qKAT: キラー細胞免疫グロブリン様受容体遺伝子の定量的半自動化された入力
2019年3月6日
定量のキラー細胞免疫グロブリン様受容体 (KIR) 半自動入力 (qKAT) は、人口と病気の関連研究での応用数型KIRの遺伝子をコピーする簡単な高スループット、およびコスト効率の高い方法です。
この方法は、ハプロタイプの多様性やこれが病気にどのように関連しているのかといったNK細胞受容体遺伝学に関する重要な質問に答えることができます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、自動化プロセスやデータ分析を含む、研究室でプロトコルを設定するのに役立ちます。この技術の主な利点は、従来の方法とは異なり、定量的KIR自動タイピングの略であるqKATは高スループットであり、遺伝子コピー数を提供することです。
qKATは疾患関連に関する洞察を提供することができる。この技術の意味合いは、HIVやC型肝炎などのウイルス感染、癌、幹細胞移植、および妊娠障害の治療に有用であり得る。qKATは、集団遺伝学の研究や、KIRとHLA分子間の発現および機能的相互作用の探索にも適用できます。
qKATは、2つのKIR遺伝子と1つの参照遺伝子のエキソンを特異的に標的とする10の多重反応からなる。このプロトコルでは、特定のプライマーは、与えられた遺伝子の対立遺伝子を検出するように設計されており、PCRは短いアンプリコンで結果を得る。この後、デュアル標識された特異的加水分解プローブを使用して、リアルタイムでPCR増幅を監視します。
コピー数解析は、標的KIR遺伝子を基準遺伝子に対して相対的に定量することを用いた。qKAT は、ハイスループット技術として設計およびセットアップされています。したがって、各反応は1,000サンプルの下で行うことができます。
以下のステップは、各96ウェルDNAプレートの調製およびめっきに関与するステップを示す。まず、DNAを定量化した後、DNAを96ウェル深層プレートで希釈します。既知のコピー番号とテンプレート以外のコントロールを 1 つ含むコントロール サンプルを少なくとも 1 つ含めます。
プレートを450 gsで2分間遠心分離します。次に、各サンプルを4倍にして384ウェルqPCRプレートに分配します。この後、室温でクリーンな場所で24時間空気乾燥したDNA。
10個の384ウェルプレートに対して1つのqKAT反応を設定するには、まず、qPCRバッファー、プライマー、プローブアリコートを摂氏4度で解凍します。テキストプロトコルに従って氷の上にマスターミックスを準備します。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルのディープウェルプレートにマスターミックスを均等に分配します。
9.5マイクロリットルのマスターを乾燥したgDNAサンプルと共にプレートの各ウェルに混ぜます。この後、ホイルでプレートを密封し、すぐに摂氏4度で保存します。塗布マスターが複数の384ウェルDNAプレートに混入する場合は、液体ハンドリングシステムの針をきれいにするために短い水洗浄を行うことを忘れないでください。
450 gsのgDNAサンプルを用いてプレートを3分間遠心分離する。その後、プレートを摂氏4度でインキュベートし、DNAを再懸濁し、気泡を放散します。プレートを一晩インキュベートした後、遠心分離を繰り返して気泡を放散します。
次に、冷却された貯蔵ドックにプレートを置きます。qPCR マシンをマイクロプレートハンドラに接続します。次に、テキストプロトコルに従ってマイクロプレートハンドラをプログラムします。
実行が完了したら、ロボットにqPCRマシンからプレートを集め、廃棄ドックに入れさせます。増幅が完了したら、qPCR ソフトウェアを開きます。「ナビゲータ」タブで、プレートの保存された反応実験ファイルを開きます。
次に、[新しい解析の作成]ウィンドウを開き、2番目の微分最大値法に適切な設定を選択します。次に、[フィルターコーム]を選択し、STAT6 用に収集されたデータが選択されていることを確認します。適切な色補正を選択します。
[計算] をクリックし、[ファイルの保存] をクリックします。[ポイントのフィット]方法を使用してデータを解析するには、[新規解析を作成]ウィンドウを開き、[フィット点]方法に適切な設定を選択します。次に、STAT6 の正しいフィルターとカラー補正を選択します。
