Name: 培養ショウジョウバエ卵室のタイムラプスムービーを用いた局所細胞および組織スケールにおけるアトミオシンダイナミクスの解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 学ぶ アクトミオシンダイナミクスの解析法。Fijiソフトウェアを用いてショウジョウバエ卵室の上皮細胞と組織スケールでアクトミオシン挙動を解析します。スクリプト不要で初心者にも最適です。

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著者らは、セレステ・ベルク研究所4から採用されたアプローチを使用して、卵室のインビトロライフイメージングに関する彼女のアドバイスを共有してくれたミリアム・オスターフィールドに非常に感謝しています。我々はまた、細胞セグメンテーションを可能にするフィジーのスクリプトのためにセバスチャン・トシに感謝します。

<ol><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3679(2012).</li>
<li>Hudson, A. M., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying oogenesis.</a> Methods. 68, 207-217 (2014).</li>
<li>Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cultivation and Live Imaging of Drosophila Ovaries.</a> Methods of Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).</li>
<li>Peters, N. C., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Culturing+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Egg+Chambers%3A+A+History+and+Adaptable+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In Vitro Culturing and Live Imaging of Drosophila Egg Chambers: A History and Adaptable Method.</a> Methods of Molecular Biology. , 35-68 (2016).</li>
<li>Spradling, A. C. Developmental Genetics of Oogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpradling%2C+AC+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%2C+Volume+1%22">The Development of Drosophila melanogaster, Volume 1</a>. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).</li>
<li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331, 1071-1074 (2011).</li>
<li>Andersen, D., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+ovarian+muscle+contraction+and+oocyte+growth+on+egg+chamber+elongation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila.</a> Development. 143, 1375-1387 (2016).</li>
<li>Pokrywka, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+GFP-labeled+proteins+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live imaging of GFP-labeled proteins in Drosophila oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50044(2013).</li>
<li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).</li>
<li>Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bullwinkle+is+required+for+epithelial+morphogenesis+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 267, 320-341 (2004).</li>
<li>Cetera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+rotation+promotes+the+global+alignment+of+contractile+actin+bundles+during+Drosophila+egg+chamber+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Epithelial rotation promotes the global alignment of contractile actin bundles during Drosophila egg chamber elongation.</a> Nature Communications. 5, 5511(2014).</li>
<li>Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+rotation+is+preceded+by+planar+symmetry+breaking+of+actomyosin+and+protects+epithelial+tissue+from+cell+deformations%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations.</a> PLOS Genetics. 13, e1007107(2017).</li>
<li>Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+polarized+actomyosin+contractile+flows+control+epithelial+junction+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling.</a> Nature. 468, 1110-1114 (2010).</li>
<li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 393, 209-226 (2014).</li>
<li>Haase, R. Surface manager. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager">https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager</a> (2018).</li>
<li>Viktorinova, I., Haase, R., Pietzsch, T., Henry, I., Tomancak, P. Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins">https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins</a> (2018).</li>
<li>Pietzsch, T. BigDataViewer. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.net/BigDataViewer">https://imagej.net/BigDataViewer</a> (2017).</li>
<li>Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BigDataViewer%3A+visualization+and+processing+for+large+image+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets.</a> Nature Methods. 12, 481-483 (2015).</li>
<li>Turner, C. M., Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+the+actin+and+microtubule+cytoskeletons+in+the+morphogenesis+of+epidermal+hairs+during+wing+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for the actin and microtubule cytoskeletons in the morphogenesis of epidermal hairs during wing development in Drosophila.</a> Mechanisms of Development. 70, 181-192 (1998).</li>
<li>Heemskerk, I., Streichan, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cartography%3A+compressing+bio-image+data+by+dimensional+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Tissue cartography: compressing bio-image data by dimensional reduction.</a> Nature Methods. 12, 1139-1142 (2015).</li>
<li>Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetry+Breaking+in+an+Edgeless+Epithelium+by+Fat2-Regulated+Microtubule+Polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity.</a> Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).</li>
<li>Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+to+light-sheet+microscopy+for+adventurous+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists.</a> Nature Methods. 12, 30-34 (2015).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

