Name: 診断テストのための前提条件として外植体腫瘍スライスの樹立と解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 学ぶ外植体腫瘍スライスの樹立と解析法。マウス肺腫瘍を用いて薬剤応答を評価し、診断テストの前提条件として腫瘍生物学を研究する。組織構造を保持したスライスで複雑な生物機能をモデル化する。

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この研究では、金融サポート革新的な医薬品イニシアチブ共同事業から受信作業契約 no 115188、生物医学奨学金 (バトルシティ)、ヘルシンキ大学の博士プログラムおよびシグリッド Juselius を付与し、オリオン Farmos 基礎 (E.W.V.)。私たち PREDECT 組織スライス プラットフォームのコンソーシアム メンバーお礼申し上げます (プレミア タイトル af リク Turkki MATLAB 分析とサポートのための回転子システムのセットアップをサポートする Siv Knaappila と Hällström。居てサンシーロは図 1 写真のキャプチャに感謝の意を。我々 は組織学的のスライドをスキャンするための定額料金制の WebMicroscope チームに感謝し、実験動物飼育センターをサポートします。

<ol><li>Bruin, E. C., McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+intratumor+heterogeneity+unravels+lung+cancer+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Analysis of intratumor heterogeneity unravels lung cancer evolution.</a> Molecular and Cellular Oncology. 2 (3), e985549(2015).</li>
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<li>Narhi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+aspects+of+oncogenic+signalling+determine+the+response+to+combination+therapy+in+slice+explants+from+Kras-driven+lung+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Spatial aspects of oncogenic signalling determine the response to combination therapy in slice explants from Kras-driven lung tumours.</a> The Journal of Pathology. 245 (1), 101-113 (2018).</li>
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</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

様々 な複雑な体外腫瘍モデル、3 D 文化 organoids などは、アーキテクチャと生体内で腫瘍組織29,30の oncogenic 機能を要約する開発されています。ただし、組織の解離と単一の細胞型の選択成長または人工的な環境において選択いくつかのセルタイプの共培養 3 D 文化またはオルガノイドの確立が含まれます。結果として、このようなモデルは不完全な腫瘍の不均一性と腫瘍間質相互作用の複雑さをキャプチャします。脊髄腫瘍のスライス、その一方で、広範な操作なく上皮内腫瘍の組織アーキテクチャと生物学的複雑さを維持します。組織スライスのネイティブの微小環境のモデルがん細胞へのこの能力は、前臨床試験の特に魅力的なテンプレートします。我々 は以前報告した確立および腫瘍精密カット スライスの解析のために最適化されたワークフローと回転潜伏ユニットが短期マウス非小細胞肺癌スライス文化25の生存率を向上させることを示した、サポートをフィルターと比較して、,31します。 ただし、回転ユニットでの栽培は技術的に難しく、常に監視が必要です。腫瘍組織スライス世代の実用的な使用、回転、それらを文化にインキュベーション ユニットと同様の上皮内腫瘍生物学薬の前に前提条件をキャプチャするスライスの機能を監視する方法に伴うプロトコルが紹介します。応答テスト。
プロトコルのいくつかの重要な手順は、組織の整合性と腫瘍スライスの有効性を確認します。正常肺組織が腫瘍を囲む、vibratome は一貫性のない厚さでスライスを生成したり、スライス、質感や剛性の違い正常細胞と腫瘍組織からに損傷を与えます。したがって、腫瘍をスライスする前に周囲の正常肺組織を削除することが重要です。もう一つの重要なステップは、スライスの厚さは、組織の種類ごとに慎重に最適化する必要があります。さらに、一度スライス、スライスが培養液中の酸素露出浸漬断続的なので精度を確保する、グリッドの中央に約置かれることが重要です。最後に、それはその回転期間中にスライスの位置を従うことが重要培地へのスライスすることができますドロップ ダウンこのような場合さらにアクションはプロトコルの手順 3.6 で説明したように撮影できます。
