Name: 文字列アセンブリ gRNA のカスタマイズ可能なプロトコル (STAgR) のクローニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 学ぶ STAgR法によるCRISPR/Cas9用多重gRNAベクターの効率的な作製。ギブソンアッセンブリを用いて、カスタマイズ可能で低コストな遺伝子工学手法を習得し、研究の幅を広げます。

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作者は彼らの入力について教授ステファン ・ ベックと教授 Jovica Ninkovic に感謝、ヘルプし、サポートの STAgR 手法の開発にたいと思います。トビアス Klötzer、アンナ Köferle、有用なコメントのバレンティン ・ バウマン。仕事は、DFG (STR 1385/1-1) でサポートされています。

1. STAgR 戦略をクローニングの設計
<ol><li>どのように多くの gRNA のカセットが別途 1 発現ベクターとその順序を決定します。プロモーターと gRNA を決定する、gRNAs のそれぞれに使用する足場。オンライン ツール (例えばwww.benchling.com) を使用して、gRNAs をデザインします。</li>
</ol>2. STAgR のオーバー ハングが付いているプライマーをクローニングの設計
注: 最初の gRNA のアンチセンスと最後の gRNA の意味 protospacer シーケンスそれぞれに追加されますベクター バックボーン (図 1) の増幅用プライマー。センスとアンチセンス gRNAs を目的の順序に取り付ける、文字列から残りのシーケンスが増幅されます。最初の文字列部分はオーバー ハングとして N20 シーケンスの最初の gRNA を含む前方プライマーとオーバー ハングと N20 シーケンス (逆の補数) の 2 番目の gRNA と逆プライマー増幅されます。それに応じて、すべての次の部分が生成されます。
<ol><li>(表 1) をオーバー ハングと同様の STAgR DNA 文字列の前方増幅プライマーに N20 gRNA シーケンスを追加します。(従来の足場) の前方プライマー"scf FP"または"サム FP"(MS2 含む足場) のために感覚の gRNA シーケンス 5' を追加します。FP プライマーをアニール足場/MS2 部にそれぞれの STAgR 文字列 (図 1)。</li>
	<li>逆の補数 N20 gRNA シーケンスを逆プライマー シーケンスに追加します。特定のプロモーターと使用される文字列 (hU6 RP、mU6 RP、H1 RP 7sK RP) に応じて RP プライマーを選択します。</li>
</ol>3. STAgR の断片をクローニングの世代
<ol><li>ギブソン アセンブリの個々 のクローンのフラグメントを生成する高忠実度 (HF) バッファー、10 mM の dNTPs の 1 μ L、オーバー ハング-プライマー (100 μ M)、10 の 0.25 μ L の 10 μ L を設定して Pcr を行う DNA テンプレート (文字列またはベクトル)、0.5 μ L HF のポリメラーゼの ng、ジメチルスルホキシド (DMSO) 1.5 μ H2O に 50 μ L の最終巻を追加。 注: SAM 足場を選択した場合、バックボーン PCR の最後の gRNA に gRNA の足場を組み込むプラスミド"STAgR_Neo"をテンプレートとして使用、「STAgR_SAM」を使用。6 gRNA カセット STAgR プラスミッドのためたとえば、6 Pcr、dna 5 文字列テンプレートおよびテンプレートとしてベクター バックボーンを持つものとして、必要に応じて。</li>
	<li>次の条件を使用してたちの反応を孵化させなさい: 1 分 30 秒; 98 ° C の 1 サイクル38 サイクル 98 ° C の 10 s、59 ° C (gRNA 足場)/68 ° C (サムのループ) の 10 s、30 のための 72 ° C (挿入) の s/1 分 30 s (ベクトル); 用10 分の 72 ° C の 1 サイクル。</li>
	<li>PCR の反作用から 5.5 μ L を削除、読み込み染料を追加し、1% アガロースゲル上増幅断片を分析します。負荷 (100 bp DNA ラダー/1 kb DNA ラダー) のサイズと適切なゲルの実行中におけるゲルの実行の適切な DNA ラダー 120 V で 30 分間のバッファー (例えば、TLE バッファー)。</li>