卵室の解剖と培養のための重要なステップとトラブルシューティング
あまりにも多くのハエが小さなバイアルに置かれると、ハエの食べ物は幼虫と大人のハエがハエの食べ物に閉じ込められるので、2~3日後に泥だらけになる可能性があります。このような場合は、これらのハエの残りの部分を新鮮な食品と新しいバイアルに反転し、その数を小さくします。特に、食べ物に詰まった女性を除外します。
シュナイダーミックス(SM)は事前に調製する必要があり、〜14日間4°Cで保存することができます。古いミックスは、卵室の表面を損傷する可能性のある結晶が含まれている可能性があることに注意してください。常に新鮮なインスリンとSMを混合し、室温に達するのに十分な時間を許可します。これは、微小管の成長および細胞骨格の平面的な位置合わせに悪影響を及ぼす可能性のある冷たい衝撃から卵室を保護する(発達中のショウジョウバエ翼19に見られるように)。
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ライフサイエンス分野における新しいイメージング技術やソフトウェア技術の継続的な発展は、生命の基本原理を理解する上で大きなインパクトを与えています。主な課題の1つは、様々な組織におけるライブイメージングと組み合わせた発達プロセスの信頼性の高い可視化です。組織は臓器や身体の一部であり、そのため、大部分はイメージングに容易にアクセスできません。そこで、生体内の生体内の生体内状況を十分に反映する生物学的事象を可視化するために、解剖と体外培養を可能にするプロトコルが開発されている。
過去数十年にわたり、ショウジョウバエの卵室の培養とライブイメージング、原始臓器に似たアシナー様構造は、原始臓器開発の基本原理の理解に大きく貢献してきました1,2,3.現在、利用可能ないくつかの培養プロトコルがあり、その使用法は、取得時間、画像化される細胞タイプ、およびそのアクセシビリティ(例えば、内生殖細胞系対外体線)4に依存する。
これらすべての培養プロトコルの共通の特徴は、液体媒体で高い収縮活性を示す分析された卵室の固定化の必要性である。卵室の収縮活性は、主に接続された卵室5、6、7の長い文字列をカバーする筋肉シートによって引き起こされる。したがって、若い卵室の適切な固定化を達成するために、様々なアプローチが開発され、カバースリップ6、8、9または柔軟な毛布4で卵室を覆うことを含む、 10または低融点アガロース3、11にそれらを埋め込む。これらのアプローチは、卵室の円周面の微妙な平坦化によるより大きな視覚面のイメージングも可能にするため、人気があります。
しかし、最近では、若い卵室(ステージ1-8)が前頭軸6の周りを回転し、この組織運動がこれらの若い卵室の周囲の表面に近い微細なアトミオシンネットワークによって動力を与えられることが示されている。12.したがって、この組織の微妙な平坦化によって引き起こされる細胞表面の人工的な変化は、力を発生させるアミュミオシン機械の挙動に悪影響を及ぼす可能性がある。対抗点は、卵室組織が平坦化されない場合、卵室の周面におけるタンパク質の顕微鏡イメージングは、集録面のサイズの減少によってさらに制限される。
したがって、Prasad et al.9と Celeste Berg 4,10のラボからプロトコルを組み合わせ、さらに改変して、開発された方法でカバースリップ/フレキシブル ブランケット/アガローズが使用されないようにしました。ショウジョウバエの卵室は、メディアで自由に培養され、ここで提示されるプロトコルは、反転顕微鏡のみを適用します。プロトコルには 2 つの部分があります。最初の部分は、卵室内の局所細胞スケール(最大15細胞)でのアトミオシンシグナルの分析に焦点を当てています。第2部では、卵室の自由な培養によって引き起こされる小さな集積面に関連する制限を克服することに焦点を当てます。この点に関して、我々は、円周組織表面の定義された層を選択的に抽出し、展開する半インタラクティブなグラフィカルユーザーインターフェイスを用いた新しいフィジーベースの計算方法を開発した。これに続いて、組織スケール(>50細胞)でアクトミオシンを分析する方法を説明するプロトコルが続きます。曲げられた上皮組織の定義された薄い層の選択的抽出は、古典的なZスタック投影(図1)を用いて容易に不可能であったので、この使いやすい方法は、包括的に理解するための重要な前提条件として機能する。ショウジョウバエ卵室の組織スケールにおける薄い(<1 μm)アミュニ発網の挙動。
さらに、プロトコルを容易にするために、我々は蛍光タグ付き非筋肉従来のミオシンII行動の例のタイムラプスムービー(TTLM)とサンプルファイルを提供する(補足ファイル3を参照)。ミオシンIIは、運動タンパク質であり、アクトミオシン機械の活性収縮部を表す。ミオシンIIを画像化するために、MRLC::GFPと呼ばれるミオシンIIの改変された調節性軽鎖を含むショウジョウバエトランスジェニックラインを使用しています(詳細は材料の表を参照)12,13.細胞膜を可視化するために、プロトコルは市販の染料に基づいています(材料の表を参照)。このプロトコルは、小さな細胞内MRLC::GFP信号12の分析だけでなく、Life-Act::GFP12、14で観察されたものなど、±300 μMの周りの類似サイズの細胞粒子の分析にも適しています。
これらのプロトコルは両方ともインビトロ培養ショウジョウバ卵室を用いて提示されるが、培養培養培養媒体の最適化および可用性に応じて他の組織を用いてアトミオシンシグナルの獲得を行うこともできる。対応する市販染料を有する蛍光タグ付きタンパク質または、例えばmRNAマイクロインジェクションを用いて一過性遺伝子発現プロファイルを得る。同様に、周囲の表面から薄い層を抽出するためのフィジーベースのプロトコルは、より一般的に楕円体および器官様組織に適用することができる。