ティッシュの処理の整合性を確保する、に加えてスライスがネイティブの組織に似ている解釈に IHC における重要なステップも。私たちの以前の研究は、マウスの非小細胞肺癌腫瘍が顕著な内腫瘍発癌シグナル伝達活動26の空間的不均一性を示すことを示した。つまりは、異なる組織の使用のスライスをコントロールまたは薬剤を投与したサンプルは信頼性の高い実験データの解釈に影響を与える、したがって密接に隣接するスライスは、コントロールとテスト サンプルとして使用する必要があります。我々 はさらに増殖しながらことを示したまたは新鮮なカットの教養 0 h スライスで発癌性リン蛋白質発現培養スライスを示した変更された発癌性リン蛋白質表現、具体的に変更された p4EBP1上皮内腫瘍に類似していたpSRC と変更された増殖キ67 IHC によって分析します。変更された p4EBP1 式同様に 24 時間に検出されたヒト非小細胞肺癌、前立腺癌スライス文化 (Narhi et al。、補足図 S3B S3C、S5 と S7)26。これらの調査結果は、最も近い 0 h 難スライス培養スライスの比較は培養スライスの上皮内腫瘍機能の保全を評価するために重要なことを支持します。
切片スライス25の生存率を改善するにもかかわらず、回転子システム技術的の面で制限があります。チタン グリッド上に組織のスライスを置くことは挿入、フィルターに比べて難しく、回転潜伏ユニットを利用できない場合があります。代わりに、停滞フィルター サポートを使用できますが、生存率および HIF1α 式で測定した低酸素のエアフィルターにグラデーションがフィルターでサポートされているスライス急速に形成されるとは、スライスの空気にさらされた側だけが分析する必要がありますその場合は文化 (デイヴィスら。 図 5、図 7A 7B)25。我々 はさらに腫瘍スライス培養が変更された増殖および彼らのネイティブ腫瘍の26、おそらく創傷治癒反応や代謝適応前のヴィヴォにスライスの原因に比べて発癌シグナル伝達活動を表わすことができることを示しています。32の文化します。72 時間培養中にマウスの非小細胞肺癌腫瘍の総の形態学的特徴を維持しましたが文化による増殖変化栽培スライスの正確な等級があります。したがって、組織スライスは短期的な機能の研究に対してのみ使用する必要があります。
回転培養装置の使用は少なくとも部分的に文化の最初の 24 時間、特に中にイントラ スライス生存率やバイオ マーカー式グラデーションを救助します。完全性および機能のメッセージが表示されましたら、これは薬物治療研究などの機能的な研究組織材料を提供します。薬物応答プロファイリングに加えて薬物治療に続く変更されたターゲット式抗体検証を利用できます。これは、これらが高い染色の背景を与える傾向があるマウスのモノクローナル抗体をマウスの抗原の検出のために特に関連。また、よく検証された抗体は、診断および臨床設定で信頼性が高く、再現性のあるデータを達成するために必要です。したがって、豊かさの変調または関連するエピトープ組織スライスの薬物治療の後のリン酸化抗体検証に便利な実用的なアプリケーションを提供します。腫瘍スライス文化の主な利点は、前のヴィヴォ魅力的なモデルになる腫瘍や間質細胞における発癌シグナル伝達活動や薬剤応答など、モデル空間分布関数に機能です。しかし、スライス回転栽培中、栽培のプロセスは、特に端組織を損傷することがさらに。それしたがってに挑戦正確にオーバーレイ 0 h スライスのバイオ マーカー染色 IHC 画像培養スライスの検出壊死領域の薬剤応答にバイオ マーカーの空間的活動を正確にリンクする機能を妥協します。さらに、腫瘍組み込み、文化による、薬剤性の壊死反応ではありません区別少なくとも空間薬剤応答の正確な定量を損なうこと、マウスの非小細胞肺癌組織スライス。最後に、腫瘍スライス培養の使用は、テストする研究者に対し、動物、従って精製、縮小、および実験動物に実験を交換する必要はなく、同じ腫瘍で複数化合物を許可します。
将来のアプリケーションとして臨床腫瘍サンプルに記載されているプロトコルを適用できます。さらに組織型に依存する変更または最適化が腫瘍テクスチャまたは剛性の最適化 vibratome 設定スライス厚と振動速度などを調整から始まる可能性が求められます。さらに、異なる腫瘍組織の栄養と成長因子の要件が異なる場合があります。例として、乳房がんスライス中13,18で補ったインスリン培養があります。手術または生検中に限られた組織材料を取得すると、そのレプリケーション サンプルの十分な数を得ることの難しさによる患者由来腫瘍スライス培養の最適化は難しい。さらに、データの再現性がによって挑戦も、特に線維化領域または間質浸潤、壊死組織と腫瘍細胞の割合で患者にサンプルの不均一性を発音します。最後に、設定の診断で腫瘍のスライスのアプリケーションには、薬物に前処理生検のスライスを外植体の反応に生体内で治療後の応答に一致する範囲の調査が必要となります。

肺がんなどの固形癌は、遺伝子と表現型の多様性を示すし、複雑な微小1,2を抱きます。腫瘍細胞と薬剤感受性および抵抗性メカニズム3周辺微小環境への影響との間の相互作用。これは、生物の複雑さとネイティブ腫瘍に作用の機能を正確にモデルすることができます前臨床モデルの必要性を強調表示します。彼らは時間、空間的に分散個々 の腫瘍の表現型を含む短いウィンドウの少なくとも生物生体内でを表すプリンシパルの容量を持っていると、すぐに新鮮な腫瘍由来精密カット スライスは一意のリソースを提供します。切除の臨床腫瘍癌患者から得られるいくつかのパーソナライズされた標本の 1 つ、診断使用の精査に値する。
ひと頭蓋内腫瘍が組織部分に手をカットし、いわゆるを使用して培養されたとき早い 19 世紀に戻って切片の文化の歴史には、ドロップがぶら下がっています。組織片は観察に添付され、ヘパリンのひと血漿、その後、coverslips を反転、密封し、いくつかの週間4培養に手をつけること。腫瘍部分以来されているプラズマの塊5、液体メディア6など様々 な他の方法を使用して培養または 0.45 μ m の細孔サイズ フィルター6を手動でカットします。「切片」の用語、ニワトリ胚目7網膜分化能に関する研究で、1954 年最初に使用されました。これは、ひよこの胚の8、およびラット9から脳外植片から派生した肺や心臓の組織移植片を使用する研究が続いた。