	<li>ゲルを実行すると、バッファーの制限の酵素と 0.5 μ L の 5 μ L を追加DpnI (10 単位) 残り 44.5 μ L の PCR 反応し 1 時間に 37 ° C で 30 分間インキュベート</li>
	<li>磁気ビーズを用いた DNA の浄化を実行します。<ol>
<li>PCR の製品の 1 μ L あたり 1.8 μ L 磁気ビーズを追加し、上下ピペッティングで混ぜます。部屋の温度 (RT) で 2 分間インキュベートします。</li>
		<li>磁石の残留液体からビーズと DNA のフラグメントを分離します。完全に再することがなく、ペレットを洗浄によってビード 70% エタノールで 2 回洗浄しなさい。</li>
		<li>ピペットとすべてエタノールを外し、ペレット空気が乾燥してみましょう。</li>
		<li>ピペッティングを上下で 15-20 μ L H2O のペレットを溶かし、磁石を使用して液体からビーズを分離します。クリアの上清を新しいチューブに転送します。 注: また、列に基づく反応クリーン アップ キットも使用できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>29を他の場所で説明されているように分光光度計を使用して DNA の濃度を決定します。</li>
</ol>4. ギブソン アセンブリ反応や細菌変換
メモ: 次の手順は、ギブソンらから適応30。
<ol><li>反応ミックスまたは商業ギブソン クローニング キットを使用して自家製のギブソンを準備します。<ol>
<li>1 M トリス (トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタン) の 3 mL を組み合わせる-pH 7.5、1 M MgCl 100 mM dGTP (デオキシグアノシン三リン酸) 60 μ L、100 mM dATP (デオキシアデノシン三リン酸) 60 μ L、100 mM dTTP (チミジン三リン酸) 60 μ、100 mM dCTP (60 μ L 300 μ L で HClデオキシシチジン三リン酸塩)、1 M DTT (ジチオトレイトール)、ペグ-8000 (ポリエチレング リコール)、100 mM NAD の 300 μ L (ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド) の 1.5 g の 300 μ L H2O 6 mL の 5 × の等温の反作用バッファーを取得するを追加します。 注: 検体のバッファーは-20 ° C で少なくとも 12 ヶ月間保存できます。</li>
		<li>ギブソン アセンブリ マスター ミックス、5 x の等温の反作用バッファーの 320 μ L を組み合わせて 697 μ H2O および 10 U/μ L T5 exonuclease の 3 μ L、2 U/μ L の DNA ポリメラーゼの 20 μ L、40 U/μ L Taq DNA リガーゼの 160 μ L を追加します。 注: このミックスは、少なくとも 12 ヶ月間、避けようと-20 ° C で保存されますを使用できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>挿入およびベクトルの 2.5 μ L でアセンブリのマスターの組合せの 7.5 μ L を使用します。2 x STAgR 反応全 DNA の 1:1 がない以上 0.2 pmol の比率を挿入するのにモル ベクトルを使用します。以上 2 gRNA 式カセット、ベクトルを使用して、1:3 の比率を挿入するが、0.5 pmol の総 DNA の量を超えていません。 注: すべての増幅 gRNA 式カセットは、等モル量で使用ください。ベクトルが未消化のテンプレート ベクトル (または自己 ligation) 用のコントロールに挿入しますと同一の額でプラスミド コントロールを含めます。</li>
	<li>氷の上に 60 45 分ストア サンプルの 50 ° c または-20 ° c 後続の変換のためのサンプルをインキュベートします。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
	<li>直接化学的に有能な細菌にミックスの半分を変換します。<ol>
<li>雪解けの氷の上の化学的に有能な TOP10エシェリヒア属大腸菌細菌。</li>
