Name: リネージュの赤芽球系前駆細胞に成体マウス線維芽細胞のリプログラミングを直接します。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: 学ぶマウス線維芽細胞から赤芽球系前駆細胞への直接リネージュリプログラミング法。転写因子操作により造血機構と輸血医学への応用可能性を研究します。

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レトロ ウイルス ライブラリを生成するために使用するプラスミドの多くを提供するクローニングとハーヴェイ Lodish (ホワイト ヘッド研究所)、イブ王とグレゴリー ・ ハイド (ホワイト ヘッド研究所、ケンブリッジ、MA) に感謝します。IEP 生産の説明での役割、Kavitha シヴァとソフィー Singbrant (分子医学、遺伝子治療、ルンド大学)、ヨーラン カールソンと Shamit Soneji (分子血液学の部門、ルンド大学) に感謝します。認め、ジュリアン ・ Pulecio (再生医療センター、バルセロナ医研究公園)、ビオレッタ レーヨン エストラーダ (ロックフェラー大学、ニューヨーク)、カール ・ スタッフ ・感謝も申し上げます (セント ・ ヴィンセント ・医学研究所とセントヴィンセントの病院、メルボルン大学の部門)、スペイン ・ ラヤ (研究や高度な研究、バルセロナのカタロニア語機関) とビジェイ G. Sankaran (ブロード研究所の技術とハーバード、ケンブリッジのマサチューセッツ大学) この作品へ以前の貢献。この作品は、(j. f.); にラグナル協会財団によって支えられました。スウェーデン研究評議会 (に j. f.)。Stiftelsen オルレ Engkvist Byggmästare (に j. f.)。スウェーデン (j. f.); に戦略的研究財団Åke ウヰーベルグ財団 (に j. f.)。(j. f.) に助成金統合マリー キュリー。