説明、すなわちマニュアル チョッパー10,11, Krumdieck 組織スライサー12,13, と vibratomes11,14,15、様々 な加工方法がされています。 16。Krumdieck 組織スライサーは、円筒形のティッシュのコアは、ミクロトームを使用して循環組織スライスは、スライスを生成します。Vibratome は、他の一方で、振動刃ミクロトームを使用します。肝スライスに関する、ライカ vibratome Krumdieck スライサー15と比較してより多くの再現性と一貫性のあるスライスを生成することが示されました。250 から 500 μ m に至るまでスライス厚は、使用されているし、報告が 16 日14,10,17,18までも生存率および形態学的特徴の維持。しかし、腫瘍栄養の要件に影響を与えることができる変数の代謝プロファイルと通気と養分の流れに組織の剛性とマトリックスの組成などのパラメーターに影響を与えることができます。したがって、それぞれの組織型にスライスとその培養条件の最適化が必要とする可能性が高いです。
栽培方法はスライスのカルチャをサポートする使用されている: 私) 固定相間文化、停滞サポート文化、培養液中に浸漬半多孔性膜挿入の上にスライスを配置するとも呼ばれます。これは、スライスの上にさらされて空気下部は多孔質挿入14,19; を介して栄養素を添加した中ii)、こてのメソッド、もともと文化全臓器または萌芽期ティッシュのスライスに開発されました。これでは、スライスは綿シートや金属グリッドでサポートされているフィルターの上に配置され、フィルターが培養液中に浸漬します。組織の潤いを保つ、スライス20,21,22の上に培地の薄層を追加します。これらの最初の 2 つは気液界面培養; と呼ばれるiii) ローラー チューブ文化、スライスは、媒体を含んでいるプラスチック管の平らな面の中に配置し、低速管回転により組織が、サイクルの最初の部分の間に媒体で覆われているか、2 番目の23の中に曝気iv) 回転インキュベーション ユニット、スライスが栄養素と曝気中に断続的にさらされています。スライスが培246 ウェル プレートは、多孔質チタン グリッド上に配置されますこの方法では、ローラ チューブとは異なる。
組織スライス生存率の評価を行うこと、抗がん剤での治療応答をテストするための魅力的なex vivoモデル切除腫瘍論理的に存在から派生した、経路活動と分子プロファイルをターゲットにそのネイティブの腫瘍微小環境の存在下で特定の腫瘍。しかし、腫瘍スライスで測定された薬物応答その場で応答の予測しているかどうかを評価するためどの程度の切片細胞増殖など腫瘍固有の生物学的機能を維持するために評価することが重要です。特異的病理組織学的細胞の分化や発癌シグナル伝達活動。スライス標本、スライス処理または文化誘起 adaptions 品質と生体組織スライスの中に誘発される機械的ストレスの影響は、基本的な質問、腫瘍由来を実装する機能に密接に結びついた機能診断のためのスライス。
IMI-資金を供給されたコンソーシアム事業 PREDECT (http://www.predect.eu) はこれらの基本的な質問、さまざまなソースからスライスを外植体を研究することによって体系的にアドレスに乗り出します。乳がん、前立腺、肺のがんモデルから派生したスライスを使用すると、この共同の努力利用質的進みますと同様、定量的ヘマトキシリンとエオシン (H & E) - 基づく大気中の酸素と停滞しているフィルターのための要件を示すリードアウト72 時間まで培養スライスの実行可能性を維持するためにサポートしています。さらに、培養スライスの免疫組織染色 (IHC) 解析はイントラ スライス生存グラデーション、マウスの非小細胞肺癌 (NSCLC) エストロゲン受容体 (ER)、HIF1α から派生したスライスの壊死の勾配として証明を明らかにし、γH2AX乳房癌のスライス、グラデーションまたは前立腺癌のアンドロゲン受容体 (AR) 式勾配25をスライスします。興味深いことに、24 h 培養マウス非小細胞肺癌におけるイントラ スライス生存グラデーションの回転培養装置で栽培に救出され、私たちの最近の研究は、生存率が 72 h26に拡張されたことを示した。特にトップ側に残った最も実行可能な26、支持組織のこちら側スライスに薬物応答解析は最高運ばれています。
組織スライスは上皮内腫瘍機能を要約することができます、ターゲットを絞った薬、モノクローナル抗体療法剤など、抗がん剤への応答をテストするのには広く使用されるにもかかわらず、それまでどのように疑問のまま10,11,13,14,18,27。最近マウスの非小細胞肺癌スライス増殖の動的変化が表示、発癌シグナル伝達活動栽培新鮮なカット 0 h と比較した場合が26をスライスしました。これは摂動実験前に栽培中対象となるその場での生物学的機能が適切に保持されるかどうかを調査することが重要であることを示します。これらの調査結果にもかかわらず示した腫瘍スライスが空間に対して目標とされた療法、薬物治療が残っている真っ只中をモデルすることができます (24 h) を簡単なし、26を養殖の発症で開始されます。次のプロトコルでは、確立と応用薬理学的薬剤のテストの前に、腫瘍のスライス文化の分析に関連する重要な検証の側面について説明します。