		<li>有能な細菌の 50 μ L にギブソン ミックスの 5 μ L を追加します。管の底をフリックで優しく混ぜます。氷上で 30 分間インキュベートします。</li>
		<li>42 ° C の水浴または 45 のヒート ブロックにチューブを配置することでヒート ショックを実行 s。</li>
		<li>氷に戻ってチューブを置きます。細菌に 250 μ L の SOC 培地を追加し、30-45 分の揺れのインキュベーターで 37 ° C で回復できるようにします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>回復後、プレートのアンピシリンを含む 1.5% ホストゲノム スープ (LB) 寒天プレートの上に変換された細菌 (100 μ g/mL) し、37 ° C で一晩インキュベート</li>
</ol>5. 細菌のコロニー PCR による STAgR クローンを選択します。
<ol><li>同じラベルを各構成要素の 200 μ L PCR の反作用の管 (3 と 24) の間の少なくとも 2 つのセットを準備します。</li>
	<li>100 μ g を含む 100 μ L LB 培地で 1 つのセットを埋める/mL アンピシリン。</li>
	<li>細菌コロニーの生物材料オフにスクラッチする滅菌ピペット チップを使用して、空の 100 μ L の PCR 反応管の下部に 。すぐに先端を LB 培地を含む 2 つ目の対応する反応管に転送します。</li>
	<li>細菌のいくつかは, 後で使用のための 37 ° C で、LB メディアへ転送を確保するため周辺チップを軽く旋回します。</li>
	<li>PCR マスター ミックス (反応あたり 10 μ L) を設定します。<ol>
<li>10 反応のプライマー (100 μ M)、 Taqのポリメラーゼの 0.5 μ L の 0.5 μ L、2 μ L 10 mM dNTPs 10 μ L Taqバッファーを結合し、H2O を 100 μ L のボリュームに追加します。</li>
		<li>次のプライマーを使用して、: StAgR_seq_fwd2: ACTGGATCCGGTACCAAGG、StAgR_seq_rev: TTACGGTTCCTGGCCTTTTG。</li>
	</ol>
</li>
	<li>LB メディアなしラベル PCR の反作用の管に 10 μ L の PCR マスター ミックスを追加します。</li>
	<li>次の条件を使用してたちの反応を孵化させなさい: 94 ° C の 5 分の 1 サイクル 30 94 ° c 38 サイクル s、55 ° C、30 秒、2 分; 72 ° C10 分の 72 ° C の 1 サイクル。 注: gRNA 式カセット数と伸長時間 (72 ° C ステップ) を増やす必要があります。挿入テーブル 2を使用しての理論的なサイズを計算し、72 ° c. で 1 kb あたり 1 分を使用</li>
	<li>ローディングの染料を追加し、1% の agarose のゲルに増幅されたフラグメントを分析します。サイズ変更のための適切な DNA の梯子を読み込む (1 kb DNA ラダー) 30 分間 120 V でバッファー (例えば、TLE バッファー) を実行するの適切なゲルを実行し、。</li>
	<li>使用されるプロモーター、gRNA 足場と N20 シーケンスの数の個々 のサイズを追加することにより表 2の助けを借りて、私アンプリコンの理論上のサイズを計算します。コロニー PCR の結果から正しいバンドのサイズと正しいベクトルを抱く可能性があるかどうかに基づいて細菌のクローンを識別します。</li>
	<li>以前の設定、対応する 100 μ L 文化 (100 μ g/mL アンピシリン) と 2.5 mL 一晩 LB 文化を接種します。12 h の 37 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>商業プラスミド ミニ キットと31の製造元の指示を使用してプラスミッド DNA を抽出します。</li>
	<li>次のプライマーを使用してプラスミッド シーケンス: サンガーの配列によって StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG)、StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG)。</li>
</ol>

