Name: HIV関連肝病因に対する二重ヒト化TK-NOGマウスモデルの確立 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 s
Description: 学ぶ、ヒト造血幹細胞と肝細胞を用いて免疫系と肝臓の両方を持つ二重ヒト化マウスモデルを確立する方法。HIV関連の免疫病理と肝障害のメカニズムを研究する強力なツールとして活用できます。

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この研究は、国立衛生研究所の助成金R24OD018546(L.Y.P.およびS.G.)によって支援されました。著者らは、外科的処置の助けに対して、アマンダ・ブランチ・ウッズ、B.S.、免疫組織学のためのヤン・チェン、UNMCフローサイトメトリー研究施設メンバーのフィリップ・ヘクスリー、博士、ビクトリア・B・スミス、B.S.、サマンサの助けに感謝したいと思います。ウォール、B.S.、UNMCは、技術サポートのためのジャニスA.テイラー、B.S.、およびジェームズR.Talaska、B.S.の高度な顕微鏡検査コア施設メンバー。著者らは、TK-NOGマウスとヨアヒム・バウムガート博士がトレオスルファンを提供したことを認めている。著者は、原稿への彼女の編集貢献のために、UNMCのエイドリアン・コエスター博士に感謝しています。

このプロトコルは、ネブラスカ大学医療センターの機関動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。
注:動物実験を行う前に、地元のIACUCから承認を得る。
1. 臍帯血の処理とヒトHSPCの分離
<ol><li>層流のキャビネットの無菌条件の下で議定書のすべてのステップを行う。</li>
	<li>ヘパリン化チューブで採取した臍帯血(CB)を採取し、リン酸緩衝生理食生(PBS)を加えて体積を35mLにする。図1に示すように、リンパ球分離培地(LSM)の上にサンプルを重ね、ブレーキなしで4°Cで35分間400xgの層状CBでLSMを遠心分離します。 注:インターフェイスで混合を避けるために、慎重かつ穏やかに血液を希釈します。</li>
	<li>上部LSMとプラズマ層を慎重に取り外し、転送ピペットを使用して白いバフィーコートインターフェイスを新しいチューブに移します。</li>
	<li>冷たいバッファーの30-40 mLでバフィーコートを再中断する(PBS + 0.5% ウシ血清アルブミン [BSA] + 2 mMエチレンディアミンテトラセチン酸[EDTA])。ピペットを使用して、セルサスペンションの20 μLと0.4%トリパンブルーの20 μLと混合物のピペット10 μLをカウントスライドの2つのチャンバーのいずれかの外側の開口部に組み合わせ、細胞をカウントするために自動化されたセルカウンターにスライドを挿入します。 注:セルを実行可能に保つのに役立つため、すべてのステップで氷冷バッファーを使用します。</li>
	<li>4°Cで10分間300xgで細胞を遠心分離し、上清を注意深く吸引する。 次に、300 μLの氷冷バッファーを追加します。</li>
	<li>ヒトFc受容体遮断試薬の100μLおよびモノクローナルマウス抗ヒトCD34抗体共役マイクロビーズを最大1x108細胞に添加する(材料表参照)。4°Cで30分間インキュベートし、細胞を洗浄するために10 mLの冷たいバッファーを加え、遠心分離機を300 x gで4°Cで10分間使用します。 注:1 x 108 個を超えるセルが存在する場合は、セル番号に従ってスケールアップします。</li>
	<li>上清を慎重に取り出し、ペレットを500μLのバッファーで再サスペンドし、磁気分離工程を進め、HSPCを濃縮します。</li>
	<li>磁気活性化セル選別場に正の選択LSカラム(材料表を参照)を配置し、3 mLのバッファで通過します。</li>
	<li>サンプルをヒトCD34+に結合したマイクロビーズをサンプルに取り込み、重力の影響を受けて回収管に流れ込むことができるLSカラムにサンプルをロードします。</li>
	<li>緩衝液でカラム3xを洗浄し、CD34の同じコレクションチューブに溶出物を収集します -細胞の一部。</li>
	<li>5 mL のバッファーでカラムを急降下させ、CD34+セルを新しいコレクションチューブに溶出させます。>90%の純度を達成するために手順を繰り返します。</li>
	<li>血球計でトリパン青色染料を使用して、浸透したCD34+細胞を数えます。カウントした後、CD34+細胞を300 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄する。</li>
	<li>凍結培地中に1-200万/mLの濃度で細胞を移植または凍結保存するために注射用のPBSの25 μLでCD34+細胞を再中断する(ロズウェルパーク記念研究所培地[RPMI 1640培地]+50%胎児牛血清(FBS)+10%ジメチルスルホキシド[DMSO])移植のさらなる使用のため。 注:移植でそれらを使用する前に、常に生存細胞を再計算します。</li>
	<li>CD34+溶出液の純度を確認するには、懸濁液の50 μLを取り、4°Cで30分間PE結合抗ヒトCD34抗体の10 μLでそれをインキュベートします。抗体インキュベーション後、染色した細胞をPBSで洗浄し、100μLのPBSで再定酸化し、次いで、フローサイトメトリーを行う。フローサイトメーターでゲートを設計するために抗体を持たない細胞の追加チューブを追加します。</li>
	<li>取得後、前方散布図(FSC)およびサイドスキャッタ(SSC)プロットの対象領域を選択してデータを分析し、その後、FSC領域およびFSC高さのプロット上の単一セルのゲーティングを行います。PEチャネルおよびSSC領域プロット内の単一細胞上のゲートCD34陽性細胞。</li>
</ol>2. 移植用ヒト肝細胞の調製
<ol><li>液体窒素から凍結保存された肝細胞を取り出し、すぐに水浴中のバイアルを沈め、約90〜120sのために解凍する。</li>
	<li>バイアルキャップを取り外し、解凍した肝細胞を温めた解凍媒体の50 mL円錐管に注ぎます。</li>
	<li>50 mLチューブを数秒間手で揺らして細胞を吊り下します。 注:チューブを渦に入れさらわさわ</li>