<table><tbody><tr><td>ハンクSigma</td><td></td> <td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン溶液</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 medium</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>21765-037</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>VWR</td><td>101174Y</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine 200mM</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>シアノアクリレート接着剤(GLUture)</td><td>アボット</td><td>32046-90-1</td><td></td></tr>ライ<tr><td>カVT1200 S振動ブレードミクロトーム</td><td>ライカバイオシステムズ</td><td>14048142066</td><td></td></tr><tr><td>スライスブレード</td><td>VWR</td><td>PERS60-0138</td><td></td></tr>チタン<tr><td>グリッドアル</td><td>バンマ研究開発</td><td>MA0036</td><td></td></tr><tr><td>スライスインキュベーションユニット</td><td>アルバンマ 研究開発</td><td>MD2500</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 組織培養プレート</td><td>サルスタット</td><td>83.1802</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェルプレート</td><td>サルスタット</td><td>83.1836</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>サルスタット</td><td>83.1839</td><td></td></tr><tr><td>ネオラス 皮下注射針</td><td>テルモ ネオラス</td><td>NN2525R</td><td></td></tr><tr><td>50 mL ファルコンチューブ</td><td>グライナー&nbsp;</td><td></td><td></td>227261</tr><tr><td>PBS</td><td>ロンザ</td><td>BE17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>フィッシャー</td><td>F/1501/PB08</td><td></td></tr><tr><td>三つ折りヒスト カセット ペーパー</td><td>がん診断</td><td>DX26280</td><td></td></tr><tr><td>ヒスト カセット</td><td>VWR</td><td>720-2199&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>KOS マイクロ波多機能組織処理装置</td><td>Milestone SRL</td><td>CAT307EN-003</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>HM355S</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Ultra plus slides</td><td>VWR</td><td>631-0099</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>NGS</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>シグマ</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>PT モジュール</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>サイエン</td>ティフィA80400012 <td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン H&E染色</td><td>メルク</td><td>1.09249.0500</td><td></td></tr><tr><td>対比染色用ヘマトキシリン</td><td>Dako</td><td>S3309</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma</td><td>E4382</td><td></td></tr><tr><td>NKX2-1 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab133638</td><td>ロット番号: GR98031-12</td></tr><tr><td>pERK 1/2 抗体</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>CST 4370</td><td>ロット番号: 17</td></tr><tr><td>p4EBP1 