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<li>Xie, K., Minkenberg, B., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boosting+CRISPR%2FCas9+multiplex+editing+capability+with+the+endogenous+tRNA-processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (11), 3570-3575 (2015).</li>
</ol>

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ご紹介詳しいプロトコル STAgR のさまざまなサイズの gRNA 発現プラスミドのシンプルかつ高速の生成を許可します。GRNA 発現ベクター STAgR_Neo、および人間の U6、マウス U6、人間 7sK と人間 H1 プロモーター28 の使用に 2-8 gRNA 式カセット (2 つの MS2 RNA アプタマーの有無にかかわらず) gRNA プラスミドのワンステップ世代のこのプロトコルを使用することができます。、32,33。以上 4 つのカセットが必要な場合は、効率を高めるため、少なくとも 2 つの異なるプロモーター/足場型を使用することをお勧めします。以上 8 gRNA カセットと同様、他のベクトル、プロモーターとプロモーターの組み合わせも可能である可能性があります。ただし、これはテストされていません。我々 の経験でメソッド動作確実かつ再現性をもって、重要な手順を定めて、トラブルシューティングの方法が期待される成果はすぐに発生します。我々 の経験では、いくつか手順がアプローチの成功のために極めて重要な: 第一に、ギブソン アセンブリ ステップ (3:1) で正しくベクター バックボーンへの挿入の比率を使用することが重要です。ただし、我々 は、いくつか gRNA セット ベクトルへの挿入の比率 1:1 は有益な gRNA カセット数は 2 つを超える場合でも気づいた。第二に、ギブソン アセンブリ反応の期間が十分に長くする必要があります (少なくとも 45 分をお勧めします)。
変更数が多いと、STAgR を用いることができます。ターゲット シーケンス、gRNA 番号、足場、プロモーター、ベクター バックボーン カスタマイズでき自由に組み合わせます。ただし、それぞれの組み合わせには、わずかに異なる要件があります。我々 の経験は、中または高の場合で gRNA カセットの番号 (> 4) 希望しますが、得られないベクトルの個々 の gRNA カセットの順序を変更するこの問題を克服するために最速の方法は、通常、すぐに。同様に、異なる gRNA プロモーターと足場を組み合わせた効率 (とに採点しているコロニー pcr 法の必要な数の削減が) 多くの gRNA カセットが複製されます。ギブソン アセンブリ中に連続したシーケンスの自発的な組み合わせによって不適切なクローンが通常生成されることがわかった。これは、手法の有効性を減らしうるが、これはまた機能 gRNA サブセット28ベクトルの同時発生の結果します。
数の異なる方法21,22,23,24,25、1 つ以上の gRNA 式カセットを含む gRNA ベクトルを多重化の生成が報告されています。 26,27。同時またはシーケンシャル gRNA ペア22,34のクローニングを雇って、他のゴールデン ゲート アセンブリおよびいくつかシーケンシャル クローン手順25,35に依存します。特別なアプローチは、1 つの祖先のトラン スクリプト36からいくつかの gRNAs をカットする内因性細胞 tRNA 処理システムを用いて謝ら、によって使用されています。このメソッドの advangetage が 1 つだけのプロモーターの要件欠点は、gRNA の組み合わせごとに新たに合成された DNA のフラグメントの必要性です。各 gRNA の多重化通信方式、長所と短所。STAgR は、効率、低コストで可能な gRNA カセットの数が多いとシンプルさを兼ね備えています。
STAgR (とその他の多重化システム) 可能性が高いに尽力されます複数遺伝子の生体内における効率的な (と同時) の中断を有効にするゼブラフィッシュ脳28の先駆者として。GRNA 多重ベクトルのもう一つの将来のアプリケーションは、誘導または単一の遺伝子の抑圧と対照をなして完全な転写プログラムの操作のための約束です。おそらく、変換の細胞や臓器によりも今日はるかに高い程度に、これらのアプローチになります。

文字列アセンブリ gRNA (STAgR) のクローニングは、複数 gRNA 式カセット 1 つ単一クローンでステップを含む表現のベクトルの効率的な一晩生成を有効にする方法です。STAgR プロトコルの専門家の専門知識や材料に依存しないし、カスタマイズのための複数のオプションを提供しています。
細菌の CRISPR タンパク質 Cas9 は、ユニークな能力を持ちます。検索して選択的に自然に発生する crRNAs または設計された gRNAs1でエンコードされた DNA 配列のみをバインドすることです。分子ツールとしての活用が不可能、不可能のアプローチまたは最近まで携帯機種に限定数が多いを有効に。目標とされた遺伝子の突然変異の2、ゲノム工学3エピゲノム4,5,6転写活性化遺伝子サイレンシング7、8を編集が含まれます。CRISPR は普遍的に展開、そのアプリケーションのレポートとして我々 の知る限り、ターゲット サイト、細胞の種類および種の広い範囲に存在します。しかし、多く CRISPR アプリケーション直接または間接的に依存一連のゲノム操作 (転座9,10、中11大規模なゲノムの変化を含む複数の gRNAs の配信12,13) ゲノム工学 (Cas9 nickases14の使用)、条件遺伝子11,15または16シリアルの突然変異の生成と戦略17をトレースします。また、複数のターゲット サイトにはない他のアプローチ (転写工学18、エピゲノム工学19,20) 厳密には必須、ただし届くこれの下でのみ、最大の効果を多くの場合条件です。
1 つ以上 gRNA 式カセット21,22,23,24,25,26を含む gRNA ベクトルを生成するいくつかの便利なメソッドが記載されています。 27。ここでは、そのシンプルさの組み合わせで優れたと (1 つだけ一晩クローン作成手順が必要) を高速化、低コスト (DNA テンプレートを複数回再利用できる) と、STAgR、クローン作成、文字列アセンブリ gRNA のプロトコルを提案 (カスタマイズプロモーターと異なる gRNA 系) と有効性 (それは gRNA カセットの高番号を含むベクトルの生成を許可)28。
STAgR 原則として使える数 (1-2 gRNAs) の発現ベクターを生成するため、いくつか (3-5 gRNAs) と式カセットの最大の数のいくつかをこれまで報告された (6-8 gRNAs)28。同様に、STAgR は、任意の gRNA シーケンス、バックボーンまたはプロモーターに適用されます。ただし、STAgR は、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) とギブソン アセンブリに主に基づいて、ので代替法を用いた高配列類似性を持つ gRNAs に生成されます。

