Name: 誘導およびリバーシブルのドミナント ネガティブ (DN) 蛋白質の阻害 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 学ぼう、ドミナントネガティブ誘導システムを用いたタンパク質の条件付き不活化法。RBタンパク質を例に、マルチマーおよびモノマータンパク質の機能解析に応用可能な可逆的阻害技術を解説する。

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PCS2 + CB Myc6 ベクトルだったマーシャル ・ ホロウィッツ (ワシントン大学, シアトル、ワシントン州、米国) からの贈り物。丙 OC1 セルは、Fedrico Kalinec (デイヴィッド ・ ゲフィン医学カリフォルニア大学ロサンゼルス校、ロサンゼルス、カリフォルニア、米国) によって提供された親切。テクニカル サポートは、UNMC マウスのゲノム工学中心 (C.B. Gurumurthy、ドンは害を与える、・ ローレン クアドロス)、クレイトン大学統合医学イメージング施設 (リチャード ・ Hallworth、ジョン ・ Billheimer) によって提供されました。番号 P20 GM103471 を付与 UNMC マウスのゲノム工学の NIH/日の出から機関の開発賞 (アイデア) 支えられました。統合生体イメージング施設は、クレイトン大学医学部医学科 GM103427 と NIH/日の出から GM110768 の補助金によって支えられました。研究資源 (RR016469) センターからの助成金からの支援で建設された施設と日の出 (GM103427)。本研究では生成されたマウスの行は、クレイトン大学動物資源機能、NIH/NCRR/G20RR024001 での助成金による向上とその経済基盤で維持されました。この作品は、過去の NIH/NCRR/5P20RR018788-/NIH/日の出 8P20GM103471 COBRE 付与 (シェリー d. スミス) に、NIH/ORIP R21OD019745 01A1 (滿 s.)、および (S. Tarang) に公聴会健康づくり財団から新興の研究助成による支援を受けた。本研究の内容は著者の責任し、国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。