抗体</td><td>細胞シグナル伝達テクノロジーCST</td><td>2855</td>ロット<td>番号:20</td></tr><tr><td>BrightVisionポリHRPヤギ抗ウサギ二次抗体</td><td>ImmunoLogic</td><td>VWRKDPVR-110HRP</td><td></td></tr><tr><td>マウンティングメディカムパーテック</td><td>スVWR</td><td>MEDT41-4021-00</td><td></td></tr><tr><td>DAB&nbsp;</td><td>ImmunoLogic</td><td>VWRKBSO4-110</td><td></td></tr><tr><td>Dactolisib (NVP BEZ-235)</td><td>Selleckchem</td><td>S1009</td><td></td></tr><tr><td>セルメチニブ (AZD2644)</td><td>Selleckchem</td><td>S1008</td><td></td></tr><tr><td>Pannoramic 250 スライドスキャン</td><td>3DHISTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td><a href="https://se.mathworks.com/products/matlab.html">https://se.mathworks.com/products/matlab.html</a</td></tr><tr><td>>3DHISTECHパンノラミックビューア&nbsp;</td><td>3DHISTECH</td><td></td><td>https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS6</td><td>Adobe</td><td></td><td>https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&mv=search&s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s</td></tr><tr><td>Fiji-ImageJ</td><td>ImageJ</td><td></td><td>https://imagej.net/Fiji</td></tr><tr><td>CellProfiler</td><td>CellProfiler細胞画像解析ソフトウェア</td><td></td><td>http://cellprofiler.org/</td></tr></tbody></table>

診断テストのための前提条件として外植体腫瘍スライスの樹立と解析

Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing

精密カット スライスが含まれ、この切片一次組織植文化は、ネイティブの組織の細胞の相互作用と同様、三次元 (3 D) 組織アーキテクチャを表しています。たて切除から直ちに切断切片は、生物体内の有用なサロゲートのため腫瘍の不均一性の空間的な面を保持します。組織スライスの準備、栽培条件の最適化は基本的な注意してください腫瘍の予測診断可能性スライス外植片します。この点で、これらは複製、再現可能な実験を実行する腫瘍材料の一貫した流れを提供するマウスモデルは貴重です。このプロトコルはマウス肺腫瘍由来組織スライス回転潜伏ユニット、酸素と栄養素を組織の断続的な露出を可能にするシステムを使用しての養殖について説明します。私たちの前の仕事を示したインキュベーション ユニットを回転を使用するスライスを特にフローティング他の培養法と比較して組織の生存率向上し、停滞のフィルターをサポートしています。ここでは、さらにスライス厚生存率に影響を及ぼすことを示す培養スライスのスライス厚の最適化が提案されるべきである異なったティッシュのタイプのため。発音信号活動、間質の細胞浸潤または分化マーカーの発現などの関連する発癌性機能の ITH を要する薬物治療によって変更マーカーの発現の隣接組織スライスの評価や栽培自体。要約すると、このプロトコルが回転潜伏ユニットのマウス肺腫瘍スライスの世代と彼らの文化をについて説明し、前提条件として異種組織マーカーの発現のためスライスを体系的に分析する必要がある方法を示します薬物応答研究する前に。

図 1は、世代、栽培、マウスの非小細胞肺癌腫瘍由来精密カット組織スライスの分析のワークフローを表します。このデモでは、我々 は条件付きの活性化KrasG12D Lkb1 (セリン/スレオニン キナーゼ 11 として知られている) の損失と呼びますをかくまっている遺伝子組み換えマウス モデル (ジェム) から腫瘍を利用KL。マウスの繁殖と肺腫瘍の開始を行った26,28の説明に従って。図 2 aは、スライス回転のインキュベーション ユニットを使用して 24 時間培養の生存率に及ぼす組織スライス厚を示します。結果表示を 160 μ m の薄いスライスはスライス間で大きな壊死部分を含みます。また、250 μ m の薄いスライスは、スライス 200 μ m の薄いスライスと比較して全体のグラデーションする、壊死を表示します。薄 160 μ m の貧しい人々 の全体的な生存がこれらは壊れやすい、カールする傾向があるように、グリッドの上にスライスの位置決め中に技術的な処理によって引き起こされる可能性が高いです。その一方で、スライスは、スライスの間で酸素や栄養素の拡散不足になりやすいになる、あまりにも厚い、壊死死勾配25外植体マウス非小細胞肺癌では立証されます。ただし、同一 vibratome 設定の使用にもかかわらず、1 つの腫瘍から変数厚さのスライスが出来ます。したがって、異なる腫瘍サンプルから複数の複製を分析することをお勧めします。重要なは、各組織のタイプは酸素と窒素の流れに影響することができます組織質感と硬度最大生存率を達成するためにスライス厚最適化する必要があります。