<table><tbody><tr><td>Phusion High-Fidelity DNAポリメラーゼ</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td>ギブソンマスターミックス用ポリメラーゼ およびすべてのPCR</td></tr><tr><td>用 dNTPs</td><td>ライフテクノロジー</td><td>R0191</td><td>すべてのPCR用dNTP</td></tr><tr><td>dATP</td><td>ライフテクノロジー</td><td>R0141</td><td>ギブソンマスターミックス用</td></tr><tr><td>dNTP dCTP</td><td>ライフサイエンス</td>テクノロジー <td>R0151</td><td>ギブソンマスターミックス用dNTP</td></tr><tr>ライフサイエンステクノロジー<td>dGTP</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ギブソンマスターミックス</td>用<td>R0161</td> dNTP</tr><tr><td>dTTP</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ギ</td><td>ブソンマスターミックス</td></tr><tr><td>用dNTP アガロース</td><td>VWR</td><td>443666A</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP ビーズ</td><td>ベックマンコールター</td><td>A63881</td><td>DNAクリーンアップ</td></tr>用 <tr><td>トリスHCL</td><td>ロス</td><td>9090.2</td>ギ<td>ブソンマスターミックス</td></tr><tr><td>DTT</td>用<td>ギブソンマスターミックス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>VWR</td><td>RC-077</td>用ライフテクノロジーR0861 ギ<td>ブソンマスターミックス</td></tr><tr><td>NAD</td><td>ケイマンケミカルズ</td><td>カンパニー16077</td><td>ギブソンマスターミックス</td></tr><tr><td>T5エキソヌクレアーゼ</td><td>NEB</td><td>M0363S</td><td>ギブソンマスターミックス</td></tr><tr><td>Taq DNAリガーゼ</td><td>NEB</td><td>M0208S</td><td>ギブソンマスターミックス</td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>SigmaAldrich</td><td>PHR1393-1G</td><td></td></tr><tr><td>DNA Ladder 1 kb Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td></td></tr><tr><td>プラスミドミニキット</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>プラスミドおよびプライマー配列</td><td></td><td></td><td>すべての配列はFigshare(https://goo.gl/UGdc3Q)で入手できます。</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>PanReacAppliChem</td><td>6381-92-6</td><td>TLE バッファー</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>SigmaAldrich</td><td>M8266</td><td>ギブソン マスター ミックス</td></tr><tr><td>Top10 化学的に有能な細菌</td><td>Thermo Scientific</td><td>C404003</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. 中</td><td>Thermo Scientific</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>酵母 - 抽出</td><td>物 SigmaAldrich</td><td>Y1625</td><td>溶解性ブロス(LBメディア)</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SigmaAldrich</td><td>S7653</td>(<td>LBメディア)</td></tr><tr>ペ<td>プトン</td><td>SigmaAldrich</td><td>91249</td>(<td>LBメディア)</td></tr><tr><td>ポリソジェニックブロス(LBメディア</td>)寒<td>天</td><td>SigmaAldrich</td><td>5040</td>(LBメディア)</tr><tr><td>Taq DNAポリメラーゼ</td><td>キアゲン</td><td>201203</td><td></td></tr></tbody></table>

文字列アセンブリ grna のカスタマイズ可能なプロトコル (stagr) のクローニング

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

細菌の CRISPR/Cas9 システムは、生命科学の方法論オプション大幅に増えました。遺伝・ ゲノム工学は伴いその利用システムの広い範囲に適用されます。また、多くの転写エピゲノム工学的アプローチは、初めて今一般に可能とします。CRISPR の幅広い適用性の 1 つの理由は、その二部の性質にあります。小さな gRNAs は、複合体のゲノムのターゲット、Cas9、蛋白質の変形およびローカルの分子の結果を決定します。しかし、多くの CRISPR アプローチは、個々 のセルに複数の gRNAs の同時配信に依存します。ここでは、文字列アセンブリ gRNA (STAgR) のクローニングのためのカスタマイズ可能なプロトコルを提案する、単一クローンで発現ベクター多重 gRNA の単純な高速かつ効率的な生成を可能にするメソッドのステップします。STAgR はコスト効果の高い中 gRNA 式カセットの長い DNA テンプレートを複数回再利用できます (そのプロトコルに関して) で個々 のターゲット シーケンスは短いオーバー ハング プライマーによって導入されました。さらに、STAgR は、gRNAs、数が多いだけでなく、異なる gRNA 亜種、ベクトルやプロモーターの組み合わせのシングル ステップ設立できます。