<table><tbody><tr><td>シュナイダーミディアム</td><td>ギブコ</td><td>21720-024</td><td>[+]-グルタミン</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ギブコ</td><td>15140-122</td><td>&nbsp;[+] 10.000 単位/mL ペニシリン [+] 10.000 &micro;g/mL ストレプトマイシン</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>シグマ</td><td>&nbsp;F135</td><td>熱不活化</td></tr><tr><td>インスリン溶液 ヒト</td><td>シグマ</td><td>&nbsp;I9278</td><td></td></tr><tr><td>50 mL ファルコンチューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td>滅菌</td></tr><tr><td>Millex-GV フィルター</td><td>ミリポア</td><td>SLGV033NS</td><td>33 mm</td></tr><tr><td>ガラス底 マイクロウェル皿</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>35 mm シャーレ、14 mm マイクロウェル、No. 1.5 カバーガラス</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>A. Dumont &Fils</td><td></td><td>&nbsp;#55</td></tr><tr><td>CellMask Deep Red (cell membrane dye)</td><td>Invitrogen</td><td>C10046</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64 (cell membrane dye)</td><td>ThermoFisher/Invitrogen</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>Depression dissection slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-560B</td><td></td></tr><tr><td>Microscopic equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steromicroscope</td><td>例:Zeiss</td><td></td><td>Stemi SV 6</td></tr><tr><td>倒立共焦点顕微鏡</td>(<td>例:ツァイス/オリンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>) スピニングディスク顕微鏡</td>(<td>例:ツァイス/アンドール</td><td></td><td></td></tr>) <tr><td>顕微鏡ガラス/カバーガラス</td><td>(例:Thermo Scientific/Menzel Glas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cactus tool</strong</td>><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wironitニードルホルダー</td><td>ハンマッハ</td><td>9160020</td><td></td></tr><tr><td>サボテンの背骨</td><td>Echinocactus grusonii/barrel cactus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila 原稿で使用されている株</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP</td><td></td><td></td><td>詳細については、Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelingを参照してください。ネイチャー2010、Vol.468、1110-1115ページ。</td></tr><tr><td>AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103C</td><td></td><td></td>詳細については<td>、Viktorinova et al.を参照してください:上皮回転は、アクトミオシンの平面対称性の破れに先行し、細胞の変形から上皮組織を保護します。PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107.</td></tr></tbody></table>