1. 確立及び維持プライマリ マウス尾先端培養線維芽細胞
<ol><li>0.1% ゼラチンで表面をカバーし、37 ° C で約 20 分の料理をインキュベート (1 尾 10 cm 皿をお勧めします) ゼラチン コーティングの料理を準備します。お皿からゼラチン溶液を吸引、少なくとも 2 時間乾燥するようにし、なさい。</li>
	<li>頚部転位によってマウスを安楽死させます。尾の根元切断ハサミ尾を削除します。ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) で尻尾 2% ウシ胎児血清 (FBS) を使用する準備ができるまで入れて下さい。 注: 最良の結果をツインテール取られるべきマウスから年齢の約 6 〜 8 週間。ツインテールは、マウスの年齢、繊維芽細胞の増殖能力と減少11をリプログラミング効率として 8 週齢、しかしより古いマウスから取ることができます。</li>
	<li>無菌条件下でティッシュ文化フードのこのプロトコルのすべての後続の手順を実行します。0.02% トリプシン-EDTA DPBS の希薄トリプシン溶液を調製し、ノンコート 10 cm 皿に 5 mL を追加します。</li>
	<li>最初 70% エタノール, し、DPBS で尾を洗います。皿尾がフラットに配置し、場所でそれを保持する鉗子を使用します。尾翼をベースからその縦軸に沿って先端に切開を行います。</li>
	<li>1 組の鉗子で尾をつかみ、それを垂直に保持します。鉗子の 2 番目のペアを使用して、尾の基部に切開の横に皮膚をつかんで戻って皮をむきます。尾の先端に向かって下向きに引っ張って、むけて皮膚まで切開の両方の側でこれを行います。</li>
	<li>トリプシン溶液を含む料理をピンセットで皮をむいた尾をホールドし、約 1 cm の長さの作品に尻尾をカットします。トリプシン溶液で尻尾部分と小さな断片に作品を断片化するのにはさみを使用します。10 分の 37 ° C でトリプシン溶液でテールピースを孵化させなさい。 注: より小さい作品は、各部分の容積の比率に高い表面積を提供するために適しています。</li>
	<li>線維芽細胞の拡張 (FEX) 媒体の 2 つの容積を使用してトリプシンを消す (高グルコース ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 15 %fbs、2 mM L グルタミン、非本質的なアミノ酸 (NEAA)、100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン)。</li>
	<li>50 mL チューブに 4 ° C で 5 分間 350 × gで遠心する料理の内容全体を収集します。上清を吸引し、新鮮な FEX 中の 10 mL で尾フラグメントを再懸濁します。</li>
	<li>ゼラチン コーティングの皿に中尾フラグメントを転送し、37 ° c 5% CO2と 4% O2、追加する新鮮な FEX 媒体ごとに 2 日間で孵化させなさい。 注: 5 ~ 7 日後お皿の下部に添付している尾断片と線維芽細胞はそれらから遠ざかっていると見なすことができます。</li>
	<li>線維芽細胞のクラスターが取り囲み、尻尾の部分を取り除くし、媒体とプレートに接続されている線維芽細胞を残してすべての骨片を吸引する皿を軽く振る。FEX の新しい媒体を追加し、合流まで、線維芽細胞を培養します。</li>
	<li>造血前駆細胞、線維芽細胞の汚染がないことを確認、5 分の 1 x トリプシン-EDTA を用いた平板から細胞を分離し、細胞を収集します。造血のマーカーを発現する細胞の枯渇 (CD117、CD5、CD45R (B220) CD11b、アンチ-グラム-1 (Ly-6 G/C)、7-4、テル 119 番) 磁気分離システム10を使用します。</li>
</ol>2. レトロ ウイルス生産
<ol><li>レトロ包装約 2.5 × 104セル/cm2 (2.0 × 106セル 10 cm の皿のために) (で真空ガス プラズマ) 組織培養処理料理と 10% と高グルコース DMEM で一晩培養細胞を播く FBS、10 mM ナトリウムピルビン酸、および 100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン 37 ° C および 5% の CO2。</li>
	<li>次の朝、半分のボリュームが一晩培養に使用 (10 cm 皿 5 mL) を使用して添加物なしで媒体を DMEM に変更します。午後で、セルが 70-80% の合流と、トランスフェクションを開始を確認します。</li>
	<li>それぞれのリプログラミング因子Gata1、 Tal1、 Lmo2、 C-myc、発現ベクター (pMX) とヘルパー ベクトル (ギャグと pol 遺伝子を含む) の 2:1 の混合物を準備します。線維芽細胞の 10 cm 皿、発現ベクターの 6 μ g、DMEM 培地に 100 μ L の最終巻でヘルパー ベクトルの 3 μ g を使用します。</li>
	<li>リプログラミングする要因、生殖不能のポリスチレン管で部屋の温度 (RT) DMEM の 300 μ L を準備し、慎重に商業トランスフェクション試薬の 27 μ L を追加します。 注: トランスフェクション試薬使用前に RT にもたらされる必要があり、化合物の帯電はチューブのプラスチック製の壁に固執するそれを作ることができる、媒体に直接追加する必要があります。</li>
	<li>トランスフェクション試薬を含むチューブ、簡潔に渦にプラスミド ミックスを追加、インキュベートした簡潔に渦混合物で 15 分のトランスフェクション試薬・ DNA の混合物と滴下レトロ包装のセルにそれを追加して、トランスフェクション試薬・ DNA ミックス文化に均等に広がっているし、37 ° C で一晩インキュベートします。</li>
	<li>トランスフェクション後、24 h 20 %dmem 培地に変更 FBS と 100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン。トランスフェクション後、48 h は上澄みを収集し、0.22 μ m 孔サイズのシリンジ フィルターを介してフィルターします。 注: ウイルス上清できます-80 ° c の凍結し、伝達がより効率的な新鮮なウイルス上清を使用する場合、必要になるまでを続けた。</li>
</ol>3. GTLM 伝達と iEP の収穫
<ol><li>種子尾先端 1 × 104セル/cm2で線維芽細胞 0.1% ゼラチン プレコート FEX 中皿し、24 h の 37 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>次の日は、次のとおり伝達の混合物を準備します。<ol>
<li>FEX 中 (60%) の 6 巻にレトロ ウイルス感染試薬 (40%) の 4 μ G/ml を添加したそれぞれのリプログラミング因子のウイルス上清の 1 ボリュームを追加します。</li>
		<li>線維芽細胞の 10 cm 皿、各ウイルス上清 1 mL を追加 (4 × ウイルス = 4 mL) 10 mL 伝達混合物の合計を与える 4 μ g/mL レトロ ウイルス感染症、FEX 中 6 mL に試薬を添加しました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>線維芽細胞培養から FEX 中を吸引し、伝達の混合物と置き換えます。低酸素の条件 (5% CO2および 4% O2) 37 ° C で 4 時間伝達を孵化させなさい。</li>
	<li>伝達の混合物を吸引し、新鮮なリプログラミング媒体に置き換える (拡張の無血清培地 (論文)、100 U/mLPenicillin/ストレプトマイシン、100 ng/mL マウス幹細胞因子 (mSCF)、10 ng/mL マウス インターロイキン-3 (IL3)、2 U/mL 人間組換えエリスロポエチン (hrEPO)、および 100 nM デキサメタゾン)。</li>
	<li>8 過ごしましたリプログラミング培 2 日ごとの追加、低酸素条件で 37 ° C の孵化させなさい。5 から 8 日後成功の書き換えプレートから切断したセルのクラスターが得られます。</li>
	<li>解析プログラムし直された細胞を収集するには、お皿から直接それらを収穫するための上下ピペット優しく。比較のため untransduced 線維芽細胞を収穫、1 x トリプシン-EDTA を用いた平板から細胞を分離し、収集します。</li>
</ol>