手でプロトコルに従うカスタマイズされた多重 gRNA ベクトル可能 (図 1) の世代になります。六つの異なる gRNA カセットを使用した STAgR 手法の代表的な結果は、図 2で描かれています。図 2A STAgR ピース (プロトコル 3.1 3.3) を取得するために使用する pcr 法の典型的な結果を示しています。6 amplicons (BB、S1 S5) は、その両端に個々 の gRNA N20 シーケンスを含んでいる線形 DNA 部分を表しています。プラスミド バックボーン (BB) gRNA1 と gRNA6 のターゲット シーケンスを拡張したがって 2 つ他 Pcr (S1, S5) ギブソン アセンブリ (図 2表 3) のために必要な重複を所有しています。浄化後、ベクターとインサートの少なくとも 1 μ g の DNA の収穫を実現できます。
ギブソン アセンブリ後 100 に 700 細菌コロニー細菌変換必要があります。図 2Bは、コロニー PCR、次の六つの gRNA カセット STAgR プロトコルを介して 10 の細菌のコロニーの代表的な分析を示しています。ゲルの電気泳動は、3 つのクローンが完全なアセンブリ (表 2) の予想される増幅サイズを表示することを示します。他のクローン (図 2B, 18 号) 1 つのクローンが空に対し 1 ~ 5 gRNA カセットを含む可能性が高い受信 STAgR ベクトルも。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58556/58556fig1.jpg"> 図 1: STAgR プライマーの設計の概要します。最初の gRNA 数と足場が選択し、gRNA 順序とプロモーターされ最後に、ベクトルの種類を使用する必要があります。各 gRNA 意味向きおよび"サム FP"または"scf FP"の共通部分シーケンスをターゲット gRNA で前方プライマー設計されています。同様に、個々 の逆プライマー対応するプロモーターを生成する (RP) は、次の gRNA の N20 シーケンスの逆の補数と融合されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58556/58556fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58556/58556fig2.jpg"> 図 2: 六つの異なる gRNA カセットを使用した STAgR 手法の代表の結果。(A) STAgR_Tomato ベクトルと同様に、5 つの挿入の PCR の代表的な例。(B) hU6 と mU6 プロモーター標準 gRNA とサムの足場を用いた STAgR 反応 x 6 のコロニー PCR。22 細菌のコロニーは、7 示した完全なアセンブリを示す期待のバンド行った。梯子: 1 kb プラス、塩基対 (bp) の番号。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58556/58556fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>・ ベクター ・文字列前方プライマー</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>scaffold_fwd</td>
			<td>GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAM_fwd</td>
			<td>GTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>文字列のベクトル逆プライマー</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>hU6_rev</td>
			<td>CGGTGTTTCGTCCTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>mU6_rev</td>
			<td>CAAACAAGGCTTTTCTCCAAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>hH1_rev</td>
			<td>CTGGGAAAGAGTGGTCTCATACAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>h7SK_rev</td>
			<td>CCGAGGTACCCAAGCGG</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: gRNA 足場とプロモーターのためのプライマー シーケンス。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>プロモーターと足場のサイズ。</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>hU6</td>
			<td>265 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>hH1</td>
			<td>225 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>mU6</td>
			<td>316 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>h7SK</td>
			<td>245 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA 足場</td>
			<td>83 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAMloop + gRNA 足場します。</td>
			<td>143 bp</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: コロニー PCR の結果を計算するには、各式カセットの理論的なサイズ。
<table><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>hU6</td>
			<td>hH1</td>
			<td>mU6</td>
			<td>h7SK</td>
			<td>STAgR_Neo</td>
			<td>STAgR_tdTomato</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA Scf</td>
			<td>400 bp</td>
			<td>360 bp</td>
			<td>451 bp</td>
			<td>380 bp</td>
			<td>3722 bp</td>
			<td>4487 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>サム</td>
			<td>460 bp</td>
			<td>420 bp</td>
			<td>511 bp</td>
			<td>440 bp</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>表 3: プロモーターと足場のサイズ。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>hU6</td>
			<td>hH1</td>
			<td>mU6</td>
			<td>h7SK</td>
			<td>STAgR_Neo</td>
			<td>STAgR_tdTomato</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA Scf</td>
			<td>368 bp</td>
			<td>328 bp</td>
			<td>419 bp</td>
			<td>348 bp</td>
			<td>+74 bp</td>
			<td>+67 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>サム</td>
			<td>428 bp</td>
			<td>388 bp</td>
			<td>479 bp</td>
			<td>408 bp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>表 4: STAgR 部分を PCR 後の計算されたサイズ。