	<li>細胞を室温で8分間100xgでペレットする。 0.1%BSAでPBSでペレット化した細胞を洗浄し、80 μL/マウスの最終体積でPBSの新鮮または解凍されたHSPC(比10:1)でプールします。</li>
</ol>3. ヒトHSPCおよび肝細胞移植に対する動物の取り扱い、スクリーニング、ジェノタイピングおよび治療
<ol><li>動物の取り扱い
	<ol>
<li>重度の免疫不全の結果として、品種、家、および無菌条件下でTK-NOGマウスを処理する。</li>
		<li>常にラボコート、手袋、靴カバー、フェイスマスクを着用して、病原性微生物の感染を防ぎます。</li>
		<li>手術には滅菌手袋と器具を使用し、手術を通して動物を無菌的に処理します。</li>
	</ol></li>
	<li>実験用のTK-NOGマウスの選択
	<ol>
<li>オスの非TK-NOGリッターメートで雌のTK-NOGマウスを繁殖させ、ジェノタイピングによりトランスジェニック子孫を選択することにより、TK-NOG株コロニーを維持する。 注:ジェノタイピング(ステップ3.3参照)を実行して、離離時の新生児の雄マウスおよび雌マウスにおけるトランスジーンの有無を決定する。</li>
		<li>HSV-TKトランスジーン発現肝細胞21のGCV媒介枯渇に対する高い感受性による移植のための6〜8週齢の男性を選択する。</li>
		<li>同種確認を容易にするために、引き取りや手術時にマウスに耳タグを付けます。動物の体重と健康状態をメモします。</li>
	</ol></li>
	<li>定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を用いたHSV-TKトランスジーンの存在に対するジェノタイピング
	<ol>
<li>分別時にジェノタイピングを行う(通常、生後3~4週)。ジェノタイピングの場合は、マウスの耳を層流の生物学的安全キャビネットに切り取り、無菌性を維持し、ゲノムDNA分離キットを使用してゲノムDNAを抽出します。</li>
		<li>20μL反応混合物で耳から抽出したゲノムDNAを20μL反応混合物で増幅し、フォワードプライマー5'-CCATGCACGTGTTTCCTTTTGG-3'、1 μLのリバースプライマー5'-TAGTTGCGCGCGCGCGCCC-3'-0μLを加えることで、ヒトアルブミンプロモーターの制御下でHSV-TKトランスジーンのスクリーニングを行う。FAMプローブ5'-FAM-AATCGCGCCCCGC-MGB-3'、およびリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)器械22上のマスターミックスの10 μL。</li>
		<li>リアルタイム PCR 設定を次のように設定します:30 s (プリリードステージ)、95 °C (ホールドステージ)、15 s の場合は 95 °C、1 分間 60 °C の 40 サイクル (PCR ステージ)、30 s (ポストリードステージ) の 60 °C を設定します。 注:22未満の閾値(Ct)のサイクルは、HSV-TKトランスジーンに対して陽性と見なされる。</li>
	</ol></li>
	<li>ガンシクロビルとトレオスルファンを用いての治療
	<ol>
<li>27G針を使用して、TK-NOGマウスに対して、手術前の生理食べ物の100μLで1日2xの食前GCV注射(6mg/kg)を1日2倍注射し、マウスのトランスジェニック・マレンキマル細胞を枯渇させる(図2の実験戦略に示すように)23.</li>
		<li>手術前の3日目、2日目、および1日目に、27G針を用いて100μLの生理食食のトレオスルファン(1.5g/kg/日)の非骨髄切除性食後用量を有するマウスを予言した。</li>
		<li>手術の1日前に、5mmランセットで刺すことによって下顎静脈から血液の2〜3滴(〜100μL)を引き出し、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)のアサイザーについて遠心分離(1,500 x g、4°Cで10分間)で血清を分離し、デグラーを評価する肝臓の損傷のee。</li>
	</ol></li>
	<li>手術の準備
	<ol>
<li>切開部位(腹膜壁の左側)を取り囲むマウスの毛皮を手術前に剃るためにバリカンを使用してください。</li>
		<li>酸素の流れを1 L/min に調整し、マウス麻酔機を使用して誘導室でイソファランの流れを3%~5%に調整します。麻酔用の誘導室にマウスを1匹ずつ置きます。</li>
		<li>滅菌延長管の一方の端(サスペンションの保持容量550 μL、仕様については材料表を参照)を30G針に取り付け、もう一方の端を1mLシリンジに取り付けます。</li>
		<li>スポイリングスをプールされたHEPとHSPC(セクション2参照)の懸濁液(80 μL/マウス)で充填し、繰り返し分配ピペットのノッチにシリンジをフィットさせ、ディスペンサーを調整して各プレスで10μLを分配します。</li>
		<li>マウスが麻酔を受けたら(通常3~4分後)、イソファランの流れをノーズコーンに切り替え、イソファランの流量を2%~3%に減らす。</li>
	</ol></li>
	<li>マウスにおけるヒトHSPCおよび肝細胞の脾臓移植
	<ol>
<li>無菌条件下で層流キャビネット内のすべての手術ステップを実行します。</li>
		<li>作業面の上にきれいな無菌ドレープを置き、切開を行う前に、10%のポビドンヨウ素に続いて70%のイソプロピルアルコールで各マウスの体の左側をスクラブします。</li>
		<li>胸壁の左側の皮膚、筋肉、胸膜に小さな切開(長さ~1.5cm、深さ5mm)を、バンナ型はさみで、肋骨ケージの下端から約5mm下の胸膜腔に入る。</li>
		<li>脾臓を見つけ、操作領域に鉗子でわずかに引っ張り、30Gの針を脾臓の下の極に挿入します。</li>
		<li>分配ピペットのプランジャーのロックを解除し、脾臓あたり60-80 μLの制限で、一度に10 μLの体積を分配します。針をゆっくりと引き込み、ライゲーション・プリジャーを使用して、ライゲーション・プリジャーを使用して、ライゲーション・クリップで脾臓をクリップします。</li>
		<li>脾臓を体腔に押し戻し、無菌のPBSで濡らした綿の先端のアプリケーターを使用します。</li>