ノイズバンドを設定して、バックグラウンドノイズを除外します。その後、[解析]タブを開き、フィット点を 3 に設定し、[フィット点を表示]を選択します。変更を保存し、KIR 遺伝子のフィット点および 2nd 微分解析の適切な設定で手順を繰り返します。
qPCR ソフトウェアで「ナビゲーター」タブを開き、「結果バッチ・エクスポート」を選択します。次に、実験ファイルを含むフォルダを開き、ウィンドウの右側に転送します。[次へ] をクリックし、エクスポート ファイルの名前と場所を選択します。
その後、対象の解析タイプを選択し、[次へ]をクリックします。エクスポートプロセスを開始するには、[次へ] をクリックする前に、ファイルの名前、エクスポート フォルダ、および分析タイプが正しいことを確認してください。エクスポートの状態が [OK] に変わると、画面は自動的に次のステップに移動します。
選択したすべてのファイルが正常にエクスポートされたことを確認し、[完了] をクリックします。次に、テキストプロトコルのスクリプトを使用して、エクスポートされたプレートを個々の反応に分割し、コピー番号解析ソフトウェアで読み取り可能なソフトウェアにファイルを変換します。次に、コピー番号分析ソフトウェアを開き、[リアルタイム PCR 結果ファイルのインポート] を選択して、スクリプトで作成されたテキスト ファイルを読み込みます。
最後に、[分析]を選択し、[最も頻繁なサンプルコピー番号]を選択して分析を実行します。このプロトコルでは、半自動タイピング(qKAT)を使用して、数値型KIR遺伝子をコピーしました。KIR2DL4 のコピー番号が最も多かったのは 2 部でしたが、KIR3DS1 のコピー番号は最も多かったのがゼロでした。
この手順を試みる間、DNAが正確に定量化されていることを確認し、氷上のすべてのステップを実行し、試薬が光から覆われていることを確認することが非常に重要です。また、KIR遺伝子の既知のLD規則に準拠していないサンプルの生データを徹底的にチェックすることも重要です。この手順に従って、シーケンスのような他の方法は、追加の質問、例えば、融合遺伝子の存在、または新規対立遺伝子の同定に答えるために行うことができる。
この方法は、開発後、NK細胞生物学、疾患耐性、ヒト生殖におけるKIRの役割を探求する免疫遺伝学の研究者への道を開いた。
概要
定量キラー細胞免疫グロブリン様受容体（KIR）半自動タイピング（qKAT）は、KIR遺伝子のタイピングを行うためのハイスループット手法です。この技術は、NK細胞受容体の遺伝学および様々な疾患におけるその影響を理解するのに役立ちます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 免疫遺伝学
- 集団遺伝学
- 細胞生物学
背景
- KIR遺伝子は免疫応答において重要な役割を果たします。
- ハプロタイプの多様性を理解することは、疾患関連研究において重要です。
- 従来の手法は、スループットが低くコストがかかることが多いです。
- qKATは、遺伝子コピー数情報を効率的に提供します。
研究目的
- KIR遺伝子タイピングの高スループット法を開発すること。
- KIR遺伝学と疾患との関係を探索すること。
- 免疫遺伝学および集団研究における研究を促進すること。
使用した手法
- KIR遺伝子検出のための特異的プライマーの設計。
- KIR遺伝子およびリファレンス遺伝子を標的としたマルチプレックス反応の利用。
- 増幅をモニタリングするためのリアルタイムPCR。
- コピー数評価のための専用ソフトウェアによるデータ解析。
主な結果
- qKATを用いることで、1回のランで1,000検体近くを処理することが可能です。
- KIR2DL4およびKIR3DS1の最も頻度の高いコピー数が特定されました。
- 本手法により、KIR遺伝子のコピー数定量における信頼性が実証されました。
- 疾患におけるKIRの役割に関するさらなる研究が促進されました。
結論
- qKATは、免疫遺伝学の研究者にとって価値のあるツールです。
- 本手法は、健康状態および疾患状態におけるKIR遺伝子の機能に関する理解を深めます。