文字列アセンブリ gRNA (STAgR) のクローニングを紹介ここでは、簡単に CRISPR/Cas9 のアプローチの gRNA のベクトルを多重化する方法。STAgR は、シンプルで効率的かつカスタマイズ可能な gRNA 多重になります。

文字列アセンブリ gRNA のカスタマイズ可能なプロトコル (STAgR) のクローニング

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

細菌CRISPR-Cas9システムは、生命科学者のための実験的な選択肢を大幅に増加させました。しかし、いくつかのCRISPRアプローチは、複数のガイドRNAを個々の細胞に同時に送達する方法に依存する。文字列アセンブリgRNAクローニングは、単一のクローニングステップで多重gRNA発現ベクターを簡単かつ迅速に生成することができます。しかし、STAgRはシンプルであるだけでなく、効率的で安価で、カスタマイズが簡単です。まず、N20 gRNA配列を、オーバーハングとしてSTAgR DNAストリングの前方増幅プライマーに追加します。センスgRNA配列を5つの素子をフォワードプライマー、足場フォワードプライマー、従来の足場用、またはMS2含有足場用のSAMフォワードプライマーに加える。次に、逆プライマー配列に逆補数N20 gRNA配列を追加し、使用する特定のプロモーターおよび文字列に応じてRPプライマーを選択する。ギブソンアセンブリの個々のクローニングフラグメントの生成を開始するには、10マイクロリットルの高忠実度バッファーをチューブに移します。10ミリモルdNTPsの1マイクロリットルと100マイクロモルオーバーハングプライマーの両方の0.25マイクロリットルを追加します。DNAテンプレート文字列、またはベクターの10ナノグラム、および1.5マイクロリットルのDMSOを追加します。最終容積を49.5マイクロリットルにするのに十分な水を加え、0.5マイクロリットルのHFポリメラーゼを加えます。テキストプロトコルで概説されているように、熱サイクラー上の反応をインキュベートします。この後、PCR反応から5.5マイクロリットルのアリコートを取る。すべてのアリコートに染料を添加し、1%アガロースゲルにロードします。適切なDNAラダーをサイジング用にロードし、ゲルを適切なゲルランニングバッファーで120ボルトで30分間実行します。ゲルが動いている間に、制限酵素を与えるバッファーの5マイクロリットル、および0.5マイクロリットルのベクターPCR反応の残りの44.5マイクロリットルに加え、PCR中に使用される残留プラスミドテンプレートを除去する。30~60分間摂氏37度でインキュベートします。アンプリコンのサイズが正しいことを確認します。DNA精製を開始するには、PCR製品1マイクロリットルあたり1.8マイクロリットルの磁気ビーズを加え、上下にピペットを入れ、混合します。室温で2分間インキュベートします。磁石を用いて、DNA断片中のビーズと残液を分離する。ペレットを70%エタノールで完全に再懸濁することなくリンスし、ビーズを洗浄する。この洗浄を1回繰り返します。ピペットを使用して、エタノールをすべて取り除き、ペレットエアを乾燥させます。その後、15〜20マイクロリットルの水を加え、ピペットを上下に加え、ペレットを混合して溶解します。磁石を使用してビーズを液体から分離します。クリア上清を新しいチューブに移します。この後、分光光度計を用いてDNA濃度を決定します。まず、テキストプロトコルに詳述されているように5x等温反応バッファーを調製する。ギブソンアセンブリマスターミックスの場合、5x等温反応バッファーの320マイクロリットルを697マイクロリットルの水と組み合わせます。T5エキソヌクレアーゼ3マイクロリットル、DNAポリメラーゼ20マイクロリットル、およびTaq DNAリガーゼの160人のmcirolitrを加える。アセンブリマスターミックスの7.5マイクロリットルを新鮮なチューブに移します。テキストプロトコルで概説されているように、ベクター内の挿入の2.5マイクロリットルを追加します。サンプルを摂氏50度で45~60分間インキュベートします。この後、サンプルを氷の上に保存するか、摂氏20度で保存し、その後の変換を行います。細菌を変換する準備ができたら、氷の上に化学的に有能なTOP10大腸菌を解凍します。