		<li>吸収性縫合中断縫合パターン(連続ではない)を使用して腹壁の筋肉層を閉じる。非吸収性縫合糸を使用して中断された縫合パターンで皮膚閉鎖を達成する。</li>
		<li>手術後の低体温からマウスを保護するために、温水循環パッドを使用してください。</li>
		<li>手術後10~14日後に非吸収性縫合糸を取り除く。</li>
	</ol></li>
	<li>術後ケア
	<ol>
<li>移植された動物が目覚めるとき、鎮痛薬ブプレノルフィン(0.1mg/kg)を食後3日間連続して1日2倍に注入する。</li>
		<li>彼らは正常な物理的な状態に戻るまで、少なくとも1日1回動物を観察してください。 注:一部のマウスは体重の後部手術を失う可能性があるため、各動物の体重を確認してください。マウスは通常、1~2週間で元の体重を取り戻す。</li>
	</ol></li>
</ol>4. ELISAによるヒト肝臓の移植検証とフローサイトメトリーによるヒト免疫系
注:ヒト肝臓と免疫系の再構成を毎月評価し、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)とフローサイトメトリーによる移植後1ヶ月をそれぞれ開始する。
<ol><li>EDTAチューブのランセットを用いて下顎静脈から血液サンプルを採取し、4°Cで10分間1,500xgの遠心分離機を採取する。ヒトアルブミンレベルをチェックする血清を分離し、ヒト肝細胞移植に対するマウス肝臓の生着効率を評価し、ヒトアルブミンELISA定量セット(材料の表を参照)を用いて、製造業者の従い方を行う。指示。 注:ペレットを捨てて、フローサイトメトリー分析のためにペレット化された細胞を使用して、ヒト免疫系の再構成を評価しないでください。</li>
	<li>FACSバッファーの35 μL(PBS + 2%FBS)で血清を含まない細胞ペレットを再定重し、マウス特異的CD45(濃度0.5mg/mL)、ヒト特異的抗体CD45(0.1mg/mL)、CD3(0.2mg/mL)、CD8(0.1mg/mL)、CD8(0.1mg/mL)、5μLのマウス特異的CD45(濃度0.5mg/mL)で染色と、CD4(0.25mg/mL)及びCD14(0.25mg/mL)の20μLを4°Cで30分間それぞれ、CD34+HSPCからの機能性免疫系の発達を確認した。 注:染色されていない細胞のチューブを1つ追加して、染色された細胞のゲーティングを決定することを検討してください。</li>
	<li>インキュベーション後、染色された懸濁液(~100μL)をポリスチレン丸底流れサイトメトリーチューブに移し、蒸留水の9部で10x分解バッファーの1部を希釈し、10をインキュベートして2mLの1x分解バッファーを使用する(材料の表を参照)。赤血球をリゼする15分 注:赤血球リシスを評価するために濁りを観察します。サンプルが明確になると、リシスが完了します。</li>
	<li>リシス後、チューブ内のFACSバッファーの3 mLを追加し、ペレットを得るために5分間4°Cで300 x gで遠心分離機を追加します。ペレットと遠心分離機に3mLのFACSバッファーを3mL加えて4°Cで5分間洗浄を繰り返します。</li>
	<li>作りたての1%パラホルムアルデヒド(PFA)で細胞を固定し、フローサイトメーター上の染色細胞を取得し、フローソフトウェアで分析します。</li>
	<li>分析のために、FSC/SSCプロット上のゲーティングを選択し、続いてFSC領域/FSC高さに単細胞ゲーティングを行います。</li>
	<li>また、単細胞集団上のヒト特異的CD45(hCD45)に対するゲートは、マウス由来の細胞を排除するためのマウス特異的CD45(mCD45)を含む。染色されていない細胞のゲーティングに基づいて染色された集団のゲーティングを戦略化する。</li>
	<li>ゲートhCD45+細胞は、CD3+T細胞およびCD19+B細胞の周波数を決定する。ゲート T セルを使用して、CD4 および CD8 サブセットを決定します。単球を評価するには、hCD45上のゲートでCD14+単球を決定する。</li>
</ol>5. TK-NOGマウスのHIV感染とヒト肝臓および免疫系への影響
<ol><li>HIV-1ウイルスおよびすべての感染マウスを指定されたバイオセーフティレベル2施設で処理します。 注意:オートクレーブと二重バイオハザードバッグにすべてのHIV感染廃棄物を廃棄します。安全上の理由から、HIV感染マウスを手渡す間、切り傷に強い手袋を着用してください。</li>
	<li>使い捨てカバーオールガウン、靴カバー、フェイスマスク、ダブルグローブを含むパーソナルプロテクション機器(PPE)を常に着用してください。</li>
	<li>ヒトCD45+細胞の15%以上(ステップ4.7で試験)とHIV-1感染のための血清中にヒトアルブミンの存在を有するマウスを選択する(ステップ4.1でテスト)。</li>
	<li>マウスに1 x 103 x 1 x 104組織培養感染用量50(TCID50)HIV-1ADAをマウス当たり100~200μLの体積で注射する。</li>
	<li>イソファラン(イソファラン蒸気濃度>5%)を用いて感染後5週間をHIV感染マウスに安楽死させる。</li>
	<li>マウスを安楽死させた後、血清の単離のための心臓穿刺によってEDTAチューブに血液を採取し、ELISA(ステップ4.1参照)と血液細胞によるヒト特異的アルブミンレベルを評価して肝臓に対するHIV-1の効果を確認し、ヒト免疫の変化をチェックする。フローサイトメトリーを使用する細胞(手順4.2~4.8を参照)。 注:バイオアナリサータで感染後5週間の末梢ウイルス負荷を評価し、マウスが感染しているかどうかを確認する。</li>
	<li>血液を採取した後、安楽死マウスから肝臓を取り除く。</li>
	<li>肝臓切除の場合は、キシフォイドから皮膚、筋肉、腹膜に長さ1.5~2cm、深さ0.5cmの切開を行い、腹腔を露出させる。肝臓と横隔膜の間の脊椎に垂直なカットを行います。肝臓を持ち上げ、胃や腸に付着する膜を切断します。</li>
	<li>肝臓を一晩4%パラホルムアルデヒドで回収して固定し、標準的な免疫組織化学プロトコルに従って、ヒト特異的CK18抗体8を用いてCK18+肝細胞に対するHIVの効果を評価する。</li>
</ol>