トランスジェニック マウスの CBRb の動物の世話と研究に関連する実験のすべての世代はクレイトン大学施設動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) により承認され、彼らのガイドラインによって実行されます。
1. 遺伝子組換え CB Myc6-Rb1 コンストラクト
注:CBRb の pTet_Splice のベクトルへのクローニングは、複数の手順 (図 1 aと1 b) で行われました。
<ol><li>
最初のステージ pCS2 + CB Myc6 ベクトルにクローン作成を実行します。
	<ol>
<li>CBRb 遺伝子コンストラクトを作成、次のプライマーを用いた RB1 蛋白質の 1583 bp 長Rb1 cDNA 断片 (528 のアミノ酸アミノ酸領域 369-896 に対応する) を増幅する設定: EcoRI +RB 1243F、GGGGAATTCAを使用TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTCと XbaI + EcoRV +RB 2826R、CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCCを使用します。</li>
		<li>クローン フラグメントには、pCS2 + 前述1,12CB Myc6 ベクトルのEcoR1とXbaI制限のサイト間 (1546 bp) が生成されます。 注: 1012 bp 長 CB Myc6 構築 (337 アミノ酸) Rb1フラグメントに融合結果内因性 RB1 蛋白質 (~ 110 kDa) よりわずかに小さいである約 865 アミノ酸 (約 108 kDa) のタンパク質 (図 1 )、N 末端と C 末端のRb1の CB Myc6タグに。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PTet スプライス ベクトルに 2 番目のステージの subcloning を実行します。
	<ol>
<li>CB RB Myc6 融合フラグメントを増幅してテト プロモーターを得るために、増幅EcoRV (XbaI + EcoRV + RB 2826R) とサリサイトを含むプライマーを用いてCB myc6 Rb1から成るカセット: サリ +CBf、CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTCを使用します。</li>
		<li>PTet スプライス ベクトル、サリとEcoRV制限サイトのように間に生成されたフラグメント (2567 bp) を subclone SV40 イントロン、ポリアなど全体の重音テト DN CB myc6 Rb1遺伝子の信号方法ノッティ(図 1B) と 1 つの消化を分離することができます。 注: 東北大学からのフラグメントは、トランスジェニックの資金提供者の生成に使用されました。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2重音テト DN CB myc6 Rb1遺伝子の体外試験で
<ol><li>
Dox-規則: NIH3T3 細胞株 注:明記されていない限り、6 ウェル プレートのすべてのボリュームを調整されています。<ol>
<li>NIH3T3 細胞 10% CO2と 37 ° C で 10% 牛胎児血清を含む推奨される細胞培養媒体を使用して、ベンダーの仕様を成長します。</li>
		<li>PTet 継手とセルを cotransfect し、24 時間の (手順 1) から pCMV Tet3G ベクトル失うか、下記手順に従ってください。<ol>
<li>脂質ベースのトランスフェクション試薬/井戸の 2-4 μ L と 1 mL の (血清) せずに不完全なダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 室温で 5 分間混ぜます。12 または 24 ウェル プレートそれぞれ、文化、メディアの 250 または 500 μ L を使用し、トランスフェクション試薬の音量を調節します。</li>
			<li>トランスフェクション試薬 DMEM にプラスミド DNA/ウェルの 2-3 μ g を追加し、室温で 20 分間インキュベートします。</li>
			<li>DNA と各ウェルに DMEM でトランスフェクション試薬を含むミックスを追加します。インキュベーションの 3-4 時間後 (つまり、最終巻は 2 mL/も) 完全なメディアの 1 つの mL を追加します。Dox 株式 (1 mg/mL) の因数を維持し、井戸 (+ Dox) の各 2 μ L を追加します。5% CO2と 37 ° C でセルを孵化させなさい。 注:コントロールのサンプルは Dox と扱われない cotransfected 細胞に成るべきである (-Dox)、NIH3T3 細胞転写活性化 pCMV Tet3G ベクトルのみをトランスフェクトした、24 時間の治療を Dox と同様。PCMV-Tet3G、濃度の 0.1-1 μ G/ml Dox は、導入遺伝子の発現を誘導するために十分なはずです。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
HEK293 細胞ラインを使用して、構成の可逆性をテストします。
	<ol>
<li>重音テト DN CB myc6 Rb1遺伝子の可逆性、HEK293 細胞でワシの最低不可欠な媒体 (実装された EMEM) 次のベンダーの仕様をテストし、前述の 24 h の pTet 継手と pCMV Tet3G の両方のベクトルと cotransfect上記の (ステップ 2.1.2)。</li>
		<li>遺伝子不活化の 24 h 後 Dox を含むメディアを削除し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) でセル 2 x-3 x を洗浄し、さらに 24 時間 Dox 自由な媒体のそれらを孵化させなさい。 注:Dox 取り外した遺伝子不活性化および通常蛋白質の表現は、24 h 以内に再開されるべき。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
スケジュールされていない細胞増殖を促進する上での重音テト DN CB myc6 Rb1コンストラクトの機能を評価するために下記のとおり、丙 OC1 のセルラインを使用して解析を実行します。
	<ol>
<li>文化丙 OC1 細胞 10% の下で寛容な DMEM 条件 (10% CO2の 33 ° C)。細胞増殖研究 200 μ L のボリュームの 96 ウェル プレートでセル カウンターとプレート 10,000 丙 OC1 細胞を使用して細胞を数えます。セルを一晩インキュベートします。</li>