次に、ギブソンミックスの5マイクロリットルを有能な細菌の50マイクロリットルに加え、チューブの底部を軽くフリックして混ぜます。氷の上で30分間インキュベートします。チューブを42°Cの水浴またはヒートブロックに45秒間入れ、細菌に熱ショックを与えます。その後、チューブを氷の上に戻します。250マイクロリットルのSOC培地を細菌に加え、30〜45分間揺れるインキュベーターで摂氏37度で回収させます。細菌が回復した後、ミリリットルアンピシリンあたり100マイクログラムを含む1.5%LB寒天プレートにプレートします。一晩で37°Cでプレートをインキュベートします。まず、各コンストラクトに対して200マイクロリットルPCR反応チューブを少なくとも2セット用意します。反応管のセットの1つを100マイクロリットルLB培地で満たし、1ミリリットル当たり100マイクログラムのアンピシリンを含む。滅菌ピペットチップを使用して、1つの細菌コロニーから生物学的材料を掻き取り、空の200マイクロリットルPCR反応チューブの底部に広げます。すぐにLB培地を含む第2対応反応管にピペット先端を移す。先端を回して、一部の細菌がLBメディアに転送されることを確認します。後で使用するために摂氏37度でインキュベート。次に、テキストプロトコルで概説されているように、反応管ごとにPCRマスターミックス10マイクロリットルを調製する。10 マイクロリットルの PCR マスターミックスを、LB メディアなしで標識 PCR 反応チューブに追加します。サーモサイクラーを使用して、テキストプロトコルに概説されているように反応をインキュベートします。この後、増幅された断片に負荷染料を加え、1%アガロースゲルにロードします。適切なDNAラダーをサイジング用にロードし、ゲルを適切なゲルランニングバッファーで120ボルトで30分間実行します。使用プロモーター、gRNA足場、およびN20配列の個数を加算することにより、アンプリコンの理論サイズを計算します。コロニーPCRの結果から、正しいバンドサイズに基づいて細菌クローンを同定し、それらが正しいベクターを収容する可能性があるかどうか。対応する100マイクロリットル培養物を用いて、1ミリリットルアンピシリン当たり100マイクログラムを含む2.5ミリリットルの一晩のLB培養物を接種する。摂氏37度で12時間インキュベートします。次に、メーカーの指示に従って、市販のプラスミドミニキットを使用してプラスミドDNAを抽出します。この手順では、文字列アセンブリgRNAクローニングを使用して、gRNA発現プラスミドを迅速に生成する。STAgR片を得るために使用されるPCRの典型的な結果は、ここで見られます。6つのアンプリコンは、直線的なDNA片を表し、それぞれがその末端に個々のgRNA N20配列を含む。プラスミド骨格はgRNA1とgRNA6の標的配列で拡張され、従ってギブソンアセンブリのための他の2つのPCRに必要な重複を有する。精製後、ベクターおよびインサート用の少なくとも1マイクログラムのDNA収量が達成される。ギブソンアセンブリの後、細菌の形質転換は100〜700の細菌コロニーをもたらす。22の細菌コロニーの代表的な分析は、6つのgRNAカセットを有するSTAgRプロトコルに従うコロニーPCRを介して、7つのクローンが完全なアセンブリに期待されるアンプリコンサイズを示していることを示す。他のクローンはSTAgRベクターを受け取った可能性が高く、1〜5個のgRNAカセットを含むが、一方、1つのクローンは完全に空である。一度習得すると、この技術は数時間で行うことができます。適切に行なわれ、働く週未満で多重gRNA発現ベクターを多数生成することを可能にする。この手順を試みる間、N20 オーバーハングプライマーの正しい割り当てと組み合わせに注意を払うことが重要です。このビデオを見た後、あなた自身の多重ガイドRNA発現ベクターを作成する方法についてよく理解しているはずです。

a-customizable-protocol-for-string-assembly-grna-cloning-stagr

Research

JoVE Journal

Genetics

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ギブソンアセンブリと遺伝子銃を用いてタバコの一過性の遺伝子発現

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