Name: アポトーシス反転後新しく形成された乳癌幹細胞様細胞の流れフローサイトメトリー法による検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: 学ぶ乳がん細胞のアポトーシス反転後の幹細胞様細胞への遷移を、蛍光活性化細胞分選法とフローサイトメトリーで検出する手法。この技術はがん再発メカニズムの解明に貢献します。

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この作品は、革新的な技術基金の革新技術委員会によって支えられた: 状態キー研究所の Agrobiotechnology (香港中文大学)、Lo Kwee 成医学研究基金とリー Hysan 基礎からの資金調達サポート。情報は、香港中文大学の大学院学生の身分によって支えられました。

1. 乳房非幹細胞の作製
<ol><li>文化 MCF-7、フェノールレッド フリー 10% 熱不活化の牛胎児血清 (FBS) 100 mm ディッシュとロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 1640 培の 10 mL の MDA MB 231 セル。文化 T47D フェノールレッド フリー 2 mm L グルタミン RPMI 1640 培の 10 mL で、10% 熱非動化 FBS、および 1 %v/v ペニシリン-ストレプトマイシン (PS) 100 mm ディッシュ。5% CO295% 空気細胞文化のインキュベーターで 37 ° C で培養細胞。 注:フェノール レッド蛍光ベースの検出に影響を与えますが、そのエストロゲンのような効果31による乳癌細胞の成長の潜在的な影響を及ぼしています。たとえば、フェノールレッドはプロゲステロン受容体と MCF 7 セル31の成長を刺激できます。それがまた31T47D 細胞の成長を刺激します。</li>
	<li>リン酸 2 mL ではセルを洗浄緩衝生理食塩水 (PBS) 2 回。MCF 7 と MDA MB 231 または 0.25% トリプシン-EDTA T47D 細胞に 2 mL に 0.05% トリプシン-EDTA の 2 mL を追加します。 注:トリプシン-EDTA の濃度に必要なさまざまな乳房のがん細胞の種類の中で細胞の分離が異なる不適切な濃度 CD44 と CD2432などいくつかの細胞の表面のマーカーの表現パターンに影響を与える可能性があります。</li>
	<li>5% CO295% 空気雰囲気下で 37 ° C で 5 分間料理を文化します。トリプシン-EDTA によって過剰消化から細胞を防ぐために、顕微鏡下で細胞の剥離を頻繁にチェックします。</li>
	<li>90% 以上のセルをデタッチ、皿に完成した RPMI 培地 5 mL を追加し、細胞層表面に数回それをピペットします。</li>
	<li>15 mL の円錐管と 5 分間遠心する 300 × g 4 ° C のセルに転送します。 注:通常、約 6 x 10 の6セルは、密度が 70% に達すると、100 mm ディッシュから取得できます。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、1.5 mL 遠心チューブに FACS バッファー (0.5 %bsa と 0.1% アジ化ナトリウムを含む PBS) の 10 の6セル/100 μ L でペレットを再懸濁します。</li>
	<li>いくつかの管に、セルを分割します。Mcf-7 細胞の分割セル 4 管: 2 つのアイソタイプ コントロール、CD24 陽性対照との二重染色染色 CD24 の単一の 1 つ。</li>
	<li>3 チューブ T47D 細胞の分割セル: 2 つのアイソタイプ コントロールとデュアルの汚損のための 1 つ。</li>
	<li>MDA MB 231 セルの分割セル 4 管: 2 つのアイソタイプ コントロール、CD44 陽性対照との二重染色染色 CD44 の単一の 1 つ。</li>
	<li>遠心 300 x gと 4 ° C、5 分で再びチューブ、上澄みを廃棄し、Fc ブロック希釈 1:50 FACS バッファーに追加します。</li>
	<li>300 × gで遠心分離前に暗闇の中で 20 分間氷の上のサンプルをインキュベートし、4 ° C、5 分は上澄みを廃棄します。</li>
	<li>蛍光色素標識されたモノクローナル抗体人間 CD44 を追加 (PerCP Cy5.5) と CD24 (PE) デュアルで (FACS バッファー) で 1:40 と 1:10 の希釈液で染色グループ。ポジティブ コントロール、CD44 を追加 (PerCP Cy5.5) MDA MB 231 と同じ濃度で mcf-7 細胞をそれぞれ CD24 (PE) を追加。 注:CD44 と C24 の組み合わせは、乳房 CSC 研究26,27,28,29,30で一般的に使用されています。</li>
