます。このビデオでは説明されていませんが、光合成活性葉皮とチラシを分離して作業する際には、一般的にラボのオーバーヘッドライトを消しておいてください。この手順を試みている間、孤立した葉蓋とチラコイドを摂氏4度に保つことが重要です。最初は葉葉芽細胞をやさしく再中断してください。最初の中心のステップの後にプロコール勾配を乱さないようにします。さらに、パーセント入力サンプルは、輸送反応と並行して調製し、基質輸送を推定するために同じゲル上で実行することができる。放射性基質を扱うには、良心的な取り扱いと適切なPPEが必要であることを忘れないでください。開発後、この技術は、タンパク質ターゲティングの分野の研究者が、チラシ骨膜を横切るタンパク質輸送を支配するエネルギッシュ、キネティクス、ユニークなメカニズムを探求する道を開きました。

isolation-physiologically-active-thylakoids-their-use-energy

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

記載された比較、定量的プロテオミクスアプローチは、異なる条件下で多タンパク質複合体の組成物への洞察を得ることを目的と遺伝的に異なる菌株を比較することによって実証される。定量分析のためにショ糖密度勾配とは異なる画分の等し​​い体積を質量分析によって混合し、分析する。...

に基づいた多タンパク質複合体の比較分析のための新たなアプローチ<sup&gt; 15</sup&gt; N代謝標識および定量的質量分析

サンプル間のミトコンドリア膜電位の比較は、細胞の状態に関する貴重な情報をもたらします。ミトコンドリアを単離し、蛍光を使用して阻害剤およびアンカプラーに対する反応を評価するための詳細な手順について説明します。このプロトコルの方法と有用性は、細胞培養と細胞ストレスの動物モデルの使用によって説明されています。...

培養細胞およびマウス組織から単離とミトコンドリアの機能解析

プロテオリポソームは、明確に定義された生化学的環境で再構成された精製チャネルとトランスポーターを研究するために使用されます。これらのタンパク質によって媒介される排出を測定するための実験的手順が示されています。プロテオリポソームを調製し、記録を行い、再構成されたタンパク質の機能特性を定量的に決定するためのデータを分析するための手順について説明します。...

プロテオリポソー​​ムベースの流出アッセイのClの単一分子特性を決定する<sup&gt; -</sup&gt;チャネルとトランスポーター

ミトコンドリアは、植物細胞のわずかな割合は、彼ら研究の範囲を精製する必要があります。ミトコンドリアは、均質化、続いて高純度ミトコンドリア分画を取得する微分と密度勾配遠心法によってさまざまな植物器官から分離できます。...

分離とシロイヌナズナ由来のミトコンドリアの呼吸測定

フコキサンチン クロロフィル a/c 結合タンパク質 (FCP)...

分離してチラコイド脂質リポソームの珪藻峰 Meneghinianaから光捕集アンテナを組み込む

プロトコル植物の解明のためチラコイドのタンパク質の複雑な組織と組成ブルー ネイティブ ポリアクリルアミドゲルとゲルの電気泳動 (BN-PAGE) と 2 D SDS...

ブルー ネイティブ電気泳動によってチラコイド膜タンパク質複合体の解析

ネイティブ グリーン ゲル電気泳動による可溶化されたチラコイドの複合体を分離するためのプロトコルをご紹介します。緑のゲルのバンドが後で時間相関単一光子計数 (ピコ)...

Time-Correlated 単一光子のカウントを使用してネイティブ グリーン ゲル電気泳動とバンドによってほうれん草チラコイドのタンパク質複合体の分離

ここでは、シロイヌナズナの葉と 3 つメイン サブ コンパートメント (エンベロープ、質、およびチラコイド) から葉緑体を浄化する手法について述べる差動遠心、連続 Percoll の勾配の組み合わせを使用して、蔗糖不連続密度勾配。メソッドは subplastidial...

免疫ブロットやプロテオミクスによるタンパク質局在の解析シロイヌナズナから葉緑体小班の準備

プロテオームスケールでのタンパク質の発見と定量に適合する高品質のミトコンドリア単離のための2段階プロトコルを提示します。私たちのプロトコルは遺伝子工学を必要としないため、あらゆる初代細胞や組織からのミトコンドリアの研究に適しています。...

タンパク質の発見と定量を改善するためのミトコンドリアの2段階タグフリー分離

AviTag特異的位置制限照明強化ビオチニル化(ALIBi)は、リボソームの細胞内集団を標識し親和性を精製し、下流のシーケンスおよびプロテオーム解析のために開発された新しいオプトジェネティック活性化法です。...

組換えペプチドタグ特異的位置制限照射強化ビオチニル化に基づく細胞内リボソームサブポピュレーションの単離

学ぶ、エンドウ豆を用いた生理活性チラコイドの高収率分離法と、葉緑体膜を横断するタンパク質輸送のエネルギー依存性メカニズムを解析するアッセイ手法。精密な環境制御が可能なこのプロトコルは、植物細胞内のプラスチドタンパク質局在の研究に貢献します。

生理活性とエネルギー依存性タンパク質輸送アッセイでの使用の分離

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