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</ol>

著者は何も開示していない。

肝臓は、HIV感染患者24で侵害され、損傷を受けている。HIV-1の存在下でヒト肝疾患を研究するための実験的な小動物モデルは、CD34 +HSPCおよび肝細胞7、12を有するいくつかの共移植動物モデルの利用可能性にもかかわらず、極めて限られている。 25.インビトロ実験では、肝細胞は低レベルのHIV-1感染26を有することが示されている。両方のタイプのヒト細胞を運ぶヒト化マウスは、望ましいモデルである。ヒト免疫系のみで再構成されたマウスの肝臓は、ヒト調節T細胞20,27の実験的枯渇下下でHIV感染の影響を受けることが示されている。しかし、マウスとヒト肝細胞の免疫および機能特性の違いは、HIV-1および免疫細胞に対する応答...

抗レトロウイルス療法の出現以来、HIV-1単感染に関連する死亡が大幅に減少している。しかし、肝疾患はHIV感染患者1,2の罹患率の一般的な原因として現れた。HIV-1感染を伴う肝炎ウイルスの共感染はより一般的であり、米国ではHIV感染者の10%~30%を占める3、4、5を占めている。
HIV-1および肝炎ウイルスの宿主特異性は、ヒト特異的感染症を研究したり、HIV-1関連肝病因の複数の側面を調査するために、小動物モデルの有用性を制限する。ヒト細胞および/または組織の生着を可能にする免疫不欠性マウス(ヒト化マウスモデルと呼ばれています)は、前臨床試験6、7、8の許容可能な動物モデルである。2000年代初頭にヒト化マウスが導入されて以来、胆嚢突起ヒト肝毒性、HIV-1およびHIV関連神経認知障害を含むヒト特異的病原体、エプスタインバーウイルス、肝炎、および他の複数の前臨床研究感染症は、これらのマウス6、9、10、11で調査されている。CD34+HSPCおよび/またはヒト肝細胞移植のための複数のマウスモデルは、長い間開発され、B型肝炎ウイルス(HBV)関連肝疾患12の疾患病因を研究するために時間をかけて改善されてきた、13歳,14.HSPCおよびヒト肝細胞(HEP)移植のためのいくつかのモデルは、NOG(NOD)として知られている株に基づいている。Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13, NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15、 バルブ/C-ラグ2-/- γ-/- γ -/- (Rag2 tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flg tm1.1Flv/J)12、および fah-/- NOD ラグ1-/--il2rγヌルマウス16.ただし、各モデルには独自の長所と制限があります。例えば、BALb/C-Rag2上のHEPおよびヒト幹細胞(HSC)のAFC8二重ヒト化マウスは、免疫細胞およびHSCの正常な生着を可能にするが、抗原特異的なT細胞およびB細胞が存在しないこのモデル12での応答 .二重ヒト化マウスの再構成における主な懸念は、最適でない生着、異なる組織をサポートするための適切なモデルの欠如、不一致の状態、免疫拒絶反応、または移植片対宿主病(GVHD)、および技術的な新生児による危険な操作や代謝異常による死亡率の高さなどの困難13.
ヒト化マウスは17年、18年、19年のHIV研究に長年使用されてきたが、HIV-1による肝臓損傷を研究するヒト化マウスの使用は20件に制限されている。我々は以前に、二重ヒト化TK-NOGマウスモデルの確立とHIV関連肝疾患8におけるその応用を報告した。このモデルは、肝臓および免疫細胞の堅牢な生着を示し、HIV感染病因を要約する。この議論は、ヒト肝細胞移植における最も重要なステップを含む詳細なプロトコルを提示する。HEPの移植に成功するために必要なHSPCの説明とTK-NOGマウスにおける機能性免疫系の確立についても説明する。これらのマウスをHIV関連肝免疫病因の研究に用いることは詳細である。肝臓特異的ヘルペス単純ヘルペスウイルス1チミジンキナーゼ(HSV-TK)トランスジーンを担持するTK-NOG雄マウスが用いられる。このトランスジーンを発現するマウス肝細胞は、GCVの非毒性用量への短時間暴露後に容易にアブレートすることができる。移植されたヒト肝細胞は、外因性薬物なしでマウス肝臓内で安定に維持される21.マウスはまた、ヒト細胞8のマウス骨髄にニッチを作成するために、トレオスルファンの非骨髄切除用量で予め定められている。免疫不全のTK-NOGマウスは、HEPおよび多能性HSPCを神経中注射する。その後、マウスは、血液免疫の入力と血清ヒトアルブミンレベルの測定によって、血液および肝臓の再構成について定期的にモニタリングされる。ヒト免疫細胞とHEPの両方に対して15%以上の再構成に成功したマウスは、HIV-1を食前食内注射する。肝臓に対するHIVの効果は、早ければ4~5週間の感染後に評価することができる。HIV-1が使用されているので、ウイルスを処理し、マウスに注入する際に必要なすべての予防措置を取る必要があります。