	<li>アイソタイプ コントロール グループの追加、PerCP Cy5.5 マウス IgG2b、κ、1:40 で CD44 抗体と PE マウス igg2a 産、κ、1:10 でのアイソタイプ コントロールとして希釈希釈 106セル/100 μ L で CD24 抗体アイソタイプ コントロールとして。 注:興味の抗体アイソタイプ コントロールは、マイナス コントロール33として推奨されます。</li>
	<li>4 ° c で 30 分間遠心分離機 300 × g暗闇の中で (1.12、1.13 の手順) からサンプルをインキュベートし、4 ° C、5 分は上澄みを廃棄します。</li>
	<li>500 μ L の PBS と 5 分間遠心する 300 × g 4 ° C で 2 回ペレットを洗浄します。</li>
	<li>蛍光活性化セルソーターを実行する前に、0.5 mL の PBS と 40 μ m のナイロン メッシュをフィルターにペレットを再懸濁します。</li>
	<li>ゲーティングと補償のために PE 共役アンチ CD24 抗体で mcf-7 細胞を染色し、ポジティブ コントロールとして PerCP Cy5.5 共役抗 CD44 抗体と MDA MB 231 細胞を染色します。アイソタイプ コントロール (図 1) のネガティブ コントロールとして染色細胞を使用します。</li>
	<li>CD44 細胞を収集-/CD24+コレクション培地 (フェノールレッド フリー RPMI 1640 培 20% 熱不活化 FBS と 2 %v/v PS) 1 mL を含む丸底ポリスチレン 12 × 75 mm 管のマーカー。5 分のgと RT × 300 でチューブを遠心し、上澄みを廃棄します。 注:乳癌細胞に CSC のようなセルは、CD44 として定義されている+/CD24-細胞26,27,28,29,30と胸以外の幹細胞CD44 として定義された-/CD24+細胞18 (図 1)。</li>
	<li>さらに 5% CO2細胞文化のインキュベーターで 37 ° C で文化の新鮮なコレクション媒体を含んでいる培養皿で非幹、並べ替えられた乳癌細胞をプレートします。</li>
</ol>2. アポトーシス誘導と検出
<ol><li>1 mM スタウロスポリン12,34 DMSO を準備します。MCF 7 群、MCF 7 細胞 15 mL の円錐管に 10 mL の最終巻 (2.5 μ M スタウロスポリン) までの完成品の中に 1 mM スタウロスポリンの 25 μ L を追加します。コンテンツを均等にミックスするピペット。</li>
	<li>細胞から培養液を削除、2 ml の PBS のセルを一度洗います。Mcf-7 細胞細胞密度に達すると 70% の confluency にアポトーシスを誘導するために 6 時間に 2.5 μ M スタウロスポリンと媒体の 10 mL を加えます。</li>
	<li>1 mM パクリタ キセル35,36 DMSO を準備します。T47D 群、15 mL の円錐管に 10 mL (パクリタ キセル 5 μ M) の最終的なボリュームに T47D 細胞の完成品の中に 1 mM パクリタ キセルの 12.5 μ L を追加します。コンテンツを均等にミックスするピペット。</li>
	<li>細胞から培養培地を外し、2 ml の PBS のセルを一度洗います。細胞密度に達すると 70% の confluency にアポトーシスを誘導するために 10 h の T47D 細胞に 5 μ M のパクリタ キセルで培地 10 mL を加えます。 注:新しい細胞ラインが最初に使用されるときに誘導時間とアポトーシスを誘導する誘導物質の濃度を最適化する必要があります。</li>
	<li>MCF 7 の溶媒投与群、15 mL の円錐管に 10 mL (すなわち、0.25 %v/v DMSO) の最終巻に mcf-7 細胞の完成品の中に 25 μ L の滅菌ジメチルスルホキシド (DMSO) を追加します。コンテンツを均等にミックスするピペット。</li>
	<li>溶剤処理した mcf-7 細胞から培養液を削除、2 mL の PBS で 1 回洗浄します。STS の溶剤コントロールとして 6 時間 v/v 0.25 %dmso と媒体の 10 mL を加えます。</li>
	<li>T47D の溶媒投与群、滅菌 DMSO の 5 μ L を 15 mL の円錐管に 10 mL の最終巻 (すなわち、0.05 %v/v DMSO) に T47D 細胞の完成品の中に追加します。コンテンツを均等にミックスするピペット。</li>
	<li>2 mL の PBS で 1 回洗浄、溶剤処理 T47D 細胞から培養液を削除します。パクリタ キセルの溶剤コントロールとして 10 h の v/v 0.05 %dmso と媒体の 10 mL を追加します。</li>
	<li>扱われた細胞の形態変化を観察し、50 で細胞を染色する nM Mitotracker 赤 CMXRos と 250 ng/mL ヘキスト 33342、5% CO295% 空気雰囲気下で 37 ° C で別の 20 分間インキュベートし、。共焦点レーザー走査型顕微鏡 (図 2) x 60 の下で典型的なアポトーシス細胞の形態を観察します。 注:セルの縮小、ブレブ膜、ミトコンドリア断片化核凝縮などの典型的なアポトーシスの形態がそのまま細胞膜12,13,14,15 ,,1837。</li>