<ol><li>Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+We+Really+Vastly+Outnumbered%3F+Revisiting+the+Ratio+of+Bacterial+to+Host+Cells+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans.</a> Cell. 164 (3), 337-340 (2016).</li>
<li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing%2C+tripotent+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).</li>
<li>Szabo, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21057492">Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors.</a> Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).</li>
<li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).</li>
<li>Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).</li>
<li>Yu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+fibroblasts+into+bipotential+hepatic+stem+cells+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).</li>
<li>Hendry, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+transcriptional+reprogramming+of+adult+cells+to+embryonic+nephron+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).</li>
<li>Vierbuchen, T., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+conversions%3A+unnatural+but+useful%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Direct lineage conversions: unnatural but useful.</a> Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).</li>
<li>Capellera-Garcia, S., Flygare, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+reprogramming%3A+a+useful+addition+to+the+blood+cell+research+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox.</a> Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).</li>
<li>Capellera-Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+Minimal+Factors+Required+for+Erythropoiesis+through+Direct+Lineage+Conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion.</a> Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).</li>
<li>Mahmoudi, S., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+reprogramming%3A+a+two-way+street%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Aging and reprogramming: a two-way street.</a> Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).</li>
<li>Singbrant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin+couples+erythropoiesis%2C+B-lymphopoiesis%2C+and+bone+homeostasis+within+the+bone+marrow+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment.</a> Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).</li>
<li>Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+visualization+and+conditional+mutations+in+the+erythroid+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage.</a> Blood. 104 (3), 659-666 (2004).</li>
<li>Gautier, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-expression+profiles+and+transcriptional+regulatory+pathways+that+underlie+the+identity+and+diversity+of+mouse+tissue+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages.</a> Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).</li>
<li>Psaila, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+profiling+of+human+megakaryocyte-erythroid+progenitors+identifies+distinct+megakaryocyte+and+erythroid+differentiation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways.</a> Genome Biology. 17 (1), 83(2016).</li>
<li>Pulecio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Conversion+of+Fibroblasts+to+Megakaryocyte+Progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors.</a> Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).</li>
<li>Kurita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+immortalized+human+erythroid+progenitor+cell+lines+able+to+produce+enucleated+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells.</a> PLoS One. 8 (3), 59890(2013).</li>
</ol>