<table><tbody><tr><td>27 G1/2 "針</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>30 G1/2 "針</td>BD<td>バイオサイエンス305106</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mLポリスチレン&nbsp;丸底チューブ12 mm x 75 mmスタイル</td><td>コーニング</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 mLツベルクリンシリンジ針なし</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSアレイバイオアナライザー&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>溶出したCD34+細胞の純度チェック&nbsp;</td></tr><tr><td>BD FACSアレイソフトウェア</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>ソフトウェア FACSアレイ上のCD34+細胞を分析するためのソフトウェア</td></tr><tr><td>BD FACS溶解液</td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td>赤血球を溶解するために</td></tr><tr><td>BD LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>フローサイトメトリーサンプルの取得のための機器</td></tr><tr><td>BD&nbsp;Vacutainerプラスチック採血チューブ</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>BD 367874</td><td>臍帯血</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミンを採取する&nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A9576</td><td></td></tr><tr><td>ブプレノルフィン</td><td></td><td></td><td>規制物質および鎮痛剤</td></tr><tr><td>CD14-PE</td><td>BD バイオサイエンス 555398</td><td></td><td>ヒト</td></tr><tr><td>CD19-BV605</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>562653</td><td>ヒト</td></tr><tr><td>CD34 MicroBead Kit, ヒト</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-046-702</td><td>アイソレーション用 &nbsp;&nbsp;CD34+ HSPC</td></tr><tr><td>CD34-PE, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-081-002</td><td>溶出CD34+細胞の純度チェックに使用した抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>CD3-AF700</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>557943</td><td>ヒトに特異的</td></tr><tr><td>CD45-PerCPCy5.5</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>564105</td><td>ヒト</td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>555349</td><td>ヒトに特異的</td></tr><tr><td>CD8-BV421</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>562428ヒト</td><td>特異的</td></tr><tr><td>細胞計数スライド</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1450015</td><td></td></tr><tr><td>ChargeSwitch gDNAミニティッシュキット</td><td>イヤーピースからゲノムDNAを抽出するための</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>CS11204</td></tr><tr><td>Cobas Amplicor system v1.5&nbsp;</td><td>ウイルス量を測定する</td><td>ためのロシュ分子診断</td><td></td>バイオアナライザー</tr><tr><td>コットンチップアプリケーター&nbsp;</td><td>&nbsp;McKesson</td><td>24-106-2S</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeratin-18 (CK18)</td><td>DAKO</td><td>M7010</td><td>ヒト</td></tr><tr><td>DMSO (ジメチルスルホキシド)</td>に特異的 <td>Sigma-aldrich</td><td>D2650-5X5ML</td><td></td></tr><tr><td>エクステンションセット マイクロボアスライドクランプ 固定オス ルアーロック。L:60 in L:152 cm PV:0.55 mL Fluid Path Sterile</td><td>BD biosciences</td><td>30914</td><td>分注ピペットに取り付けられ、HSPCおよびHEPサスペジョン</td></tr><tr><td>FACS Divaバージョン6</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>フローサイトメーターソフトウェアが必要&nbsp; サンプル牛</td></tr><tr><td>胎児血清(FBS)</td><td>Gibco</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>FLOWJO分析ソフトウェア v10.2</td><td>FLOWJO、 </td><td></td> LLC <td>フローサイトメトリー解析ソフト</td></tr><tr><td>Ganciclovir</td><td>APP Pharmaceuticals, Inc.</td><td>315110</td><td>Prescripition drug</td></tr><tr><td>Greiner MiniCollect EDTA Tubes</td><td>Greiner bio-one</td><td>450475</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocytes thawing medium&nbsp;</td><td>トライアングル・リサーチ・ラボ&nbsp;</td><td>MCHT50</td><td></td></tr><tr><td>Horizon オープン ライゲーション クリップ アプライヤー</td><td>テレフレックス</td><td>537061</td><td>ライゲーション クリップを保持するため</td></tr><tr><td>Hospira Sterile Water for Injection ACE</td><td>Surgical Supply co., Inc.</td><td>001-1187</td><td>ブプレノルフィン(鎮痛剤)の希釈用ヒト</td></tr><tr><td>アルブミンELISA定量セット</td><td>Bethyl laboratories</td><td>E80-129</td><td>マウス血清中のヒトアルブミンレベルを評価するため</td></tr><tr><td>ヒト肝細胞</td><td>トライアングル研究所&nbsp;</td><td>ハップ1</td><td>&nbsp;凍結保存されたヒト肝細胞、誘導適格&nbsp;</td></tr><tr><td>アイリスハサミ、ストレート</td><td>テッドペラ株式会社</td><td>13295</td><td></td></tr><tr><td>ランセット</td><td>メディポイント</td><td>ゴールデンロッド 5 mm</td><td></td></tr><tr><td>LS カラム&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>CD34+マイクロビーズ(ポジティブセレクション)を捕捉するために使用されますリンパ</td></tr><tr><td>球分離培地(LSM)</td><td>MP Biomedicals</td><td>50494</td><td>アイソレーション用&nbsp;&nbsp;末梢血MACS</td></tr><tr><td>マルチスタンド</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>からリンパ球は、Qudro MACSセパレータとLS列を保持し</td></tr><tr>ています<td>マクファーソン·ヴァンナスマイクロ解剖スプリングはさみ</td><td>ロボズ外科用器具株式会社</td><td>RS-5605</td><td>脾臓を露出させるために皮膚を切開するために使用される</td></tr><tr><td>マイクロ解剖鉗子</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5157&nbsp;</td><td>腹腔から脾臓を保持して引き出す</td></tr><tr><td>マウス CD45-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>553080</td><td>マウス特異的</td></tr><tr><td>PBS (リン酸緩衝生理食塩水)</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td></td></tr><tr><td>Qudro MACS セパレーター&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>は、4つのLSカラムRPMI</td></tr><tr><td>1640中</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>StepOne PlusリアルタイムPCR&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>使用機器&nbsp; to&nbsp; 遺伝子型</td></tr><tr><td>ステッパーシリーズ 反復分注ピペット 1ml</td><td>DYMAX CORP</td><td>T15469</td><td>使用 &nbsp; 分注&nbsp;HSPCとHEPの制御された方法で</td></tr>の<tr><td>supension Suturevet PGA合成吸収縫合</td>糸 <td>Henry Schein Animal Health</td><td>41178</td><td>皮膚と腹膜の縫合</td></tr><tr><td>TaqMan 遺伝子発現マスターミックス</td><td>サーモフィッシャー 科学</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>TC20 自動セルカウンター</td><td>Bio-rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>TK-NOGマウス&nbsp;</td><td></td><td></td><td>提供:一般社団法人 実験動物中央研究所(CIEA、伊藤守博士、末水 博博士)</td></tr><tr><td>Treosulfan</td><td>Medac GmbH</td><td></td><td>提供:&nbsp;ヨアヒム・バウムガルト博士(medac GmbH)&nbsp;</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1450022</td><td></td></tr><tr><td>バンナス型マイクロハサミ ストレート 80mm L</td><td>テッド・ペラ社</td><td>1346</td><td>脾臓を露出させるために皮膚を切開するために使用</td></tr><tr><td>ウェック ヘモクリップ 伝統的なチタン結紮クリップ</td><td>縫合</td>糸 <td>523700</td><td>注射後の脾臓を結紮するために</td></tr></tbody></table>