</ol>3. アポトーシス細胞とアポトーシスの反転手順の分離
<ol><li>アポトーシス誘導剤と溶剤-処理 MCF 7 または 5% CO295% 空気雰囲気下で 37 ° C で 30 分間暗闇の中で 10 の6/mL の濃度で 3 μ M のカスパーゼ 3/7 グリーン検出色素 T47D 細胞を染色します。</li>
	<li>40 μ m のナイロン メッシュからのセルを並べ替えの並べ替えを実行する前にフィルターします。</li>
	<li>目的をゲートの最初主要な人口 (R1) をゲートし、前方散乱、側方散乱 (図 3) とドットのグラフをプロットすることによって破片を除外します。</li>
	<li>ネガティブ コントロールとしてカスパーゼ 3/7 グリーン検出色素を追加せず負の領域 (R2) をゲートに未処理細胞を使用 (図 3 a)。</li>
	<li>肯定的な地域 (R3) をゲートにセル スタウロスポリン12,18,34 24 h と扱われ、肯定的な制御として染料で染色を使用 (図 3 b)。</li>
	<li>(同じ 1.18 の手順でコレクション媒体として) (図 3C-3D) コレクションの中の 1 mL を含む丸底ポリスチレン 12 × 75 mm 管の誘導治療グループから陽性細胞 (R3) を収集します。5 分のgと RT × 300 でチューブを遠心し、上澄みを廃棄します。</li>
	<li>ステップ 3.6 (図 3E-3F) のようにコレクションの中の 1 ml 丸底ポリスチレン 12 × 75 mm 管の溶剤処理グループから否定的な細胞 (R2) を収集します。 注:(10,000 細胞) などのごく一部を収集し、アクティブなカスパーゼ マーカーのパターンをチェックする選別機で再実行できます。カスパーゼ負領域で並べ替えられた溶剤処理細胞の 90% を表示する以上またはカスパーゼ正領域で並べ替えられたインデューサ処理細胞の 90% を表示する以上、これらの集められたセルは比較的純粋な (図 3 C-3F) と考えられています。並べ替えの地域および/またはソーターをリセットする必要があります。</li>
	<li>新鮮なコレクション中で並べ替えられた細胞を再懸濁し、アポトーシス逆転で 7 日間 5% CO295% 空気雰囲気下で 37 ° C で 12 も組織培養プレート文化でそれらを播きます。</li>
</ol>4. カスパーゼ活性化細胞におけるアポトーシスの確認
<ol><li>ミックス 10 mM HEPES、140 mM の NaCl と 2.5 mM CaCl2アネキシン結合バッファー (pH 7.4) を準備します。4 ° C でバッファーを保存し、光に公開するバッファーを避けてください。</li>
	<li>アネキシン結合バッファーの 45 μ L で PI 原液 1 mg/mL の 5 μ L に希釈して propidium ヨウ化 (PI) の 100 μ g/mL 作業ソリューションを準備します。4 ° C でソリューションを格納し、光に公開するソリューションを避けてください。 注:PI は、潜在的な変異原物質を注意して処理する必要があります。</li>
	<li>手順 2.1 から 2.5 のようにインデューサ処理細胞を準備します。</li>
	<li>セルをデタッチするのには 3-5 x 細胞層に媒体をピペッティングによるインデューサ扱わ MCF 7 T47D 細胞を収集します。15 mL の円錐管にセルを転送します。</li>
	<li>5 分破棄上清のgと RT x 300 の遠心分離機します。</li>
	<li>1.5 mL 遠心チューブに 10 の6/mL の濃度で完成した培地で細胞を再懸濁します、37 ° C で 30 分間暗闇の中で 3 μ M カスパーゼ 3/7 グリーン検出色素で細胞を染色</li>
	<li>Gと RT x 300 5 分破棄培養上清の遠心分離機します。</li>
	<li>1 ml の氷冷 PBS の 300 × gで遠心する細胞を洗浄し、4 ° C、5 分は、培養上清を捨てます。</li>
	<li>アネキシン V 共役の追加 5 μ L のアネキシン結合バッファーの 100 μ L に細胞を再懸濁します、1 μ L 100 μ g/mL の細胞懸濁液の各 100 μ L に取り組んで解決策を PI し室温で 15 分間細胞を孵化させなさい。 注:アネキシン V と PI は一般的流れ cytometry38,,3940におけるアポトーシスに一緒に使用されます。</li>
	<li>優しくアネキシン結合バッファー、ミックスの 400 μ L を追加します。流れの cytometer で実行する前に氷のサンプルを保ちます。</li>
</ol>5 フローサイトメトリーによる乳房 CSC のような細胞の測定
<ol><li>0.05% トリプシン - edta 誘導剤や溶剤処理ともに逆 MCF 7 を収穫します。T47D 細胞誘導または溶媒投与群でまたは、手順で 1.2 から 1.5 0.25% トリプシン-EDTA を収穫します。</li>