著者はレポートに利害の対立があります。

4 因子カクテルの過剰発現、 GATA1、 TAL1、 LMO2、 C-MYC (GTLM)、組合10に直接マウスおよびひと線維芽細胞をプログラムし直すための十分なです。プログラムし直された赤芽球系細胞には、 bona fide赤血球前駆細胞の形態、表現型、遺伝子発現及びコロニー形成能の面で大きく類似していた。この発見は、造血に発達的要因を定義するためのツールとして直接リプログラミングによる根拠を裏付けます。この手法の有効性をサポートするため投資事業組合も GTLM 誘導マウス胚性線維芽細胞とひと包皮線維芽細胞、種10の異なる起源の線維芽細胞に対応することを示すを使用して生成されることができます。本報告では、赤芽球系細胞への変換を可視化するツールとして赤血球系統トレース マウス線維芽細胞のリプログラミングを誘発します...

赤い血球 (赤血球) はすべての脊椎動物に欠かせない、人間の体の1のすべてのセルの 84% を占めています。胚は大人の生活に、私たちの健康は RBC の恒常性の厳密な規則に依存です。大人になって開発全体を通して成熟した赤血球の継続的な生産は、赤血球と呼ばれます。赤血球の研究の主要な課題は、RBC 開発とプリミティブと決定的な赤血球間のスイッチの組み合わせによって、マスターのレギュレータを定義することです。直接系統の赤芽球系前駆細胞のリプログラミング赤芽球開発の生体をさらに理解する機会を示します。
直接系統のリプログラミング、分化転換としても知られている (DLR) は、リプログラミング多能性細胞と多能性前駆段階をバイパスして、別に直接 1 つの細胞型のプロセスです。DLR はこれまで神経2、造血3,4、5、肝6ネフローゼ7、前駆細胞など様々 な細胞タイプを生成する使用されています。発達生物学者の DLR の分化系列決定と分化プロセス8,9尋問側面の重要なツールとなっています。DLR を補完して生体内で研究開発中の要因を決定する細胞の運命のメカニズムの理解を部分的に交換できます。このペーパーで説明した赤芽球前駆細胞をリプログラミングの DLR プロトコルは、赤血球の発達的研究の無料メソッド フィールドを提供します。
我々 は以前 4 因子カクテルの過剰発現、 GATA1、 TAL1、 LMO2、 C-MYC (GTLM)、誘導の赤芽球系前駆細胞に直接マウスおよびひと線維芽細胞をプログラムし直すため十分であることを示しています。(投資事業組合)10.、GTLM 書き換え赤芽球系細胞大きく似ているbona fide原始赤血球前駆細胞の形態、表現型、遺伝子の表現のための10の面で。こうして組合は増殖能力を限定し、有核赤血球無核赤血球造血の発症前に初期胚における一過性作り出されるそれらのように成熟しました。リプログラミングの条件 (例えば、点突然変異の要因やその他の要因の追加をプログラムし直す) に変更して、どのようにこれは赤芽球発生と分化の変化につながる理解できます。たとえば示しました GTLM カクテルKlf1またはMybの添加が主に胚 (プリミティブ) からグロビン表現パターンを変更主に大人に (明確な)。この発見は、赤血球産生の発達的要因を定義するためのツールとして DLR を使用の妥当性を裏付けます。
ここでは、我々 は、マウス尾先端繊維芽細胞 (TTF) から組合を生成するプロセスを概説します。赤血球系統トレース マウス線維芽細胞のリプログラミングを行った代表的な実績 (EporCre R26- eYFP) すべてのRosa26軌跡から黄色い蛍光蛋白質 (eYFP) を表現するセル赤血球系統へのコミットメントを簡単に表示できるように、エリスロポエチンの受容体を表明しています。このメソッドを使用して、YFP 正 (EpoR +) 細胞が存在、早ければ 5 日伝達後です。このプロトコルは、したがって、赤芽球系前駆細胞の in vitroの世代の迅速かつ信頼性の高い技術を提供しています。