hiv関連肝病因に対する二重ヒト化tk-nogマウスモデルの確立

Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis

ヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1)に感染した患者の平均余命が増加しているにもかかわらず、肝疾患は罹患率の一般的な原因として浮上している。HIV-1によって引き起こされる肝免疫病理学は、依然として不明なままである。ヒト肝細胞およびヒト免疫系を有する小さな異種移植片動物モデルは、疾患の病因のヒト生物学を要約することができる。本明細書において、ヒト肝細胞およびCD34+造血幹細胞/前駆細胞(HSPC)移植を介して二重ヒト化マウスモデルを確立するプロトコルが記載され、HIV感染患者で観察される肝臓免疫病理を研究する。二重再構成を達成するために、男性TK-NOG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgTm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic)マウスは、マウストランスジェニック肝細胞を排除するためにガンシクロビル(GCV)用量を経頭食内注射し、非筋筋形成調節のためのトレオスルファンを用いる。ヒト肝細胞(HEP)移植およびヒト免疫系(HIS)の発達を促進する。ヒトアルブミン(ALB)レベルは肝臓移植について評価され、フローサイトメトリーによって検出された血液中のヒト免疫細胞の存在は、ヒト免疫系の確立を確認する。ここで説明するプロトコルを使用して開発されたモデルは、HIV-1感染による肝臓損傷の複数の成分に似ています。その確立は、肝炎ウイルス共感染症の研究と抗ウイルス薬と抗レトロウイルス薬の評価のために不可欠であることが証明される可能性があります。

ヒト肝臓および免疫細胞を用いた二重ヒト化マウスモデルの確立は、それぞれ非常に簡単なELISAおよびフローサイトメトリーで各ステップで容易に監視することができる。フローサイトメトリーは、機能性免疫系の発達を評価し、免疫細胞に対するHIV感染の影響を確認するために定期的に行われる。二重ヒト化マウスでは、機能性免疫細胞の発達は、リンパ球門の15%から90%の範囲である。免疫細胞の代表的なサブセットをドットプロットに示す(図3)。ヒト肝細胞の生着の評価のために、ヒト特異的アルブミンレベルに対するELISAはマウス血清上で毎月行われる。HSPCとHEPの両方で移植されたマウスは、1ヶ月で〜7 μg/mLから377 μg/mLまでのヒト固有のアルブミンレベルを示し、観察の時間(6ヶ月)にわたって成長し続ける(図4)。二重ヒト化マウスの血液中のヒト免疫細胞に対するHIV感染の影響は、ヒト特異的アルブミンELISAによって肝臓のフローサイトメトリーおよびHEPによってモ...

このプロトコルは、ヒト免疫系および肝細胞の両方を有するヒト化マウスを確立するための信頼性の高い方法を提供する。ヒト肝細胞およびCD34+造血幹細胞の脾臓内注射を介して達成される二重再構成免疫不全マウスは、ヒト免疫不全ウイルス-1感染の影響を受けやすく、肝臓損傷を再キャパチレートするHIVに感染した患者

HIV関連肝病因に対する二重ヒト化TK-NOGマウスモデルの確立

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of ...