	<li>人間 CD44 に対する蛍光色素標識されたモノクローナル抗体で細胞を染色 (PerCP Cy5.5) と CD24 (PE) ステップ 1.12 のように。一方、1.13 のステップのようにアイソタイプ コントロールを準備します。</li>
	<li>流れの cytometer でセルを実行し、CD44 細胞の割合を検出+/CD24-マーカー。</li>
</ol>

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このプロトコルでは、乳癌非幹細胞のアポトーシス逆転の結果乳癌 CSC のような細胞への移行を検出するための直接かつ明確な方法について説明します。これらの逆の細胞の CSC プロパティの確認は私n vitro mammosphere 形成アッセイとin vivo異種移植による免疫不全マウス18,24,26 アシストでした。 ,27,42,43,44,45。ここでは、2 つの乳房癌細胞ラインが、他乳房のがん細胞でこのプロトコルをさらに適用できます。この現象は CD44 の数が少...

がん国世界中1の大きな負担の原因と死の主要な原因となっています。乳がんは、がん1のすべてのタイプの間で女性患者の両方の発生率と死亡率の面で高いランクします。がんの多様性により化学療法でがん細胞死2,3、4を達成するために薬の組み合わせを使用する通常は。ただし、9、急速に成長している細胞は、タンパク質合成7,8や微小管ダイナミクス以来、一般的な化学療法薬は、しばしば DNA5,6をターゲットとしながら最も影響を受けるがん幹細胞 (CSC) s など休止期の細胞は、通常影響の少ない10です。CSCs は、したがって、治療、薬剤耐性やがんにつながる後再発10,11のちにも生き残る可能性が高い。したがって、CSCs の除去がん治療の重要な話題となっている、CSCs の起源の研究は必要です。
アポトーシスの逆転現象に関するより多くの研究は、最近 10 年間・12,13,14,15,16,17,18で行われています。,19. この概念の出現する前に広く受け入れられて細胞が不可逆的カスパーゼ活性化後アポトーシスを受けること。カスパーゼはアポトーシス、複雑なアポトーシスの形成と下流の基板20の胸の谷間などの開始と実行の段階で重要な役割を果たすタンパク質酵素の家族です。カスパーゼ 3 やカスパーゼ 7 など死刑執行カスパーゼの活性は、"ノーリターンのポイント「アポトーシス21として考えられています。しかし、研究者は最近観察アポトーシス反転体外の両方に発生し、セルの中に体内の,は、カスパーゼ活性化12,13,14後もアポトーシスから回復できます。,15,16,17,18,19します。 さらに、積極的な機能など元アポトーシス誘導と高い侵襲性に高い抵抗が逆のがんで検出された細胞の15。したがって、それは CSC のような細胞の割合が逆の人口未処理細胞と比較して最終的にアポトーシス逆転18後より悪性の機能に貢献して高くなる提案されました。
以前は、多くの努力がなされたアポトーシス反転体外ともっと重要なは、生体内での追跡にこのプロセス16,17,19の普遍性を確認するのに大きく役立つ。ただし、全身逆セルの結果考察はアポトーシス逆転に本当に影響を受けた細胞の不十分な分離のために欠けています。純粋なアポトーシス細胞を取得し、さらなる研究のためにそれらを回復する必要があります。したがって、我々 は"ノーリターンのポイント「21 apoptosis ためのマーカーとして死刑執行カスパーゼ活性化伝統的に広く受け入れられたマーカーを使用し、蛍光活性化細胞のカスパーゼ活性化細胞染色を区別する (FACS) を並べ替えを利用カスパーゼ-3/7 グリーン検出染付。染料は、短いアミノ酸シーケンスが認識され、アクティブなカスパーゼ 3/7 は切断する DEVD 共有にリンクされます。開裂の細胞質から核 DNA に結合して強い蛍光を発する場所に若しは染料を解放に役立ちます。この手順は、いくつかの細胞が行われていないことアポトーシス一括セル人口を使用して回避できます。
CSCs または腫瘍幹細胞は単一を使って多くの固体腫瘍で確認されている、またはいくつかの表面マーカーとこれらの細胞の非常にいくつかの数字の組み合わせが、免疫不全マウス22,23、形態の腫瘍に十分です 24,25,26,27。CD44 と CD24 の組み合わせは胸 CSC 研究と CD44 の一般的使用されています+/CD24-細胞は胸 CSCs26,27,28,29として定義されています。,30最近、一連のアポトーシス反転と CSCs の提案の関係を確認し、逆の乳房のがん細胞は in vitro および in vivo での増加の腫瘍形成能を得たことを示す実験を行ったが、。CSC マーカー18細胞の高い割合です。私たちが胸 CSCs より生き残る、従って得る豊かアポトーシス反転後重要なは、我々 は非幹細胞と件名を分離するときする可能性を除かないが、もともと非幹アポトーシス反転、CSC に出てくるがん細胞集団、示唆非幹がん細胞はアポトーシス反転中 CSCs の割合の増加に貢献できます。