図 2B-2C NKX2 1 発現定量 IHC 解析を示しています、分化型肺腺癌 (AC) 試料中のマーカーは 72 h までを栽培し、0 h スライスを一致します。結果は、NKX2 1 式が 0 h 難スライス、栽培のプロセスがあからさま AC 腫瘍組織の分化状態を与えないことを示唆するいると比較して培養スライスで大幅変更されていないことを示します。図 2 Dは、対象となる薬の有効性を評価するための腫瘍組織スライスの有用性を示しています。我々 は最近、そのKras変異マウス ACs 展示の高発現リン酸 ERK1/2 (MAPK 経路活動の増加をマーキング) 示した (マーキング mTOR 活性リン酸 4EBP1 の式中の扁平上皮 (ASC) 腫瘍に比較すると)、同様に AC と ASC の腫瘍で表されます。これらの経路は、切片に効果的に対象とすることができますをテストするため KL AC 組織スライス DMSO 処理したまたは化合物、すなわち 0.1-1 の量を滴定対象とする mTOR 経路または 0.05 – 0.5 μ dactolisib μ M selumetinib MAPK 経路を対象とします。Selumetinib の 0.5 μ M または 1 μ M dactolisib がそれぞれ 4EBP1 または ERK1/2 のリン酸化を抑制することで有効であることを示した。さらに、ターゲットを絞ったリンタンパク用量依存的な抑制は、リン酸化特異的抗体を検証する利用組織スライスできますを示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig1.jpg"> 図 1: マウスの非小細胞肺癌腫瘍由来スライス植の確立と解析のワークフローの略図。(A) 回路図コレクションおよび担癌肺のスライスの準備を記述します。肺がマウスから収穫され、正常組織から腫瘍組織を解剖しました。黒い矢印とアスタリスクを示す約 4 mm と 1 mm の腫瘍。白い矢印は、試料ホルダーの表面に接着された肺組織を示します。正常肺の追加部分で赤い矢印のポイントは、直立位置で腫瘍を保持する組織をサポートします。(B) Vibratome スライスと組織スライスのコレクション。白い矢印は、スライス方向を示します。冷たい HBSS + P/s. を含む 24 ウェル プレートに逐次スライスのコレクションスライスはどちらか異なる時間ポイント (ここで 24-72 h) 栽培 (上の行)、腫瘍特異的マーカー発現を評価するために培養することができます。 または、薬物治療を実行する使用することができます。C: 車両制御、t: 薬物治療。(C) 回転培養装置を用いた栽培の組織スライスを配置すること。傾け 6 ウェル プレートを使用して、グリッドの上部をカバーするいくつかの媒体、媒体上にグリッドの中央組織スライスを置き、鉗子を使用してスライスを広めます。6 ウェル プレートがスムーズな回転サイクルのバランス重量であることを確認します。X: を示しますが正しくありませんと<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58569/58569eq1.jpg">: スライスの正確な位置を示します。(D) 腫瘍スライスの FFPE ブロックの写真です。パラフィン埋め込まれたティッシュのスライスで黒い矢印は、ヘマトキシリンで染色。FFPE ブロックでスライスの断面の順序を示す (E) 回路図組織の生存率および特定の腫瘍マーカー式を評価するためには、これらのセクションを処理できます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig2.jpg"> 図 2: 生存率と histotype 特定のマーカー発現の非小細胞肺癌組織スライスの標的化薬物治療評価します。(A) 代表 H &amp; E 画像 24 時間 200 μ m 薄くスライス培養示された厚さのスライスを AC 非小細胞肺癌の維持 160 μ m または 250 μ m の薄いスライスと比較してよりよい生存率。濃い青が H &amp; E 染色可能な組織を表し、ピンクが pseudocolored 壊死領域を示します。水色は、いずれかにより、貧しい人々 の組織の品質や腕組の存在の分析から除外する領域を示します。T1 と T2 の 2 つの異なる腫瘍由来生物の複製を表します。スケール バー = 500 μ m。 (B) 代表的な IHC AC スライス培養示された時間ポイントにおける NKX2 1 発現の画像。矢印は、高倍率で表示される領域を示します。結果は、NKX2 1 式が 0 h スライスに比べて培養スライスで変更されていないことを示します。スケール バー 500 μ m、50 μ m の低、高倍率をそれぞれ =。(C) (B) に示すようにデータの定量化。(D) 代表 IHC 画像リン酸 4EBP1 の 0 h に pERK1/2 式スライス、スライス DMSO 処理または dactolisib (dact、一番上の行) の量を滴定または 0 h スライス、または DMSO 処理スライスの pERK1/2 式をリン酸化やselumetinib (sel、下段)。黒正方形のボックスは、高倍率で示されている領域を示します。スケール バー 1 mm または 50 μ m 低または高の倍率をそれぞれ =。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

世代、栽培、マウス肺腫瘍由来の切片スライスの系統的解析の手段します。我々 はまたスライス厚の最適化する方法とスライスの腫瘍を治療するために薬物濃度を選択する方法について説明します。

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the ...