		<li>次の日に脂質ベースのトランスフェクション試薬を用いた pTet スプライス pCMV Tet3G ベクターの過渡失うかを実行 (手順 2.1.2 参照)。個別の井戸で pmR ZsGreen1 トランスフェクション at2 μ トランスフェクション率を計算する (ステップ 2.1.2) 脂質ベースのトランスフェクション試薬を使用してを実行します。コントロールとして非 transfected セルを使用します。</li>
		<li>蛍光顕微鏡下で緑色蛍光を検出 (励起 = 485 nm、発光 = 530 nm) の transfected セル トランスフェクション後の 24 h。緑の蛍光性の有無を記録し、DAPI (総細胞) の付いたセルに GFP 陽性細胞 (transfected セル) の総数としてトランスフェクションのレートを計算します。 注:〜 70% の導入率を推定しました。</li>
		<li>遺伝子発現を誘導して、1 μ g/mL Dox を transfected セルのサブセットに制御として他のサブセットを使用しながら追加 (-Dox)。追加のコントロールとして未処理丙 OC1 セルを使用します。</li>
		<li>細胞増殖を評価するために、製造元のプロトコルに従って細胞増殖キットを使用します。<ol>
<li>簡単に言えば、トランスフェクション後、48 h は細胞培養液を取り外して、マイクロ プレートの各ウェルに 100 μ L の色素結合ソリューション x 1 を追加します。37 ° C で 1 時間インキュベートします。</li>
			<li>その後、蛍光マイクロ プレート リーダーを使用して各サンプルの蛍光強度を測定 (励起 = 485 nm、発光 = 530 nm)。</li>
		</ol>
</li>
		<li>さらに免疫細胞化学を使用して細胞増殖を評価、12 ウェル プレートでカバーガラスの丙 OC1 細胞をプレート、37 ° C で一晩インキュベートするには<ol>
<li>次の日、pTet 継手と pCMV Tet3G cotransfect し、Dox 治療 (+ Dox) を実行します。融合細胞をコントロールとして使用します。プロセス丙 OC1 ki-67 標識細胞。</li>
			<li>PBS、pH 7.4 では、室温で 10 分間で 4% パラホルムアルデヒド (PFA) で細胞を固定します。洗浄セル 3 x 氷冷 PBS で 10 分 PBS で 0.25% 非イオン性洗剤で細胞をインキュベートし、。</li>
			<li>セルを洗浄して 5 分、室温で 1 時間加湿チャンバーで 10% 血清を使用してブロックの PBS で再度、3 x。</li>
			<li>室温で 3 h の Ki 67 一次抗体 (希釈 1: 200) を 500 μ l 添加のセルを孵化させなさいまたは 4 ° C で一晩</li>
			<li>3 セルを洗浄する PBS と 5 分のための倍。その後、暗闇の中で部屋の温度で 1 時間の二次抗体と細胞をインキュベートします。</li>
			<li>二次抗体溶液を取り外して洗浄セル 3 x PBS と暗闇の中で 5 分間。</li>
			<li>ファロイジン ラベルは、30 分の 1: 200 ファロイジンの丙 OC1 セルをインキュベートします。細胞の核にラベルを付ける、室温で 10 分間の 5 μ g/mL DAPI でセルをインキュベートします。 注:ファロイジン色素共役が二次抗体の共役と異なることを確認します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3 世代 CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb) のトランスジェニック マウスおよび DN CBRb アプローチの生体内テストで
<ol><li>重音テト DN CB myc6 Rb1遺伝子の効果的な Dox 規制の確認後は、東北大学からのフラグメントを浄化し、擬似妊娠した女性に後で転送されるマウス受精卵にそれらを microinject します。 注:これらの手順は、ネブラスカ大学医療センター (UNMC) マウスのゲノム工学中核施設で行われました。</li>
	<li>産後、遺伝子のプライマーを使用して子犬CB Rb1融合領域に固有の設定: CBRb F、5' 3 CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG ', を使用し、CBRB R、5 'GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC 3' を使用します。 注:Agarose のゲルで観察された PCR の製品サイズは 401 bp (60 bp CB 地域 + 341 bp Rb1地域 (表 1)。重音テト DN CB myc6 Rb1遺伝子の存在に基づいて 10 の独立した創業者行が識別されました。これらの行の 5 つ、子孫継承遺伝子、遺伝子の生殖細胞系の伝送を確認しました。トランスジェニックのラインの 1 つは最終的に確立、ラインを維持して、さらなる研究のための実験の重音テト DN CB myc6 Rb1動物を生成する使用されました。</li>
	<li>実験の DN CBRb マウスを生成するローザ CAG 情報を頼むことテトラサイクリン誘導ライン (株式 #006965) (また、tTA インデューサ ラインに品種) に重音テト DN CB myc6 Rb1成体を飼育します。この次のプライマー セットを使用して十字の子孫の遺伝子型: 情報を頼むこと WT R 用 GGAGCGGGAGAAATGGATATG;情報を頼むこと突然変異体 R、GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC; を使用します。情報を頼むこと共通、AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT を使用します。PCR の製品のサイズが 340 bp (変異) 340 bp と 650 bp (ヘテロ) と 650 bp (野生型)。</li>
	<li>次の時間と、遺伝子発現を引き出すために必要な Dox 治療の長さを決定する Dox 治療 RB1 蛋白質の用量-反応曲線を生成します。 注:この実験では、西部のしみ、qRT PCR は組織特異遺伝子の活性化と RB1 の式を評価するために使用されました。</li>
	<li>蛍光現場の交配 (魚) 遺伝子のゲノムの挿入を確認するを実行します。 注:これ実施したセンターで病院の応用ゲノム病児 (トロント、カナダ)。遺伝子の活性化、組織特異性および内因性の POI のレベルの変化を評価するためには、ELISA やウェスタンブロッティング (蛋白質特定の抗体を使用して) を使用できます。DN-CB-myc6-Rb1コンストラクト アンチ RB1 抗体を使用しました。</li>
</ol>