このプロトコルの全体的な目的は、ヒト造血幹細胞およびヘパト部位を用いて、機能的ヒト免疫系と肝臓を有するヒト化マウスモデルを生成することである。この方法は、遺伝子肝ヒト化マウスの主要な質問に答えるのに役立ちます。この方法は、HIVによって引き起こされる免疫病理学を研究するための強力なツールを提供します。このプロセスのデモンストレーションは、病理学と微生物学部門のスーパーバイザーであるYimin Sunと、研究技術者のウェイミン・ワンとエドワード・マカロフが行います。まず、ヘパリンチューブで採取した臍帯血を滅菌層流れキャビネットに移します。35ミリリットルにボリュームが増加するまでPBSを追加します。サンプルをリンパ球分離培地の上に重ね、遠心分離機でGを400倍、摂氏4度で35分間、休憩を取らずに重ねます。次に、上部のプラズマ層を慎重に取り外し、トランスファーピペットを使用して白いバフィーコートインターフェースを新しいチューブに移します。30~40ミリリットルの氷冷バッファーでバフィーコートを再中断します。ピペットを使用して、セル懸濁液の20マイクロリットルを0.4%トリパンブルーの20マイクロリットルと組み合わせます。この混合物のピペット10マイクロリットルは、計数スライドの2つのチャンバーのどちらかの外側の開口部に、セルをカウントするために自動化されたセルカウンターにスライドを挿入します。細胞をGの300倍、摂氏4度で10分間遠心分離する。上清を慎重に吸引し、300マイクロリットルの氷冷バッファーを加えます。100マイクロリットルのヒトFC受容体遮断試薬と100マイクロリットルのモノクローナルマウス抗ヒトCD34抗体を最大1億個の細胞に結合させたマイクロビーズを加える。摂氏4度で30分間インキュベートします。10ミリリットルの氷冷バッファーを加え、細胞を洗浄し、遠心分離機でGの300倍、摂氏4度を10分間加えます。上清を慎重に取り除き、500マイクロリットルの氷冷バッファーでペレットを再懸濁します。この後、磁気活性化細胞選別フィールドに正の選択LS列を配置し、氷冷バッファーの3ミリリットルでそれを通過します。サンプル内のヒトCD34陽性細胞に結合したマイクロビーズを捕捉できるLSカラムにサンプルをロードし、重力の影響下でコレクションチューブに流れ込むことができます。氷冷バッファーでカラムを3回洗浄し、同じコレクションチューブに溶出液を集めます。次に、5 ミリリットルの氷冷バッファーでカラムを突き飛ばして、CD34 陽性細胞を新しいコレクションチューブに入れます。90%以上の純度を達成する手順を繰り返し次に、トリパンブルー色素とヘモサイトメーターを使用して、排除されたCD34陽性細胞を数える。計数後、5分間Gの300倍で細胞を遠心分離する。上清を捨て、細胞をPBSの125マイクロリットルで再中断し、注射をすぐに移植に使用します。CD34陽性溶離液の純度を確認するには、懸濁液の50マイクロリットルを取り、30分間摂氏4度で10マイクロリットルのPE共役抗ヒトCD34抗体と共にインキュベートします。この後、PBS内の細胞を洗浄し、再懸濁し、フローサイトメトリーを行う。取得後、テキストプロトコルに示されているデータを分析します。まず、テキストプロトコルで概説されているように、凍結保存された肝細胞を取得して解凍します。次に、バイオキャップを取り除き、解凍した肝細胞を温めた解凍媒体を含む50ミリリットルの円錐状チューブに注ぎます。チューブを手で数秒揺らし、細胞を一時停止します。細胞をGの100倍、室温で8分間ペレットする。ペレット化した細胞をPBSで0.1%BSAで洗浄し、PBSの新鮮なHSPCsまたは解凍したHSPCsを使用して、1個のマウスあたり80マイクロリットルの最終体積にプールします。まず、滅菌延長チューブの一方の端を30ゲージ針に取り付け、もう一方の端を1ミリリットルのシリンジに取り付けます。シリンジにプールされたHEPとHSPの懸濁液を充填し、反復塗布ピペットのノッチに注射器をフィットさせ、ディスペンサーを調整して各プレスで10マイクロリットルを分配します。テキストプロトコルで概説されているように各マウスを剃り、10%ポビドーネで各マウスの体の左側をスクラブし、70%イソプロピルアルコールに続きます。Vannas型はさみを使用して、胸壁の左側の皮膚、筋肉および腹膜に小さな切開を行い、肋骨ケージの下端から約5ミリメートル下の腹腔に入ります。脾臓を見つけ、簡単にアクセスするために操作領域にわずかに引っ張るために鉗子を使用し、脾臓の下極に30ゲージの針を挿入します。次に、分配ピペットのプランジャーのロックを解除し、脾臓あたり60〜80マイクロリットルの制限で、一度に体積の10マイクロリットルを分配します。針をゆっくりと引っ込め、ライゲーションアプライヤーを使用してリゲーティングクリップで脾臓をクリップします。次に、無菌PBSで濡れた綿先端アプリケーターを使用して脾臓を体腔に押し戻します。中断された縫合パターンを使用して、腹壁の筋肉層を閉じます。非吸収性縫合糸を使用して中断された縫合線パターンで皮膚閉鎖を達成する。すべての必要な材料を指定されたバイオセーフティレベル2プラス施設に移します。ウイルスと一緒に作業中に、すべてのガウン、靴カバー、フェイスマスク、カット耐性手袋を含むダブル手袋を含む個人用保護具を常に着用してください。ヒトCD45陽性細胞の15%以上の再構成を有し、HIV-1感染のための血清中にヒトアルブミンの存在を有するマウスを選択する。腹腔内にマウスに1,000~10,000の組織培養感染量50HIV-1 ADAを1匹あたり100~200マイクロリットルの体積で注入する。マウスを安楽死させた後、テキストプロトコルに概説されているように、各マウスから肝臓を切除する。一晩4%パラホルムアルデヒドで肝臓を収集し、修正します。ヒト肝臓と免疫細胞を持つ二重ヒト化マウスモデルの確立は、それぞれ非常に簡単なELIZAとフローサイトメトリーを用いて各ステップで容易に監視することができる。フローサイトメトリーは、機能性免疫系の発達を評価し、HIV感染が免疫細胞に及ぼす影響を確認するために定期的に行われる。二重ヒト化マウスでは、機能的免疫細胞の発達はリンパ球ゲートの15〜90%の範囲であり得る。ヒト肝細胞の生着の評価のために、ヒト特異的なアルブミンレベルに対するELIZAは、マウス血清上で毎月行われる。HSPとHEPの両方を用いたマウスは、1ミリリットル当たり約7マイクログラムから1ヶ月あたり377マイクログラムまでのヒト特異的アルブミンレベルを示し、観察の時間をかけて成長し続ける。二重ヒト化マウスの血液中のヒト免疫細胞に対するHIV感染の影響は、ヒト特異的アルブミンELIZAによって肝臓のフローサイトメトリーおよびHEPによって監視される。5週間までに、HIV-1は血清中のヒトアルブミンレベルの低下を引き起こし、二重ヒト化マウスの肝臓切片にヒトCK18陽性肝細胞が枯渇する。CD4対CD8の比率は、感染前の同じマウスに記載されたレベルと比較して、HIV感染マウスの血液および肝臓で典型的に観察される。血液は、バフィーコートの分離のためにリンパ球分離媒体の上に慎重に重ねるべきです。手術のために、脾臓を優しく保持し、脾臓の下極に針を挿入します。造血幹細胞の単離に続いて、CD34陽性造血幹細胞の純度をチェックして、CD3陽性細胞および異なるドナーからの肝細胞の急性注射を避けることは重要です。ヒト化マウスはヒト免疫系と肝臓の生理学的側面を示すため、開発されたマウスはHIVおよび身体的感染症および肝硬変の生理病原性を研究するために利用することができる。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ヒト化マウスを用いた腫瘍特異的T細胞の生成および特徴付けは、ここで説明されます。ヒト胸腺組織、遺伝子組み換えヒト造血幹細胞を免疫不全マウスに移植されています。抗腫瘍免疫応答の生体観察を可能に設計されたヒト免疫系の再構成でこの結果。...