この記事は、アポトーシス反転後乳癌以外の幹細胞から胸 CSC 様細胞への移行を示すとフローサイトメトリーによるこの転移を検出するために目指しています。乳癌以外の幹細胞は、CD44 を分離することによって準備最初-/CD24+ FACS による癌細胞の乳房します。アポトーシスが誘発し、顕微鏡下での形態学的変化によって確認されました。その後、アポトーシスはカスパーゼ 3/7 グリーン検出色素によって積極的にラベルは FACS により分離、さらにアポトーシスの反転のアポトーシス誘導物質の不在で培養します。逆セル、フローサイトメトリーによる解析のための回復の 7 日後 CSC マーカーとに汚れます。CD44 細胞+/CD24 逆の人口に-マーカーが再表示されますアポトーシス反転中に非幹細胞から CSC 様細胞への移行が発生したことを示唆しています。
アポトーシスの反転は、複数のがんで観察されている正常細胞と同様に細胞培養12,13異なるアポトーシス誘導刺激で治療します。このプロセスは、ショウジョウバエにトレースされている体内の16,17,19のモデルします。本稿で説明するよう、技術を使用して異なった癌疾患モデルと CSCs の起源で癌再発のメカニズムに関する多くの情報を取得できます。

<table><tbody><tr><td>MCF-7</td><td>アメリカンタイプカルチャーコレクション (ATCC)</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>アメリカンタイプカルチャーコレクション (ATCC)</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>T47D</td><td>アメリカンタイプカルチャーコレクション (ATCC)</td><td>HTB-133</td><td></td></tr><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.05% トリプシン-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 アネキシン V コンジュゲート</td><td>Invitrogen</td><td>A35109</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>USB</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 &middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent caspase-3/7 緑色蛍光色素</td><td>Invitrogen</td><td>C10423</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシ</td>ド <td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fc block</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td>熱不活化</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>USB</td><td>16926</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Red CMXRos</td><td>ヒト</td>CD24に対するモノクローナル抗体 <td>M7512</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biosciences</td><td>555428</td><td>PE クローン:ML5 Lot:5049759 RRID:ヒト</td></tr><tr><td>CD44に対するモノクローナル抗体</td>AB_395822 <td>Biosciences</td><td>560531</td><td>PERCP-CY5.5 Clone:G44-26 Lot:7230770 RRID:AB_1727485</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>パクリタキセル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7402</td><td></td></tr><tr><td>PE マウス IgG2a, &kappa;アイソタイプコントロール</td><td>BD Biosciences</td><td>554648</td><td>クローン:G155-178 (RUO) RRID:AB_395491</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, &kappa;アイソタイプコントロール</td><td>BD Biosciences</td><td>558304</td><td>Clone:27-35 RRID:AB_647257</td></tr><tr><td>phosphate buffered saline</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21600010</td><td></td></tr><tr><td>propidium