<ol><li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+MyoD+homodimer+formation+demonstrated+by+a+general+method+of+dominant+negative+mutation+employing+fusion+with+a+lysosomal+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease.</a> Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).</li>
<li>Tarang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+retinoblastoma+%28rb%291-inducible+dominant-negative+%28DN%29+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model.</a> Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).</li>
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</ol>

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伝統的な形質転換戦略に関連付けられている制限を回避するために我々 は内因性ポイを時空間的にそれの DN の変異形を ⓫ 条件付きで不活性化することができますマウス モデルを生成しようと思う。内因性のランドマークの機能を廃止するには、いくつかのオプションは、15,,16,17をされています。式の表現に影響を与える突然変異体のペプチドを生成するライソゾーム プロテアーゼ CB の融合を用いた簡単な戦略に Dox 依存型転写システムを組み合わせることにより以前の遺伝の作戦1を変更しました。ポイの内因性2。最も重要なは、この方法には、ポイに関連付けられている経路の事前知識は必要ないです。DN タンパク質阻害する現在の戦略は、リソソーム2,3に向けて全...

遺伝子および蛋白質の試練を目指すほとんどのアプローチは、一般的に完全な除去や遺伝子、rna、または興味 (POI) の蛋白質の切り捨てにつながる永続的なプロセスに依存します。このメソッドの全体的な目標は、内因性、野生型タンパク質の機能を廃止する組換え蛋白質をエンジニア リングすることです。再訪し、DN の抑制を介してポイの一時的なアブレーションは、代替戦略1,2を刷新しました。このメソッドは、ポリコームタンパクと単量体ペプチドの両方のために働くが、ポリコームタンパク アセンブリ内で機能する蛋白質に最適です。
メソッドは、溶断ポリコームタンパク ポイ (CB 融合タンパク複合体) のサブユニットにライソゾーム プロテアーゼ CB で構成されます。複雑な結果の CB の融合との対話し生内因性のタンパク質を消化したり劣化3リソソームに全体の CB-POI の複合体をそらします。また、テトラサイクリン制御転写活性化 (重音テト) 系の誘導の自然と、CB 融合タンパク複合体の組み合わせは、リバーシブル ファッション2遺伝子の誘導と制御式にできます。多くの状況で有用遺伝子または蛋白質の生体内での完全な削除は致死率4,5,6で起因できます。同様に、それは最終的には、重要なゲノムの要素7の永久的な損失につながるのいくつかの遺伝子または蛋白質 Cre/Lox システムを使用して組織に固有の条件付きの削除は簡単にできません。したがって、遺伝子や POI によってこれらのアプローチのどちらも有効であるその後の研究のための有用なモデルを提供する特に遺伝子または蛋白質の後半の産後と大人のマウスの機能の研究。
提案手法の有効性に関する証拠の原則そのようなアプローチに関連する問題を回避し、提供、我々 は網膜芽細胞腫 1 (RB1) 蛋白質の条件付き DN バージョンを生成することによって、ここで紹介する方法をテストする分野します。いくつかのオプションは、内因性 RB1 の機能を廃止する提案8,9,10をされています。しかし、それらのすべての上記で説明した同じ制限に直面: RB1 の永久的な生殖削除は強肩致死、その腫瘍サプレッサーの役割と永続的な一貫性のある RB1 条件付き削除へとつながって様々 な腫瘍11。にもかかわらず、RB1 の DN バージョンは、自然に発生するとは思えない、現在利用可能な戦略をより良い代替手段が内因性の RB1 の一時的に制御された不活性化を可能にする、最終的に復元する別のメカニズムを提供する、関数。そのような構築のための基礎は前に二十年以上に述べた1。ただし、技術的な制限のためには組織特異性、応答制御遺伝子の活性化機構を欠けていた。本研究ではドキシサイクリン (Dox) の優雅を結合する最初のライソゾーム プロテアーゼ CB とRb1蛋白質の組み換え遺伝子組換えコンストラクト依存転写システム。結果の CBRb マウス モデルは、一時的に規制 Dox を介した RB1 規制2。プロテオーム ベースのアプローチを使用して遺伝子の働きを研究するの利点は、それがその活動を最小限の情報で関心の任意の遺伝子が採用されることがあります。
DN 遺伝子手法では、従来の方法に比べて多くの利点を提供しています。まず、DN タンパク質阻害は蛋白質の活動、したがって残留内因性表現を維持にのみ部分的なアブレーションに します。そのような結果は蛋白質の活動の完全な除去が胚性致死率は、大きく生きているマウスの遺伝子の機能を研究する任意の調査を制限することにつながるような状況で非常に望ましい。第二に、重音テト システムの存在は、遺伝子活動の効率的かつ可逆的な制御が可能の抗生物質の存在下でのみ遺伝子活性化できます。したがって、抗菌薬の投与を中止、形質転換システムは非アクティブにできますと通常の RB1 式は元の場所に。第三に、導入遺伝子発現の特異性は、任意のプロモーターによって異なります。原理実証のためのユビキタス ローザ CAG プロモーターをいただいて、組織固有のプロモーター遺伝子を配置することは不要な遺伝子発現を制限し、この遺伝子治療への応用に関する研究を促進する可能性が高い方法論。