幹細胞ベースの遺伝子治療腫瘍モデルとしてBLTヒト化マウスを用いた

このビデオは、ヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1)に感染したヒト化マウスモデルにおける経口併用抗レトロウイルス療法(経口cART)の有効性を評価するアッセイを示しています。ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤やインテグラーゼ鎖移動阻害剤など、HIV-1を標的とする薬剤の組み合わせを、栄養補助食品や抗生物質とともに投与します。HIV-1に感染したヒト化マウスがこの混合物を摂取した後、マウスの定期的な検査を通じてウイルス複製の効果的な抑制が評価されます。...

ヒト化マウスモデルにおけるHIV-1感染を治療するための経口併用抗レトロウイルス療法

このビデオでは、ヒト免疫系と肝細胞を持つデュアルヒト化マウスモデルを生成する方法を示します。これは、ヒト肝細胞、造血幹細胞、造血幹細胞および前駆細胞をトランスジェニック免疫不全マウスに脾腔内注射により移植し、肝細胞の生着とヒト免疫細胞の発達につながるというものです。...

ヒト肝細胞と免疫細胞を用いたヒト化マウスモデルの開発

このビデオは、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)に対する幹細胞ベースの操作免疫を持つヒト化マウスモデルを生成する技術を示しています。ヒト胎児胸腺組織と人工造血幹細胞(HSC)を、重度の免疫不全マウスの腎臓嚢に移植します。HIVに対してキメラ抗原受容体(CAR)を発現する造血幹細胞は、ゼラチン状のタンパク質混合物に混合され、胸腺組織との共局在を促進します。処置後、HSCはさまざまなヒト免疫細胞に分化し、HIVに対する機能的なヒト免疫システムを備えたヒト化マウスモデルが開発されます。...

HIVに対する遺伝子操作免疫を持つヒト化マウスモデルの構築

このプロトコルは、HIV感染に対する幹細胞ベースの操作免疫を持つヒト化骨髄/肝臓/胸腺マウスモデルを構築する方法を説明しています。...

ヒト化マウスモデルにおけるHIV感染に対する幹細胞ベースの設計さイミュニティ

このプロトコルは、ひと造血幹細胞の放射線-調節された新生児 NSG マウス注入肝を介してヒト化マウス (胡 NSG) を確立するためのメソッドを提供します。胡 NSG マウス HIV 感染および組合せの抗レトロ ウイルス療法 (カート) に敏感であるし、HIV...

ヒト NOD/SCID/IL2rγ のnull (胡 NSG) マウスは、HIV 複製の遅延研究のモデルします。

ここでは、ヒト化マウスにおけるHIV感染のダイナミクスを研究するための3つの実験的アプローチについて説明する。最初は慢性感染イベントの研究を許可し、後者の2つは一次感染またはウイルス再活性化後の急性イベントの研究を可能にする。...

ヒト化免疫不全マウスモデルにおける慢性、急性、再活性化HIV感染

幹細胞移植、膣内ヒト免疫不全ウイルス暴露、液滴デジタルPCR...

膣内HIV曝露とHIV感染治療に対するヒト化NOGマウス

ここでは、キメラHIV(EcoHIV)を用いた活性HIV感染の新しいラットモデルを確立するプロトコルを提示し、脳内のHIV-1ウイルス貯留層の理解を深め、HIV関連神経認知障害および関連する併存疾患(すなわち薬物乱用)を研究するシステムを提供するために重要である。...

エコHIV脳感染症のラットモデル

このプロトコルは、ヒト化マウスにおけるHIV-1...

HIV-1感染ヒト化マウスにおける経口併用抗レトロウイルス治療

学ぶ、ヒト造血幹細胞と肝細胞を用いて免疫系と肝臓の両方を持つ二重ヒト化マウスモデルを確立する方法。HIV関連の免疫病理と肝障害のメカニズムを研究する強力なツールとして活用できます。

HIV関連肝病因に対する二重ヒト化TK-NOGマウスモデルの確立

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