iodide</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 medium</td><td>Invitrogen</td><td>11835055</td><td>phenol red-free</td></tr><tr><td>sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>スタウロスポリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培養皿</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>12 ウェル組織培養プレート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>150628</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー 40 &mu;m ナイロンメッシュ</td><td>BD Biosciences</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>FACSuite software bundle v1.0</td><td>BD Biosciences</td><td>651360</td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse</td><td>BD Biosciences</td><td>651155</td><td></td></tr><tr><td>FluoView FV1000 共焦点顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX81</td><td>60倍対物レンズ</td></tr><tr><td>FV10-ASW ビューアソフトウェア Ver.4.2b</td><td>オリンパス</td><td>丸</td><td></td></tr><tr><td>底ポリスチレン 12&times;75 mm チューブ</td><td>BD Biosciences</td><td>352003</td><td></td></tr><tr><td>S3e ソーター</td><td>Bio-Rad</td><td>1451006</td><td></td></tr></tbody></table>

アポトーシス反転後新しく形成された乳癌幹細胞様細胞の流れフローサイトメトリー法による検出

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

癌の再発は、基になるメカニズムは不明ながら専門医により研究されている長い。最近では、私たちと他の人、というアポトーシス逆転現象がさまざまな刺激の下で様々 な細胞モデルに増加した腫瘍につながることを発見します。In vitro および in vivo; このプロセスのトラッキングに関する以前の研究が注目されています。ただし、真逆の細胞の分離はまだ達成されるべきアポトーシス逆転の影響に関する我々 の理解を制限します。ここでは、我々 を活用カスパーゼ 3/7 グリーン検出色素ラベル カスパーゼ活性化細胞にアポトーシス誘導後。肯定的な信号を細胞が蛍光活性化セル (FACS) を回復の並べ替えによって選別してさらに。共焦点顕微鏡形態学的検査は、FACS 前に、アポトーシスの状態を確認できます。腫瘍の増加がしばしば癌幹細胞 (CSC) の割合の上昇に起因する-セルのように。また、乳がんの多様性を与えられて、これらの CSC のような細胞の起源を識別する重要になるがん治療。したがって、我々 はアポトーシスを誘発、カスパーゼ活性化細胞を分離してアポトーシスの反転手順を実行する前に乳癌以外の幹細胞を準備します。フローサイトメトリー解析では、乳房 CSC のような細胞が乳房 CSC のような細胞がアポトーシス反転中に乳癌以外の幹細胞から通過を示す逆のグループに再表示されることを明らかにします。要約すると、このプロトコルには、フローサイトメトリーによるアポトーシス乳癌細胞の分離と逆セルに CSC 割合の変化の検出が含まれます。

非幹細胞胸 CSC のような細胞、CD44 の最初の並べ替えに乳がんから転移を観察するために-/CD24+乳癌細胞が必要でした。MCF 7 セルラインの貢献してきました約 0.15% 元の人口 (図 1) この手順で CSC マーカーと細胞アポトーシス反転中に CSC 濃縮の可能性を除外します。それどころか、元の人口の CSC マーカーを持つセルがない場合など T47D 細胞 (図 1)、この並べ替えの手順は省略できます。確かに、ゲートは正と負最終的に決定 CSC の割合に影響を与えるそれぞれのマーカーの定義を影響を受けます。したがって、興味の抗体アイソタイプ コントロールを含む適切なコントロール、マーカーごとに 1 つのステンド グラス コントロール必要があります慎重に選択し、ゲート調整 (図 1) のために準備します。
<p class="...