<table><tbody><tr><td>ダルベッコの修正イーグルのミディアム、DMEM</td><td>GIBCO-BRL</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>最小エッセンシャルミディアムイーグル、MEME&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>M8042</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>F2442&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン&nbsp;</td><td>ダルマフェクト</td><td>T-2010-03</td><td></td></tr><tr><td>サル I</td><td>ロシュ</td><td>11745622</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV-HF</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>R3195S</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>ロシュ</td><td>13090730</td><td></td></tr><tr><td>CaspaTag&nbsp;</td><td>ミリポア</td><td>APT523</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>スタウロスポリン</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>CyQuant NF細胞増殖キット&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C35007</td><td></td></tr><tr><td>網膜芽細胞腫 1抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab6075</td><td></td></tr><tr><td>c-Myc 抗体</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M5546</td><td></td></tr><tr><td>b-アクチン</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>A5316</td><td></td></tr><tr><td>キ67&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>MA5-14520</td><td></td></tr><tr><td>ファロディン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>蛍光マイクロプレートリーダー</td><td>FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>落射蛍光顕微鏡&nbsp;</td><td>NikonEclipse80i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) マウス系統は、Jackson LaboratoryからJAX#032011として入手可能です。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

誘導およびリバーシブルのドミナント ネガティブ (dn) 蛋白質の阻害

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

ドミナント ネガティブ (DN) タンパク質阻害タンパク質の機能を操作するための強力な方法は、他のゲノム情報に基づくアプローチに比べていくつかの利点を提供しています。たとえば、キメラがCre LoxPターゲット戦略が広く使用されている、(すなわち、漏れのプロモーター活性、モザイクCre式等)、これらの戦略の本質的な制限は制限が大幅にアプリケーション。また、多くの内在性遺伝子の完全な削除、強肩致命的、生後の遺伝子機能を研究することは不可能です。これらの課題に対処するため我々 は初期遺伝子工学プロトコルを大幅に変更し、ライソゾーム プロテアーゼの Rb1 遺伝子の短い (遺伝子組換え) バージョンの併用 procathepsin B (CB)、Rb1 の DN マウス モデルを生成する (CBRb)。ライソゾーム プロテアーゼの存在のために全体の CB RB1 融合タンパク質およびその相互作用の複合体はプロテアソームを介した分解にルーティングされます。また、遺伝子導入構成体のテトラサイクリン誘導 (情報を頼むこと) 要素の存在により RB1 蛋白質の誘導性かつ可逆的な規制です。CBRb マウス モデルにおけるユビキタス ローザ CAG プロモーターの存在はそれに一時的の Rb1 遺伝子アブレーションを実施し、研究者に事実上任意のセル型での活動を理解するためのリソースを提供する便利なツール、RB1 が表されます。