- この手法は、集団遺伝学におけるさまざまなアプリケーションに適応させることが可能です。
よくある質問
産業上の重要性
KIRのような多型性免疫受容体遺伝子座の正確なジェノタイピングは、免疫学および移植研究におけるターゲットバリデーションのリスク軽減に不可欠です。qKATは、大規模コホートにおける高解像度のコピー数解析を可能にし、NK細胞を介した疾患耐性や治療反応に関する機序的な知見をサポートします。この機能は、疾患モデルにおける遺伝的変異と機能的な結果を関連付けることで、初期探索における予測の信頼性を高めます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： KIR遺伝子のコピー数多型を解析することで、ハプロタイプの多様性とそれがNK細胞受容体機能に及ぼす影響を明らかにすることを可能にする。
- 運用的価値： 96ウェルおよび384ウェル形式に対応した半自動の高スループット遺伝子型判定を提供し、拡張可能なサンプル処理を実現する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 加水分解プローブを用いたマルチプレックスリアルタイムPCRにより、すべてのKIR遺伝子の定量的かつ再現可能なコピー数データを提供します。
- 運用上の価値： リファレンス遺伝子による標準化および定義済みの解析ワークフロー（2nd Derivative Max、Fit Points）を通じて、アッセイの標準化をサポートします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値： ウイルス感染、癌、移植などの疾患コンテキストにおけるKIR-HLA相互作用の探索を促進します。
- 運用的価値： 新しいアレル発見のためのダウンストリームシーケンシングや機能解析に使用可能な、ハプロタイプ情報を含むデータを生成します。
パイプラインおよびワークフローの統合
qKATは、ターゲットの仮説検証から前臨床バリデーションに至るディスカバリー・コンティニュアム（創薬研究の連続的な流れ）に適合し、特に免疫エフェクター機構が治療有効性に影響を与える場合に有用です。
- 探索生物学：KIRコピー数と疾患関連フェノタイプにおけるNK細胞活性を関連付けることで、仮説検証を支援します。
- スクリーニング：定義されたKIR遺伝子型を持つ即時利用可能な生物学的システムを構築し、免疫介在モデルにおける化合物スクリーニングを可能にします。
- 分析：コピー数判定および実験群間の統計的比較に適した相対定量データを出力します。
- トランスレーショナルリサーチ：免疫再構築または移植片対宿主病のモデルにおいて、遺伝的プロファイリングを前臨床的な連続性へと結びつけます。
- 企業での再利用：免疫学、腫瘍学、生殖衛生の各ポートフォリオに適用可能な、再利用可能な遺伝子型判定プラットフォームとして設計されています。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 多型遺伝子座の高解像度遺伝学的プロファイリングにより、免疫標的バリデーションにおける機序的な曖昧さを軽減します。
- 運用上の価値： 標準化された試薬取り扱い、コールドチェーンによるマスターミックス調製、および自動プレート処理を通じて、再現性を確保します。
- 戦略的価値： 早期相研究における大規模な遺伝学的層別化を可能にし、go/no-go判断の精度を向上させます。
- ポートフォリオへの影響： 治療反応性の差に関連するKIRハプロタイプを特定することで、リスク調整後の開発推進を支援します。
実施上の注意点
- リアルタイムPCRのセットアップ、プライマー/プローブ設計、およびコピー数解析ソフトウェアに関する専門知識が必要です。
- 384ウェルプレートに対応したqPCR装置および自動化のためのマイクロプレートハンドラーへの依存性があります。
- DNA定量、分注の整合性、およびコンタミネーション制御に関するチーム間での標準化が必要です。
- 非ヒトモデルや代替リファレンス遺伝子へ適用を拡張する際の適応上の検討事項が含まれます。
- 正確なDNA定量、試薬の遮光保存、およびLDルールの遵守に向けた生データのQC（品質管理）といった実用上の制限事項があります。