培養ショウジョウバエ卵室のタイムラプスムービーを用いた局所細胞および組織スケールにおけるアトミオシンダイナミクスの解析

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

ショウジョウバエ未熟卵は卵室と呼ばれ、その構造は、発達中に円形から楕円体の形に形態的変化を受ける原始的な器官に似ています。この発達過程は、ウージェネシスと呼ばれ、次のフライ世代を確保するために機能的な成熟卵を生成するために重要です。これらの理由から、卵室は動物の臓器の発達を理解するための理想的で関連性の高いモデルとして役立っています。
いくつかのインビトロ培養プロトコルが開発されているが、これらのプロトコルにはいくつかの欠点がある。一つは、それらを固定し、分析された卵室の円周表面の画像取得面を増加させるために、画像化された卵室に人工的な圧力を加える様々なカバーの適用を含む。このようなアプローチは、長い軸を中心に卵室を回転させる力を生み出す薄いアクロミオシン機械の挙動に悪影響を及ぼす可能性があります。
したがって、この限界を克服するために、我々は卵室の周囲に沿ってアクトミオシン機械を確実に分析するために、メディアで自由にショウジョウバエの卵室を培養する。プロトコルの最初の部分では、局所的な細胞スケール(最大15セル)で限られた集録平面でアトミオシン機械を分析する方法を詳細に説明するマニュアルを提供します。プロトコルの第2部では、卵室の円周表面の定義された薄い層の簡単な抽出を可能にする新しいフィジーベースのプラグインをユーザーに提供します。次のプロトコルは、組織スケール(>50細胞)でアクトミオシンシグナルを分析する方法を説明します。最後に、これらのアプローチの限界を局所的な細胞と組織の両方のスケールで特定し、将来の開発の可能性と可能な応用について議論します。

このプロトコルは、科学者が上皮組織におけるアトミオシンネットワークの挙動を調査することを可能にする。これは、局所細胞スケール(少数の細胞)におけるアトミオシン行動の詳細な分析が組織スケール(多くの細胞)で同様の分析と組み合わされた場合にのみ可能である。しかし、上皮組織はしばしば湾曲しており、これらの組織の薄い層の抽出は以前は容易に不可能であったが、ショウジョウバエの卵室に示すように(図1)。ここで示すプロトコルは、これらのスケールの両方でアトミオシンの動作を分析する方法を説明する簡単な指示をユーザーに提供します (図2)。
このプロトコルの最初の部分は、Surface managerプラグインを使用したアクトミオシンパルスの分析に関する指示に...

このプロトコルは、フィジーベースのユーザーフレンドリーな方法論と、個々の細胞および湾曲した上皮組織におけるアクトミオシンの挙動を確実に分析する方法を説明する簡単な指示を提供する。チュートリアルに従うためにプログラミングスキルは必要ありません。すべてのステップは、フィジーと関連するプラグインのグラフィカルユーザーインターフェイスを使用して半インタラクティブな方法で実行されます。