<table><tbody><tr><td>ピルビン酸ナトリウムを含まないDMEM</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td>PhGP細胞の培養培地</td></tr> ピル<tr><td>ビン酸ナトリウムを含むDMEM</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30243.01</td><td>尾端線維芽細胞の培養培地</td></tr><tr><td>StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>9650</td><td>リプログラミング培地&nbsp;</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 HyClone</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30071.03HI</td><td>成長因子</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン HyClone (100x)</td><td>Ge Life Sciences</td><td>SV30010</td><td>抗ボイオティック</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸 (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140050</td><td>SNL 培地には、この</td></tr><tr><td>トリプシン HyClone (1x)</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30042.01</td><td>細胞解離剤</td>が供給されています。</tr><tr><td>マウス幹細胞因子(mSCF)</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td>リプログラミング培地に追加</td></tr><tr><td>組換えマウスIl-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td>リプログラミング培地に追加</td></tr><tr><td>ヒト組換えエリスロポエチン(hrEPO)</td><td>Peprotech</td><td>100-64</td><td>リプログラミング培地に追加</td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>Σ</td><td>50-02-2&nbsp;&nbsp;</td><td>リプログラミングメディアに追加されました</td></tr><tr><td>豚皮ゼラチン</td><td>Sigma</td><td>9000-70-8&nbsp;</td><td>dH2Oで分解され、コーティングプレートに使用されます。無菌性を確認してからご使用ください。</td></tr><tr><td>ブラストシジンS塩酸塩</td><td>シグマ</td><td>3/9/3513</td><td>選択抗生物質。原核細胞と真核細胞の両方に影響を与える</td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)</td><td>Ge Life Sciences</td><td>SH30850.03</td><td>洗浄ステップに使用</td></tr><tr><td>ポリブレン</td><td>メルク</td><td>TR-1003-G</td><td>感染/トランスフェクション&nbsp;試薬</td></tr><tr><td>FuGENE HD トランスフェクション試薬</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>PhGP細胞株用トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>Millex-GP シリンジフィルターユニット 0.22 &micro;m</td><td>メルク</td><td>SLGP033RS</td><td>ウイルス上清のろ過に使用</td></tr><tr><td>BDエメラルド皮下注射</td>器 <td>ベクトン・ディッキンソン</td><td>SKU: 307736</td><td>ウイルス上清のろ過に使用</td></tr><tr><td>100 mm 培養ディッシュ</td><td>コーニング</td><td>430167</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>6 ウェル プレート</td><td>ファルコン</td><td>10799541</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>ジュエラー鉗子 #5</td><td>Sklar</td><td>66-7642</td><td>に使用小さな尾の破片を扱う</td></tr><tr><td>Sklarlite Iris はさみ</td><td>Sklar</td><td>23-1149</td><td>尾を小さな断片に切断するために使用されます</td></tr><tr><td>系統細胞枯渇キット、マウス</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td><td>線維芽細胞培養における造血細胞の枯渇用</td></tr><tr><td>CD117 MicroBeads、マウス</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-224</td><td>線維芽細胞培養</td></tr><tr><td>における造血細胞の枯渇用PheonixGP細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3215</td><td>レトロウイルスパッケージング細胞株</td></tr><tr><td>EcoPACベクター(pCL-Eco)&nbsp;</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-29540</td><td>ギャグおよびpol遺伝子を含むレトロウイルスヘルパーベクター</td></tr><tr><td>pMX-Gata1</td><td>クローニングされたラボ</td><td></td><td></td>内</tr><tr><td>pMX-Tal1</td><td>クローニングされたラボ</td><td></td><td></td>内</tr><tr><td>pMX-Lmo2</td><td>クローニングされたラボ</td><td></td><td></td>内</tr><tr><td>pMX-cMyc</td><td>クローニングされたラボ</td><td></td><td></td>内</tr><tr><td>CellSens Standard 1.6 ソフトウェア&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Cytospin解析ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

