VASP のリン酸化を測定することによって血液中の一酸化窒素の血小板ベースの検出
2019年1月7日
ここでは、血小板の血液で機密性の高い一酸化窒素センサーとしての潜在的な使用に対処するためのプロトコルを提案する.一酸化窒素の発電機としての初期血小板の調製及び亜硝酸と脱酸素化赤血球の使用をについて説明します。
このプロトコルは、血液中の生体内と生体内の両方で高感度一酸化窒素センサーとしての血小板の潜在的な使用に対処する。酸化血小板一酸化窒素におけるリン酸化血管拡張体刺激性ホスホ蛋白質またはP-VASPセリン239の増加は、ナノモル系統における一酸化窒素の存在を検出する能力を含むいくつかの利点を有する。健康なドナーから30〜50ミリリットルの全血を採取してから2時間以内に、遠心分離のために適切な数の15ミリリットル円錐形管に血液の5ミリリットルのアリコートを加える。
プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、上清の上部から血小板が豊富なプラズマを慎重に収集します。2番目の遠心分離を有するプラズマリッチな血小板をペレットにし、5ミリリットルのCGSバッファーでペレットを静かに洗浄する。400gで遠心分離機を室温で10分間行います。
遠心分離の終わりに、改変されたタイロードバッファーの3ミリリットルにペレットを再懸濁する。血球計を使用してカウントし、血小板懸濁液の密度を新鮮なタイロードバッファーで1ミリリットル当たり8番目の細胞の3倍に調整します。その後、血小板の懸濁液を摂氏37度で1時間インキュベートします。
一方、遠心分離によって全血サンプルのプレートフリー血漿層から赤血球を採取し、続いて5ミリリットルのPBSで4回の洗浄を洗浄する。最後の洗浄後、上清を捨て、ゴムストッパーで閉じたポリプロピレンボトルの適切な実験ヘマトクリットで、血漿が豊富な血小板の1ミリリットルと赤血球を混合します。ヘリウムガスタンクに接続された針を各セプタに挿入し、26個のゲージ針を挿入してガス出口を作ります。
その後、室温でボトルをゆっくりと旋回し、酸素計を使用して脱酸素プロセスの監視のための部分的な酸素圧を測定します。酸素減少率は、ヘリウム流量および攪拌速度に依存する。したがって、実験を開始する前に酸素化の時間を最適化する必要があります。
赤血球亜硝酸還元のために、10マイクロモルの最終濃度が達成されるように、中隔を通して亜硝酸塩をPRPおよびRBCの脱酸素サンプルに注入するためにマイクロシリンジを使用する。37°Cで少なくとも10分間サンプルをインキュベートし、各サンプルの1ミリリットルをマイクロ遠心チューブに移して遠心分離します。上清の上部から300マイクロリットルの血小板懸濁液を新しいマイクロ遠心分離チューブに移し、1~9%の割合で各チューブにクエン酸デキストロース酸を加えます。
血小板を再び遠心分離し、各チューブにプロテアーゼ阻害剤カクテル3を含む氷冷ライシス緩衝液の80マイクロリットルでペレットを再懸濁する。次に、各サンプルから15マイクログラムのタンパク質を2つの別々の10%SDS-PAGEゲルにロードします。ゲルを120ボルトで1.3時間実行します。
実行の終了時に、ゲルを個々の亜硝セルロース膜に移し、5%ノンファットドライミルクの適切な体積で非特異的結合を遮断する。適切な一次抗体を摂氏4度で一晩インキュベートし、その後室温で適切な二次型の大根ペルオキシダーゼ抗体を標識します。次に、膜をイメージャーで露出させ、適切な画像解析プログラムでバンド密度を定量化します。
健康な静脈血球サンプルは水銀の50〜80ミリメートルの間の部分的な酸素圧力値を有する。ヘリウムによる脱oxgenationは、酸素の分圧を10分以内に25ミリメートルの水銀に急速に減少させる。さらに、脱酸素時間の増加により、分酸素圧の減少を達成できる。
脱酸素の増加は、ますます赤い色の血漿によって示されるように、血化のレベルの増加につながります.これは脱酸素作用であり、ヘリウムなしで撹拌されたサンプル中のヘモ分解の欠如によって示されるようにそれ自体を攪拌することによって引き起こされない。血管拡張刺激性ホスホタンパク質またはVASPおよび血小板中のリン酸化VASP発現レベルは、いずれもウェスタンブロットによって検出された脱酸素サンプル中のヘマトクリットの増加に伴って減少した。
短命の一酸化窒素ドナーによる治療は、治療後10秒以内に血小板におけるリン酸化血管拡張剤刺激リンフォ蛋白発現を増加させる。さらに、リン酸化VASPまたはP-VASPのレベルは、既存のP-VASPレベルに影響を与えることなく血小板からRBCを分離するのに十分な時間があることを示す血小板が豊富な血漿を用いたNOドナーのインキュベーション後10分まで安定したままでした。亜硝酸塩はまた、脱酸素性RBCsの存在下で血小板のP-VASPレベルを増加させる。
ここでの総VASPに対するP-VASPの比率は、ヘマトクリットのレベルに依存する。VASPは血小板で高発現し、一酸化窒素の存在下で急速にリン酸化される。従って、このプロトコルは、種々の生理的刺激による一酸化窒素の誘導を研究するための方法を提供する。
この方法により、生体内で亜硝酸を吸入することにより、一酸化窒素刺激のマーカーとして血小板中のP-VASPの増加を利用しました。生物学的標本で血小板を使用して作業することは、常に適切な個人保護装置を使用して行われるべきであることを忘れないでください。