一般的には、DN の突然変異を設計するには、大量の構造に関する情報と POI の機能が必要です。対照的に、POI の構造と機能情報が限られた場合、ここに示す DN 戦略は特に役立ちます。ライソゾーム プロテアーゼに 1 つのサブユニットの融合支配的組み立て多量体と、潜在的に、内因性サブユニットのタンパク質分解との細胞の転換の組み合わせにより他の配位子を抑制できるポリコームタンパク タンパク質が場合、リソソームに多量体。安定、情報を頼むことを示したマウス NIH3T3 細胞にトランスフェクションはコンストラクトのクローニングに成功を確認し、Dox 規制遺伝子活性化、重音テト DN CB myc6 Rb1を含んでいる精製 pTet スプライス プラスミッドの有効性をテストするには蛋白質、しかしない Rb113。Dox のない場合は、情報を頼むことを表現するセルは表示されません RB1 式堅牢な RB1 式は Dox (図 2A</str...

ここで任意のタンパク質をそれのドミナント ネガティブ変異体バージョンを元に戻せる状態 ⓫ 条件付きで不活性化することができます、ドミナント ネガティブ誘導システムを開発するためのプロトコルを提案する.

誘導およびリバーシブルのドミナント ネガティブ (DN) 蛋白質の阻害

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

この方法は、支配的な陰性バージョンを可逆的に過剰に発現させることによって、関心のある遺伝子の条件付きおよび一過性不活性化を必要とする多種多様な分野の主要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、タンパク質活性の部分的なアブレーションのみを可能にし、したがって、残留内因性発現を維持する点である。しかし、ここで多量体集合体で機能するRBタンパク質の不活性化状態について述べ、この方法論は単量体タンパク質にも適用できる。ウメシュ・ピャクレル、私たちの研究室の技術者と原稿の共著者は、手順を示します。まず、NIH3T3細胞を成長させます, ベンダーの仕様に従って, 摂氏37度で 5%CO2, 10%牛血清を含む推奨細胞培地を使用して.pTet-SpliceおよびpCMV-Tet3Gベクターを用いて細胞をコトランスフェクトするには、まず15ミリリットルチューブで脂質ベースのトランスフェクション試薬を2~4マイクロリットル、15ミリリットルチューブで1リットルの不完全なDMEMを1ml混合し、室温で5分間インキュベートする。このトランスフェクション試薬のDMEMミックスに、井戸当たり2~3マイクログラムの血漿DNAを追加します。室温で20分間混ぜ合わせてインキュベートします。DNAとトランスフェクション試薬を含む混合物を、NIH3T3細胞を有する6ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットル添加する。5%CO2で摂氏37度で3〜4時間のインキュベーションを行った後、完全な培地を1ミリリットル加えます。次に、各ウェルに2マイクロリットルのドキシサイクリンストックを加え、プレートをプラスドキシサイクリンとしてマークします。5%CO2で37°Cで細胞をインキュベートします。予定外の細胞増殖を促進する上でのTetO-DN-CB-myc6-Rb1構築物の機能性を評価するために、10%FBSを含有するDMEM中の培養HEI-OC1細胞を、寛容な条件下で行った。細胞増殖試験では、細胞カウンターを用いてHEI-OC1細胞を数える。プレート 10,000 HEI OC1 細胞は、それぞれ 200 マイクロリットルの体積で 96 ウェル プレート上のウェルあたり。5%CO2で摂氏33度で一晩で細胞をインキュベートします。トランスジーン発現を誘導するには、トランスフェクトしたHEI-OC1細胞のサブセットに、ドキシサイクリンのミリリットル当たり1マイクログラムを加える。マイナスドキシサイクリンと非トランスフェクトHEI-OC1細胞としてラベル付けされた他のサブセットをコントロールとして使用し、細胞を10%CO2で摂氏33度としてインキュベートします。