リネージュの赤芽球系前駆細胞に成体マウス線維芽細胞のリプログラミングを直接します。

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

赤芽球系細胞と分化細胞の運命を決定する、要因の成熟のグループによって仕組まれた血統制限の転写ネットワークの活性化を続行します。以前誘導赤芽球前駆細胞/前駆体 (投資事業組合) に線維芽細胞のプログラムし直す直接系統を使用した赤血球の開発を指示するために必要な要因の最小限のセットを定義に着手しました。Gata1、過剰発現を示したTal1、 Lmo2、およびC-myc (GTLM) が急速に変換マウスおよびひと線維芽細胞直接投資事業組合形態の観点から善意の赤芽球系細胞のように表現型、遺伝子発現。組合が赤血球や細胞の運命制御を研究する非常に貴重なツールを提供する予定です。ここで我々 は投資事業組合経由で転写因子駆動直接系統 (DLR) のリプログラミングにマウス尾先端線維芽細胞を変換する段階的なプロセスをについて説明します。この例では赤芽球系細胞の可視化を有効にする、エリスロポエチン受容体遺伝子 (EpoR) プロモーターの制御下の黄色い蛍光蛋白質 (YFP) を表す赤血球系統トレース マウス線維芽細胞のリプログラミングを行う運命誘導リプログラミングに。このプロトコルでは、次は、この線維芽細胞を 5 ~ 8 日以内投資事業組合に書き換えることができます。
改善はプロセスにまだ行うことができます、ことを示すリプログラミング GTLM を介した迅速かつ直接プロセスbona fideのプロパティを持つセルの赤芽球系前駆細胞および前駆細胞を降伏します。

大人の線維芽細胞の転写因子ドリブン DLR を使用してから組合の生産のための再現可能なプロトコルをご紹介します。フローサイトメトリー、コロニー形成の試金、および遺伝子を使用して細胞のリプログラミングを評価する発現解析。赤芽球系細胞の運命への転換の可視化を支援するために赤芽球系の系譜トレース マウス線維芽細胞のリプログラミングを行った (EporCre R26- eYFP) (eYFP) 黄色い蛍光蛋白質を表現します。エリスロポエチン受容体 (Epor、内因性Epor座の 1 つの対立遺伝子をノックアウトした Cre) を表すすべての細胞におけるRosa26座からトラン スクリプトの開発12,13 (の任意の段階で図 1A)。赤芽球系前駆細胞を誘導の成功の書き換え、YFP 陽性...

ここで紹介は私達のプロトコルによる生産の赤芽球系前駆細胞 (投資事業組合) 転写因子駆動を用いたマウス アダルト繊維芽細胞からダイレクトリプログラミング系統 (DLR)。