ここでは、蛍光活性化細胞ソーティングによってアポトーシス乳癌細胞を分離し、さらにフローサイトメトリーによるアポトーシス反転後乳癌幹細胞のような細胞非幹乳ガン細胞の転移を検出するためのプロトコルを提案する.

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

アポトーシス逆転細胞の本物の集団の分離は以前は問題となっており、アポトーシス逆転の結果に関する我々の理解を大幅に制限している。このプロトコルは、我々はアポトーシス逆転細胞のより純粋な集団を生成することができます。この技術の主な利点は、使用される材料や機器が広く異なる機関で利用可能であるということです。この技術は、アポトーシスの逆転を受けた細胞の純粋な集団を単離するために容易に適用可能である。既に報告したように、正常細胞はアポトーシス逆転を受けることもでき、乳がん細胞とは別に、異なる化学細胞、ならびに正常細胞を開始することができ、様々なアポトーシス刺激を使用することができる。逆転セルはアポトーシスと高速ソートを経ているので、回復率は通常低いです。より大きな開始細胞数は、最終収率を増加させるために組み換えである。まず、培養MCF-7、MDA-MB-231、開始するには、培養MCF-7、MDA-MB-231、およびT47D細胞をテキストプロトコルに従う。この後、PBSで細胞を2回洗浄し、0.05%のトリプシン-EDTAの0.05%のトリプシン-EDTAをMCF-7に2ミリリットル加え、 MDA-MB-231細胞と、MCF-7、およびMDA-MB-231細胞に、0.25%のトリプシン-EDTAの2ミリリットルおよび0.25%のトリプシン-EDTAの2ミリリットルをT47D細胞に対する。T47D セルにします。5%の炭酸ガス細胞培養インキュベーターで、摂氏37度で5分間培養する。細胞がインキュベートしている間、トリプシン-EDTAによる過剰消化を防ぐために顕微鏡で細胞の剥離を確認してください。細胞の90%以上が剥離したら、完成したRPMI培地を5ミリリットル加え、細胞層表面にピペットを数回加える。次いで、細胞を15ミリリットル円錐形チューブ、および遠心分離機に移す。上清を捨て、1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管にFACSバッファーを入れたペレットを再中断します。次に、細胞をいくつかのチューブに分割します。チューブをもう一度遠心分離し、上清を捨てます。次に、希釈したFcブロックをサンプルに加えます。再び遠心する前に、暗闇の中で氷の上のサンプルを20分間インキュベートします。この後、上清を捨てます。次に、ヒトCD44に対するフルオロクロム共役モノクローナル抗体、およびCD24、ヒトCD44、およびCD24に対して、それぞれ1〜40、および1〜10の希釈液を二重染色群に加える。陽性コントロールには、陽性制御のためにCD44抗体を追加し、MDA-MB-231細胞にCD44抗体を追加し、MCF-7細胞にCD24抗体とCD24抗体をMCF-7細胞に加え、MCF-7細胞に対して1~40個の希釈液をそれぞれ1~10個ずつ加える。PerCP-Cy5.5マウスIgG2bカッパを追加し、追加PerCP-Cy5.5マウスIgG2bカッパ、CD44抗体の同位体制御として細胞に1〜40の比率で希釈。次いで、PEマウスIgG2aカッパを加え、次いで、PEマウスIgG2aカッパを加え、CD24抗体の同位体制御として細胞に対して1〜10の比率で希釈した。暗闇の中で摂氏4度で30分間インキュベートします。次いで、サンプルを300gで遠心し、サンプルを300gで遠心し、摂氏4度で5分間遠心する。上清を捨て、ペレットをPBSの500マイクロリットルで2回洗浄する。次に、前述のように遠心分離を繰り返す。0.5ミリリットルのPBSでペレットを再懸濁し、40マイクロメートルのナイロンメッシュを通して懸濁液を濾過します。次いで、蛍光活性化細胞選別機を介して懸濁液を実行する。CD44陰性の細胞を収集し、1ミリリットルの回収培地を含む丸底管にCD24陽性マーカーを入れた。次いで、チューブを遠心分離し、上清を捨てる。次に、さらに培養用の新鮮な採取培地を含む培養皿に選別した乳房非幹細胞をプレートする。まず、DMSOに1ミリモルスタウロスポリンを使用し、テキストプロトコルに従って培地で2.5マイクロモルススタウロスポリンを調製する。次に、細胞から培地を除去する。