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

我々のプロトコルは、科学者が個々の上皮細胞の細胞下アトミオシンネットワークを分析するのに役立ち、また、湾曲した上皮組織の多細胞スケールで同様の分析を行うことを可能にする。私たちのプロトコルは、フィジーのアプリケーションの素晴らしい例です。直感的なグラフィカルユーザーインターフェイスを備えており、スクリプトの知識は必要ありません。そのため、初心者の現場にも最適です。我々の方法はショウジョウバエ卵室のために開発されたが、それはまた、ショウジョウバエ上皮の外に適用可能である。私たちは、科学者がモデルシステムで私たちのプロトコルをテストすることを奨励します。このプロトコルを理解するには、付属のテスト ファイルを使用します。このプロトコルのどの部分が個々の研究の質問に適するかを決定するのに役立ちます。このプロトコルのこの部分は、ユーザーがタイムラプスムービーで上皮細胞をセグメント化し、その後、Surface Managerを使用して個々の細胞内のアクトミオシンパルスを時間をかけて分析することを可能にする。まず、フィジーを開き、マクロのティッシュセルセグメントムービーをインポートします。付属のテキストプロトコルに記載されている ijm。次に、漂白剤補正した TIFF ファイルを開き、メニュー バーに移動して[イメージ]、[色]、および [分割チャネル] の順に選択して、漂白剤補正ファイルのチャンネルを分割します。選択したタイムラプスムービーのアクティブセル膜チャンネルで、開いているスクリプトでアイコンをクリックして、アップロードしたスクリプトを実行します。優れたセル マスクを取得するには、ガウス ブラーを 2.500 に設定し、セル検出感度をマイナス 1 に設定し、[OK] をクリックします。次に、63x の目的で取得したタイムラプス ムービーの推定ノイズ許容値を 10 ~ 20 の範囲で設定し、[OK] をクリックします。生成されたセルマスクが、解析されたタイムラプスムービーに表示され、ParticleStack という新しいウィンドウが表示され、「アクションが必要」という小さなウィンドウも表示されます。タイムラプスムービーのセルマスクから、中央のセルだけに焦点を当て、タイムラプスムービー全体を通して完全かつ明確に定義されたアウトラインを提供できるセルを選択します。中央の選択したセルが実際のセル膜にうまく対応している場合は、ParticleStack を TIFF ファイルとして保存します。フィジーで対応するパーティクルスタック TIFF ファイルを開きます。フィジーにインストールされている Surface マネージャープラグインで、プラグインを開きます。Surface Manager で、[アウトライン イメージを読み取り] ボタンをクリックし、セルの数によっては、ジャックカード インデックスを 60% に設定すると、アウトラインの読み込みに数分かかる場合があります。ロード後、各セルに S 番号が割り当てられ、サーフェス マネージャ ウィンドウの左側に表示されます。選択した S 番号をクリックして、ParticleStack1 から読み込んだセルのアウトラインを作成します。ティフはタイムラプス映画に登場します。ムービー全体で、インポートされた各 S 番号のセルのアウトライン品質を確認し、誤ったセルのアウトラインを表示する不要なセルを削除します。不要なセルを削除するには、セルのアウトラインをハイライト表示して[削除]ボタンをクリックします。ブラシツールを使用して、セルのアウトラインを修正します。完了したら、修正したセルを RoiSet として保存します。zip ファイル。分析された組織にアクトミオシンパルスが存在するかどうかを特定し、詳細な行動を理解する, だけでなく、アトミオシン信号の方向性, フィジーを開くことから始めます.タイムラプスムービーを開き、保存されたParticleStack1をロードします。ティフセルマスクと漂白補正されたタイムラプスムービーを読み込み、その後、Surface Managerプラグインと関連する領域をRoiSetからロードします。zip ファイル。次に、Surface Manager で、目的のシグナルを持つチャネルをアクティブにします。[統計] ボタンをクリックして、[スライスによる平均グレー値スライス] というウィンドウを取得します。アクトミオシン信号の平均と中央値の強度は、時間の経過とともに、セルの面積と形状に関連する他のパラメータとして表示されます。[統計] ウィンドウに移動し、[ファイル] をクリックして [名前を付けて保存] を選択し、セル マスクを生成して Surface Manager にロードして、組織スケールでアクトミオシン パルスを解析して、値をスプレッドシート ファイルとして保存します。プロトコルのこの部分は、ユーザーが選択的に時間をかけて湾曲上皮組織中のアクトミオシンの薄い層を抽出することができます.これらの手順は、ユーザーフレンドリーで、直感的なグラフィカルインターフェイスに基づいています。