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

線維芽細胞からエリスロイド前駆細胞への直接系統リプログラミング。これは、エリスロイド細胞の運命を決定する転写調節のプロセスをよりよく研究するために、私たちの研究室で開発した新しい方法です。直接系統リプログラミングを使用して開発を研究する主な利点は、非常に簡単なテクニックであるということです。したがって、例えばノックアウトマウス内の機能研究の喪失と比較して、ここでは非常に簡単に因子を操作し、特定の時点でそれを過剰発現させ、クロマチン修飾や遺伝子発現変化などの下流の効果を研究するのに十分な材料を簡単に得ることができます。この方法は、エリスロイド前駆細胞へのマウスの尾先端線維芽細胞の再プログラミングに焦点を当てるが、それはまた、他の線維芽細胞タイプ、およびヒトを含む他の生物に適用することができる。この技術の意味は、輸血医学に向かって広がって、それはインビトロで赤血球の生産に向けて道を開く.この手順を実証することは、私の研究グループのアルバン・ヨハンソンです。0.1%ゼラチンで皿の表面を覆うことから始めます。摂氏37度で約20分間インキュベートします。ゼラチン溶液を吸引し、皿を乾燥させます。安楽死させたマウスの尻尾の付け根で切り取って取り除きます。2%FBS の DPBS に尾を置いて、すぐに使用できます。無菌状態の組織培養フードで、DPBSで0.02%トリプシンEDTAの希釈トリプシン溶液を調製し、コーティングされていない10センチメートル皿に5ミリリットルを加えます。組織培養フードでは、15ミリリットルのチューブで十分な70%エタノールで尾を洗浄し、DPBSで覆います。皿に尻尾を平らに置き、鉗子を使って所定の位置に保持します。メスを使用して、ベースから先端までの縦軸に沿って尾を切開します。一対の鉗子を使用して尾をつかんで垂直に保持し、2番目のペアを使用して尾部の根元の切開の横の皮膚をつかみ、それを剥がします。皮膚が尾の先端に向かって下方に引っ張ることによって剥がれるまで、切開の両側でこれを行います。トリプシン溶液を含む皿の上に鉗子で皮をむいた尾を保持します。解剖はさみを使用して尾を小さく切ります。はさみを使用してトリプシン溶液中のこれらの部分をさらに小さく断片化し、摂氏37度で10分間インキュベートします。トリプシンをクエンチするには、サプリメントと抗生物質とFEX培地、DMEMの2つのボリュームを追加します。50ミリリットルのチューブに皿の内容物全体を収集します。チューブを摂氏4度で5分間350倍Gで遠心分離する。上清を吸引し、新鮮なFEX培地の10ミリリットルに尾片を含むペレットを再懸濁する。この懸濁液をゼラチンコーティングされた皿に移します。5%の二酸化炭素と4%の酸素で摂氏37度でインキュベートし、2日ごとに新鮮なFEX培地を加えます。5~7日後、尾片が皿の底に付着し、線維芽細胞がそれらから離れて移動している培養を観察します。線維芽細胞のクラスターが見えたら、皿を軽く振って尾片を取り除きます。すべての骨片で培地を吸引し、線維芽細胞をプレートに取り付けたままにする。新鮮なFEX培地の10ミリリットルを加え、繊維芽細胞をコンフルエントになるまで培養する。線維芽細胞培養における造血前駆物質による汚染がないことを確実にするために、原稿に記載されているようにトリプシンEDTAを用いてプレートから細胞を解離する。培地を加え、細胞を収集し、抗体を用いて磁気ビーズを添加します。造血マーカーを発現する細胞を除去するために磁気分離システムを使用してください。このステップを含めると、培養に存在する可能性のある HSPCs が排除され、FACS 分析の日に誤検出が発生する可能性がなくなります。レトロウイルス包装細胞を約25,000細胞/平方センチメートルで組織培養処理皿にシードします。摂氏37度と5%の二酸化炭素で高グルコースDMEMで細胞を一晩インキュベートします。翌朝、培地を取り出し、添加物を含めずに一晩培養するために使用する体積の半分を加えます。午後には、トランスフェクションに必要な70〜80%の合流性について細胞を確認してください。トランスフェクションを開始するには、発現ベクター PMX の 6 マイクログラムと、各リプログラミングファクターに対して Gag、Pol、およびエンベロープ遺伝子を含むヘルパーベクターの 3 マイクログラムの 2 ~ 1 の混合物を準備します。次に、各リプログラミング因子について、滅菌ポリスチレンチューブに300マイクロリットルの室温DMEMを加えます。その後、慎重にチューブ壁との接触を避けるために、培地に直接室温の商業トランスフェクション試薬の27マイクロリットルを追加します。