細胞増殖を評価するために、トランスフェクションの48時間後に、細胞培養培地を取り出し、細胞増殖キットからマイクロプレートの各ウェルに100マイクロリットルの100マイクロリットルの色素結合溶液を加える。メーカーのプロトコルに従い、摂氏37度で1時間インキュベートします。蛍光マイクロプレートリーダーを使用して、各サンプルの蛍光強度を測定します。免疫細胞化学を用いて細胞増殖をさらに評価するには、HEI-OC1細胞をDMEMの12ウェルプレートの各ウェルに置かれたカバーガラスに盛り付けます。セルを摂氏33度で一晩インキュベートします。翌日、pTet-SpliceとpCMV-Tet3Gベクターを用いて2つのウェル内の細胞にコトランスフェクトし、NIH3T3細胞で行われた1つのウェルでドキシサイクリン処理を行います。1 つの未感染をコントロールとして使用します。Ki-67標識用の細胞を処理するには、室温で10分間PBSで4%パラホルムアルデヒドで固定します。その後、氷冷PBSでそれぞれ5分間3回洗います。PBSに0.25%の非イオン洗剤を加え、10分間インキュベートします。PBSで3回、それぞれ5分間洗浄を繰り返します。細胞をブロックするために10%の血清を使用してください。室温で1時間加湿したチャンバーで。Ki-67一次抗体を500マイクロリットル加え、摂氏4度で一晩インキュベートします。細胞を再びPBSで3回、それぞれ5分間洗います。二次抗体を1ミリリットル加え、暗い温度で1時間細胞をインキュベートします。二次抗体溶液を除去した後、再び細胞を暗所のPBSで5分間3回洗浄する。HEI-OC1細胞にファロイジンを標識するには、1:200ファロイジンで室温で30分間インキュベートします。細胞核にラベルを付けるには、DAPIの1ミリリットル当たり5マイクログラムの細胞を室温で10分間インキュベートする。トランスジーンマウスの送達後、原稿に記載されているようにCBRb1融合領域に特異的なプライマーセットを用いて子犬を遺伝子型化する。成体TetO-DN-CB-myc6-Rb1マウスをROSA-CAG-rtTAおよびテトレサイクリン誘導体ラインに繁殖させ、実験DN-CBRbマウスを生成し、原稿に記載されているように子孫を遺伝子型化する。NIH3T3は内因性RB1タンパク質を発現しないため、ここで見られる堅牢なRB1発現は、Doxの存在下でのトランスジーン誘導によるもので、その存在しない場合、TetO-DN-CB-myc6-Rb1ミックスRB1構築物の効率的な活性化を確認する。これに対し、HEK293細胞は内因性RB1発現を有する。ドキシサイクリンの添加により、テト-DN-CB-myc6-Rb1活性化およびRB1ダウンレギュレーションが行なわれます。RB1発現は、ドキシサイクリンを培地から除去した21時間後に再開した。HEI-OC1細胞は同じベクターでコトランスフェクトされ、ドキシサイクリンで処理されていないトランスフェクト細胞と比較してドキシサイクリン治療に続く細胞数の緩やかだが有意な増加を示した、および未感染細胞。蛍光インシンハイブリダイゼーションは、マウスにおけるTetO-DN-CB-myc6-RB1トランスジーンのゲノム挿入を確認した。ドキシサイクリンで治療したトランスジェニックマウスの全RB1タンパク質発現の初期増加は、対照群と比較して3日間であった。しかし、7日間および10日間ドキソサイクリンで治療した群では、RB1発現の有意な低下が観察された。分析した組織に関係なく、ドキソサイクリンで治療されたトランスジェニックマウスではRB1タンパク質の有意な減少が認められたが、対照群では認められず、TetO-DN-CB-myc6-RB1構築物の効率を確認した。この手順を試みる際には、トランスジーンの各コード要素が互いにフレームに入っていることを確認することが重要です。この報告書に記載されているカテプシンBとレチノ芽腫のコード領域が偶然、フレーム外に接続されていた場合、意図した融合タンパク質は得られないだろう。したがって、DNA配列の検証は、トランスジーンを単細胞マウス胚に注入する前に行う必要があります。この手順に従って、ユビキタスCAGプロモーターは、細胞の特異的な方法で遺伝子機能を研究するために特定のプロモーターに置き換えることができる。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