フィジーを開き、楕円面投影プラグインがインストールされていることを確認します。次に、タイムラプスムービーを開き、プラグインをクリックして、BigDataViewerに移動し、XML/HDF5ファイルとして現在のイメージをエクスポートを選択して、XML /HDF5ファイルとしてエクスポートします。次に、エクスポートしたファイルを[Ellipsoidサーフェスプロジェクション]で開くには、プラグインに移動し、BigDataViewerをクリックし、続いて楕円体表面投影を選択し、XMLファイルを選択します。これにより、卵室の矢状のビューを持つ新しいウィンドウが開き、処理を通してユーザーを導くダイアログが表示されます。「卵巣投影」と呼ばれるダイアログウィンドウには、いくつかのタブがあります。バウンディングボックスと呼ばれる最初のダイアログタブで、バウンディングボックスのz幅と共にタイムラプスムービー内の卵室のxとYの境界線を定義し、セットを押します。卵の部屋の選択された部分はピンクで強調される。次に、ダイアログ タブでシグナル BLOB のサイズを定義する、オポレの投影ウィンドウで blob を検索します。シグマと最小ピーク値を定義します。次に、計算を押して、緑色のブロブとして表示されるアクトミオシン信号を識別します。約 100 個のスポットが見つかるまで、異なるパラメーターでこの手順を再試行します。アクトミオシンシグナルを同定することは重要なステップです。信号の品質と検出された BLOB の正しいサイズによって異なります。画像に表示されている緑色のスポットがない場合、次のステップは機能しません。楕円体をデザインするには、fit エリプソイドと呼ばれるタブを続けます。ランダムサンプルを 10,000、外側/内側のカットオフ距離を 1 ~ 10 に設定し、[計算] をクリックします。この後、投影と呼ばれるタブが自動的に開き、サーフェス抽出の定義が可能になります。投影タブで、希望の楕円体の幅として最小投影距離と最大投影距離を設定します。ピンクの定義された楕円体領域が卵室の外側の層全体を含むので、最小および最大の投影距離が収まる必要があります。次に、スライスの距離を 1 として定義します。卵の部屋で定義された楕円体のピンク色の領域が計算を押す前に見えるようにしてください。これは、新しい楕円体フィットの品質を評価するのに役立ちます。次に、楕円体の出力幅を 800 以上、高さが 400 以上に設定します。次に、サーフェス抽出の継続時間を設定し、球状または円筒状の投影法のいずれかを選択します。必要に応じて、Z を反転して Y.Press 計算を調整し、イメージと呼ばれる新しいウィンドウで両方のチャネルのサーフェス抽出を取得します。画像をクリックし、[調整]に進み、[明るさ/コントラスト]を選択して、得られた画像ウィンドウの明るさとコントラストを調整して、投影されたアキトミオシン信号を確認できます。サーフェスの抽出が良好な場合は、両方のチャネルを TIFF ファイルとして別々に保存します。さらに、この特定の卵室の表面がどのように抽出されたかについて、将来の参照のためにログウィンドウファイルを保存します。次に、フィジーで優先カラー コードを使用してチャネルをマージし、結果を TIFF ファイルとして保存します。このプロトコルは、上皮組織におけるアクトミオシンネットワークの挙動を調査することを可能にする。これは、局所細胞スケールでのアクトミオシン挙動の詳細な分析が組織スケールで同様の分析と組み合わされた場合にのみ可能である。ここに示されているのは、局所細胞スケールおよび対照および脂肪2変異体ショウジョウバエ卵室のための組織スケールにおける動的ミオシンII挙動の代表的な例である。基底単面では、ミオシンII信号の緑色の調節軽鎖は、コントロール卵室の前後軸に垂直に移動します。この極性は、脂肪2変異卵室で失われ、異方性ミオシンIIパルス、組織レベルでの振動、コントロールサンプル中のミオシンIIの緑色改変調節軽鎖は、上皮回転を促進するために必要な同期力を生成する。対照的に、fat2変異卵室の卵胞上皮は基底側で強く脈拍を起こすので、上皮回転を促進するために必要な同期力を生じに失敗する。ショウジョウバエ卵室の薄い有端領域では、fat2変異体はまた、ミオシンII.の緑色修飾調節軽鎖の変化した動的挙動を提示する。このビデオを見た後、あなたはフィジーを使用してショウジョウバエ卵室の局所および組織スケールでアトミオシンネットワークを分析する方法の良いアイデアを持っているはずです。実用的なヒントとトラブルシューティングについては、プロトコルの後の説明部分を参照してください。フィジーやプラグインに関するご質問は、それぞれのウェブページをご覧いただくか、当社までお問い合わせください。

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JoVE Journal

Developmental Biology

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