プラスミドミックスをチューブを含むトランスフェクション試薬に加えます。渦を短時間、室温で15分間インキュベートする。トランスフェクション試薬DNA混合物を再びボルテックスする。レトロウイルス包装細胞に滴下して、培養物に均等に広がり、摂氏37度でインキュベートします。トランスフェクションの24時間後、培地を取り出し、20%FBSと1ミリリットルペニシリンストレプトマイシンあたり100単位でDMEMを追加します。トランスフェクションの48時間後、上清を収集し、0.22マイクロメーターの細孔サイズのシリンジフィルターを通してそれをフィルタリングします。FEX培地で0.1%ゼラチンプレコーティングされた皿に1平方センチメートルあたり10,000細胞で尾先端線維芽細胞を播種することによって、トランスダクションを開始します。摂氏37度で24時間インキュベートします。このステップを実施する際には、4つのレトロウイルス上清を等しい比率で添加し、4つの遺伝子すべてがリプログラミングプロセスに等しく寄与することを保証することが重要です。翌日、最初にレトロウイルス感染試薬のミリリットル当たり4マイクログラムを6回のFEX培地に添加した各リプログラミング因子に対して1回のウイルス上清を1回加えて、トランスダクション混合物を調製する。その後、FEX培地を線維芽細胞培養物から吸引し、その導入混合物を添加する。5%の二酸化炭素と4%の酸素で低酸素条件で摂氏37度で4時間のトランスダクション反応をインキュベートします。4時間後、トランスダクション混合物を吸引し、新鮮なリプログラミング培地を加える。低酸素状態で摂氏37度で8日間インキュベートし、2日ごとに新鮮なリプログラミング培地を追加します。プレートから切り離された細胞の導出されたクラスターで、成功したリプログラミングを観察します。さらなる分析のために皿から再プログラムされた細胞を収穫するには、それらを上下に穏やかにピペットし、細胞を収集します。iEPsのリプログラミングに成功した後、YFP陽性細胞は、伝達後5日で観察可能です。それらは丸くなり、プレートの表面から持ち上がり、クラスターを形成し始め、赤血球前駆体のような形態を示す。いくつかの細胞のヘモグロビン化は、陽性ベンジジン染色によって明らかである。小さい分率はエリスロイド特異的表面マーカーTER-119を表す。8日目までに、大きなYFP陽性クラスターが見られます。8日目のiEPsは、5日目のiEPsよりも分化したエリスロイド表現型を有する。それらは有意に小さく、より多くのヘモグロビンを蓄積しており、TER-119の発現の増加を示す。8日目に収集されたiEPsのqPCRによる遺伝子発現解析は、線維芽細胞遺伝子の発現をほぼ遮断し、多くのエリスロイド遺伝子をアップレギュレートしていることを示している。再プログラムされた細胞にBFU-eコロニー形成アッセイを行った後、8日目のiEPsは、明らかに赤色で目に見えない2種類のコロニーを形成する。赤いコロニーからの細胞は赤血球形態を示したが、非赤コロニーからの細胞は示さなかった。約1,000日目の5つのiEPsの約1つは赤いコロニーを形成し、8日目のiEPsから形成されたコロニーは約10,000コロニーに1つだけでした。尾先端線維芽細胞またはTTFの再プログラミング効率は、通過数の影響を受ける。9回通過したTTFは、3回通過した細胞と比較して、iEPsのクラスターを産生する能力が劇的に低下したことを示した。さらに、異なる培養条件は、リプログラミングの効率に影響を与える可能性があります。ノルモキシアで培養されたトランスデューセTTFは再プログラムが非常に遅く、IEPクラスターは5〜8日ではなく10日後に観察される。この手順に従って、コロニー形成アッセイ、qPCRおよびFACS分析などの方法を適用して、細胞分化状態を決定することができる。この技術は、その発展以来、マウスとヒトの原始細胞と決定的なエリスロイド細胞の切り替えを理解する上で、エリスロポエシスの分野の研究者に道を開いています。

direct-lineage-reprogramming-adult-mouse-fibroblast-to-erythroid

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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リネージュの赤芽球系前駆細胞に成体マウス線維芽細胞のリプログラミングを直接します。

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