この方法は、腫瘍スライス外植の薬物応答研究が診断目的に役立つ可能性のある前臨床研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、スライスの外植は、空間的に分散された関数を含むネイティブ組織の複雑な生物学をモデル化する時間の短いウィンドウのためにできることです。この方法は、マウス肺腫瘍からのスライスの使用に関する洞察を提供することができるが、それはまた、ヒト組織を含む他の組織タイプに適用することができる。開始するには、ビブラートを準備し、マニュアルに記載されている指示に従ってVibraCheckを実行します。その後、ペニシリンとストレプトマイシンを補ったハンクのバランス塩溶液の1ミリリットルで24ウェルプレートの各井戸を充填し、氷の上にプレートを保ちます。胸が露出し、動物が引き伸ばされるように、発泡スチロールの蓋の上に置かれた安楽死マウスの4つの足すべてに25ゲージの針を挿入します。露出した皮膚の表面に70%アルコールをスプレーします。斜めの位置に置かれたはさみを使用して、腹部から胸に向かって、そして首の領域まで皮膚を切り開きます。鉗子を使用して両側の皮膚を伸ばし、25ゲージの針を挿入します。腹部を切り開く。次に、肋骨ケージと横隔膜を切り開いて肺と心臓を露出します。周囲の組織を切り取って気管を露出させる。心臓と一緒に肺を解剖する。30ミリリットルの氷冷HBSSを含む50ミリリットルのチューブに組織を入れ、氷の上に置かれたペンストレップを補い、できるだけ早く次のステップに進みます。今度は腫瘍を持つ肺を10センチメートルの組織培養プレートに移す。生殖不能のはさみおよび鉗子を使用して肺の葉を分離し、スライスのために表面に腫瘍を有するローブを選択する。濾紙の上に腫瘍組織を持つ肺葉を置き、滅菌メスを使用して腫瘍を取り囲む正常な肺または追加の腫瘍組織の一部を切り取って平らな組織片表面を生成するのを避ける。シアノアクリル酸接着剤の滴で平らな側を浸し、腫瘍が直立した位置でブレードに向かうことができるようにビブラートメ標本ホルダーに取り付け、2〜3分間乾燥させます。ビブラートメの標本ホルダーを金属バッファートレイに入れます。ティッシュがバッファーに浸されるまでペンストレップで補った冷たいHBSSでトレイを満たします。楽器に付属のプレキシグラス蓋でバッファートレイを覆い、トレイを白い氷浴に入れ、スライス中に組織を冷たく保つために氷を加えます。白い氷浴をビブラートメに取り付けます。次に、適切なスライス設定を選択し、スライスを開始します。ビブラートメブレードをスライス位置に持ってきて、スライスウィンドウを設定します。滅菌鉗子を使用して、1ウェルあたりPen-Strepを補ったHBSSの1ミリリットルで満たされた24ウェルプレートにスライスを収集し、氷の上に保ちます。スライスの順序を追跡しながら、実験計画に従って24ウェルプレートの各ウェルをマークします。培養スライスに隣接する組織スライスをゼロ時間または未培養参照として収集する。組織の上部、中央、底部を表すために、少なくとも3つの参照スライスを収集します。スライスが完了したら、修正と処理を続けます。その後、チタングリッドを入れて、1ウェルあたり2.5ミリリットルの培養培地を含む6ウェルプレートを準備します。チタングリッドと媒体の間に気泡が形成されないようにしてください。スライスをグリッドにロードするには、6 ウェル プレートを斜めの位置に保ち、メディアの一部がグリッドを覆います。次に、スライスをグリッド上の媒体に配置し、鉗子を使用して広げます。スライスを配置した後、95%02と5%CO2で摂氏37度に維持加湿インキュベーターの中に置かれた回転インキュベーターに6ウェルプレートをロードします。回転サイクルを開始します。長期間の栽培のために、滅菌鉗子を使用して組織スライスを含むグリッドを持ち上げ、6ウェルプレートの空の井戸に入れ、毎日培養培地を補充する。培地の70%を新鮮な培養培地に置き換え、グリッドを元に戻します。以前と同様に、回転サイクルを継続します。