2ミリリットルのPBSで細胞を1回洗い、その後、10ミリリットルのスタウロスポリン培地をMSF-7細胞に6時間加え、アポトーシスを誘導し、細胞が70%コンフルエントである場合。次に、DMSOで1ミリモルパクリタキセルを調製する。その後、12.5マイクロリットルを加え、1ミリモルパクリタキセルの12.5マイクロリットルをT47D細胞の完成培地に加え、15ミリリットルの円錐管で10ミリリットルの最終体積を構成します。培養液を細胞から取り出し、2ミリリットルのPBSで細胞を洗浄する。次いで、パクリタキセル培地を10時間細胞に加え、細胞が70%の合流に達したときにアポトーシスを誘導するために10時間アポトーシスを誘導する。この後、溶媒処理MCF-7群から培地を取り出し、2ミリリットルのPBSで洗浄する。次いで、10ミリリットルのDMSO培地を加え、スタウロスポリンの溶媒制御として0.25%DMSO培地の10ミリリットルを6時間加える。溶媒処理T47D基から培地を取り出し、2ミリリットルのPBSで細胞を洗浄する。次いで、10ミリリットルのDMSO培地を加え、10ミリリットルのDMSO培地を10時間、パクリタキセルの溶媒制御として10時間加えた。次に、細胞を染色し、5%の二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で20分間インキュベートします。60倍の共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、処理した細胞の形態変化を観察する。アポトーシス誘導体と溶媒処理MCF-7およびT47D細胞と溶媒処理MCF-7およびT47D細胞の両方を暗闇の中で30分間、摂氏37度で5%の二酸化炭素インキュベーターで染色する。蛍光活性化細胞選別機を用いて、1ミリリットルの回収培地を含む丸底管で誘導体処理群から陽性細胞を採取する。そして、先に述べたようにチューブを遠心分離し、上清を捨てる。1ミリリットルの回収培地を用いたラウンドボトムチューブの溶媒処理群から陰性細胞を採取する。チューブを遠心分離し、上清を捨てます。この後、新しい収集媒体で並べ替えられたセルを再中断します。細胞を12ウェル組織培養プレートに播種し、アポトーシス逆転のために7日間培養します。0.05%トリプシン-EDTAを用いて、逆MCF-7をインデューサーおよび溶媒処理群の両方で収穫する。0.05パーセントトリプシン-EDTAと。次いで、T47D細胞を両方の誘導体で収穫し、その後、0.25%トリプシン-EDTAを有するインデューサーおよび溶媒処理群の両方でT47D細胞を収穫する。ヒトCD44およびCD24に対するフルオロクロム共役モノクローナル抗体で細胞を染色する。細胞が染色されている間、先に示したようにアイソタイプコントロールを準備します。最後に、フローサイトメーター上で細胞を実行し、CD44陽性、およびCD24陰性マーカーを有する細胞の割合を検出する。このプロトコルでは、乳房非幹細胞細胞から乳房CSC様細胞への移行が観察された。非幹細胞癌細胞の単離は、MCF-7細胞で最初に行われた。典型的な形態変化は、アポトーシス誘導体を添加した後に観察され、薬物離脱後に同様の形態を有するアポトーシスから細胞が回収された。空腔活性化細胞は、カスペース活性化のない細胞よりも高い蛍光度に基づいて標識され、選別された。アポトーシス誘導プロセスの間、溶媒は事実手順、または溶媒自体が転移の原因であった可能性を排除するために使用した。アポトーシス誘導体処置群におけるカスペース活性化細胞は、5陽性およびPI陰性のネキシンであることが判明し、それらがアポトーシス細胞であることを示唆した。回収のためにアポトーシス細胞を採取して培養し、溶媒処理群と比較して、フローサイトメトリック解析は、逆の元乳房非幹細胞癌細胞集団中にCD44陽性およびCD24陰性象限に出現する細胞があることを示した。ガリングは、フロー分析と細胞のソートにおいて重要であり、ラボで十分な制御を準備する必要があります。このインビトロアポトーシス逆転手順は純粋なアポトーシス癌細胞を単離するので、生体内腫瘍形成資産などの実験を行い、細胞の実際の逆の結果を理解することができる。この技術は、癌再発の原因に光を当て、したがって、癌患者における再発を潜在的に防止するために調査することができる。バイオセーフ層の規制に従って細胞培養実験を行う際は、必ず適切に保護してください。

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