誘導性と目的の遺伝子のcDNAを過剰発現可逆またはshRNA媒介ノックダウンしたヒト細胞株を生成するために迅速かつ簡単な方法です。この方法は、確実に研究を可能にし、高度な再現性一過性トランスフェクションの方法または従来のノックダウン/ノックアウト戦略によって変更することは困難である細胞株を操作します。...

テトラサイクリン誘導性（テトオン）shRNAまたはcDNA発現で安定ヒト細胞株の世代

ここで述べられている方法は、抗アポトーシス細菌のエフェクタータンパク質の活性を解剖するために、定義されたステップでアポトーシスシグナル伝達カスケードを誘導するために使用されます。この方法は、アポトーシス促進性または毒性タンパク質の誘導性発現、または他のシグナル伝達経路との干渉の解剖にも使用できます。...

誘導発現系を適用すると、細胞内シグナル伝達と細菌の病原性因子の干渉を研究するために、

ここでは、大腸菌の複製フォークを失速させ崩壊させるための、部位特異的で可逆的なin...

サイトを誘導する具体的なレプリケーション閉塞中<i&gt; E。大腸菌</i&gt;蛍光プレッサーオペレータシステムの使用

このプロトコルは、単球/マクロファージにおける腫瘍微小環境の募集に腫瘍細胞由来タンパク質の役割を研究するため特に癌細胞とその後続の使用で機能するテトにシステムを設定するためのスキームとして機能します。...

単球/マクロファージにおける腫瘍微小環境の採用を検討する癌細胞株における遺伝子発現の条件付きのノックダウン

このプロトコルでは、生きた動物の細胞強化lacリプレッサーとテト活性化システムを使用して興味の内因性遺伝子のトランスクリプションを条件付きで制御できるモデル...

体内の内因性遺伝子操作のリモート制御システムのアプリケーション

編集を表す DNA エピゲノム強力な治療アプローチを対象としました。このプロトコルは、生産、精製、ひと誘導多能性幹細胞 (こと) のエピゲノム編集アプリケーションに CRISPR dCas9 DNMT3A 遺伝子をかくまっているオール ・ イン ・ ワン...

レンチウイルスベクター人間にエピゲノム編集ツールの効率的な配信用誘導多能性幹細胞由来の疾患モデル

ここでは、低分子Shield-1の下で定期的に間隔を合わせた短いパリンドローム反復(CRISPR-)関連タンパク質9(Cas9)の時間的および条件付き安定化に基づくゲノム編集ツールについて説明する。この方法は、培養細胞および動物モデルに使用することができる。...

条件Cas9安定化を用いた遺伝子機能評価のための新しいツールキット

ATP依存クロマチンリモデラーとDNAリガンドとの相互作用は、CD分光法を用いて説明されている。生成されたピークによって分析された遺伝子プロモーター上の誘導された立体構造変化を使用して、転写調節のメカニズムを理解することができる。...

DNA-タンパク質相互作用を研究するためのCD分光法

ここでは、高い、長期にわたる、安定したオンターゲットサイレンシング効率と、低いゲノムワイドなオフターゲット活性を持つ、遺伝子操作された転写抑制因子(ETR)の in vitro...

イン・ビトロ 標的エピジェネティックサイレンシングのための遺伝子操作転写リプレッサーの選択

この研究は、pMGXプラスミド系を用いて、 大腸菌（Escherichia coli）における単一のプラスミドからの複数の遺伝子のT7媒介性同時発現のための方法を記載する。...

誘導性T7 RNAポリメラーゼ媒介マルチ遺伝子発現システム、pMGX

学ぼう、ドミナントネガティブ誘導システムを用いたタンパク質の条件付き不活化法。RBタンパク質を例に、マルチマーおよびモノマータンパク質の機能解析に応用可能な可逆的阻害技術を解説する。

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