腫瘍スライスの薬物治療のために、希釈された薬物または車両制御を有する培地2.5ミリリットルを6ウェルプレートに加える。チタングリッドを井戸に入れ、スライスを先に行ったようにグリッドに配置します。24時間治療を行った後、固定処理を続ける。所望のスライスの固定を開始するには、慎重に2〜3ミリリットルPBSで満たされた浸した濾紙を含む10センチメートルのプレートに鉗子を使用してそれを転送し、それを浮かべます。次に、フィルターペーパーを鉗子で持ち上げ、ヒストカセットに入れ。フィルター用紙をヒストカセットに移します。組織スライスの上に希釈したヘマトキシリンの滴を加えて、その後のステップのスライスの位置をマークします。カセットを閉じ、4%中性緩衝ホルマリン溶液に移し、摂氏4度で一晩放置します。プロトコルに記載されているようにカセットの洗浄と処理後、ヒストカセットを開き、メスを使用してフィルターペーパーから固定スライスを慎重に持ち上げます。濾紙を捨てて、流動パラフィンを含むモールドにスライスを移します。平らな重量を使用して、均一な断面化を確実にするために、埋め込み型の底部に対して組織を押し付ける。金型の上にヒストカセットの下部を置きます。その上に流動パラフィンを加えます。そして、冷たいプレートで30分間カビを冷まします。その後、冷却された金型をパラフィンブロックから分離する。マイクロトームを使用して、FFPE組織スライスブロックの4マイクロメートルの薄い切片を調製します。組織を取り巻くパラフィンの過剰をトリミングします。組織全体の切片を得るためには、ブロックの表面がブレードに対して水平方向に向くようにブロックの角度を調整する。薄いブラシを使用すると、パラフィン埋め込み組織スライスのシーケンシャルな組織切片が、スライドガラスの上部から採取されます。より深い組織層のセクションを中央に集め続け、続いてガラススライドの下部を採取する。各組織スライスの異なる層からオブジェクトスライドまでのセクションの収集は、生存率、細胞遊離またはバイオマーカー発現における潜在的な培養誘発勾配の捕獲を可能にするために行われる。セクションを収集した後、プロトコルで説明されているように、その処理とさらなる分析を続行します。組織スライスの厚さは、培養スライスの生存率に影響を与える可能性があります。この場合、厚さ250マイクロメートルのスライスは、厚いスライスがスライス全体の酸素または栄養拡散の欠乏を起こしやすいため、厚いスライスと比較して壊死勾配が増加することを示しています。しかし、160マイクロメートルの薄いスライスは、これらは壊れやすく、カールする傾向があるため、スライスの位置決め時の技術的な取り扱いによって引き起こされる大きな壊死領域を含んでいる可能性があります。よく分化した肺腺癌のマーカーであるNKX2-1の分析は、培養スライスの発現が、培養されていないスライスのゼロ時間と比較して有意に変化しないことを示している。NKX2-1発現の定量分析は、培養スライスと未培養スライスにおいて発現が有意に変化していないことをさらに確認し、培養プロセスが腺癌組織の分化状態に目に見えて影響を及ぼさないことを示唆した。腫瘍組織スライスを使用して標的薬物の有効性を評価できるかどうかを試験するために、DMSOまたは滴定量の化合物で治療した。4EBP1のmTOR経路リン酸化を標的とする1つのミクロモルダクトリシブで処理した場合、阻害された。MAPキナーゼ経路を標的とする0.5マイクロモルセルメチニブは、ERK1/2のリン酸化を阻害するのに有効であった。このビデオを見た後、あなたは、貴重な腫瘍組織から切り取られたスライスを扱い、批判的に分析する方法をよく理解している必要があります。私たちの以前のポスドク、Katja Narhiは、IMIプレデックコンソーシアムティッシュスライスプラットフォームの同僚と共同でこの方法の確立に大きく貢献しました。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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