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概要
本プロトコルでは、in vitroおよび血液中でのin vivoの両方において、血小板を高感度な一酸化窒素センサーとして利用する方法について解説します。また、血小板の調製方法、および一酸化窒素発生源としての亜硝酸塩と脱酸素化赤血球の使用について詳細に説明します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生化学
- 血液学
背景
- 血小板はナノモル濃度の一酸化窒素を検出することができます。
- リン酸化血管拡張刺激性ホスホタンパク質（P-VASP）は、一酸化窒素の存在を示す重要な指標です。
- 一酸化窒素検出の理解は、さまざまな生理学的研究に影響を与える可能性があります。
- 本研究では、in vitroおよびin vivoの両方の手法について検討します。
研究目的
- 血小板を一酸化窒素センサーとして利用するためのプロトコルを開発すること。
- 血液サンプルにおける一酸化窒素検出の感度を向上させること。
- この検出法の実際的な応用について調査すること。
使用方法
- 健康なドナーからの全血採取。
- 遠心分離による多血小板血漿の分離。
- CGSバッファーを用いた血小板ペレットの洗浄。
- 調製した血小板を用いた一酸化窒素レベルの測定。
主要な結果
- 一酸化窒素検出のための血小板調製の成功。
- 血液サンプル中の一酸化窒素を検出する能力を実証。
- 他の方法と比較した際の血小板使用の利点を強調。
- 今後の研究に向けた再現性のあるプロトコルを提供。
結論
- 血小板は、効果的な一酸化窒素センサーとして利用できる。
- この手法により、さまざまな研究アプリケーションにおける検出感度を向上させることができる。
- 本アプローチの潜在的な可能性を十分に探求するためには、さらなる研究が必要である。
よくある質問
産業界における重要性
一酸化窒素（NO）は反応性が非常に高く半減期が短いため、血液中のNOを直接定量することは創薬における長年の課題となってきました。この血小板を用いたVASPリン酸化アッセイにより、NOの高感度なリアルタイム検出が可能となり、血管および血液研究におけるメカニズムのリスク低減とターゲットバリデーションを支援します。本手法は、NOシグナリングが重要な経路となる初期創薬とトランスレーショナルワークフローの接点において、予測の信頼性を向上させます。
バイオ医薬品の研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 血小板におけるNO介在性シグナリングを直接的に解析し、パスウェイの解明を可能にする。
- 血液中におけるNO生物活性の機能的な読み出しを提供することで、生物学的リスク低減（de-risking）を支援する。
- 血管緊張や血小板凝集を調節するプログラムにおけるターゲットバリデーションを促進する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 下流のNO検出アッセイに使用するための、バリデーション済み血小板豊富システムを調製します。
- アッセイの標準化に向けた、定量的で再現性の高いP-VASP読み取り値を提供します。
- スクリーニングキャンペーンにおけるNOドナーおよびモジュレーターの信頼性の高い評価を可能にします。
翻訳および前臨床研究
- NOシグナリングが血栓症や血管機能に影響を及ぼす疾患関連モデルと整合します。
- in vitroでのNO検出からin vivoのバイオマーカー研究までの一貫した流れを提供します。
- NO経路を標的とする候補物質のリスク調整に基づいた開発推進を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このVASPリン酸化アッセイは、血管および血液学ポートフォリオにおける初期探索、リード化合物の特定、およびトランスレーショナルリサーチの交差点にNO検出を位置づけるものです。
- 探索生物学： NOパスウェイ調節の仮説検証およびメカニズムのリスク低減を可能にします。
- スクリーニング： 化合物評価のための標準化された定量的なP-VASP出力を提供します。
- 分析： 比較分析のための、NO誘発リン酸化イベントの堅牢な測定を実現します。
- トランスレーショナルリサーチ： in vitroでのNO検出とin vivoでのバイオマーカー検証を橋渡しします。
- エンタープライズでの再利用： 複数のプログラムにわたるNOパスウェイ解析のための再利用可能なプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： NO経路の調節およびターゲットエンゲージメントにおける予測信頼性を向上させる。
- 運用上の価値： 再現性と拡張性のある血小板ベースのアッセイにより、NO検出を標準化する。
- 戦略的価値： メカニズムの曖昧さを排除することで、血管および血液学資産のgo/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響： NOシグナリングを標的とする候補物質のリスク調整済み優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 血小板の分離、ハンドリング、およびウェスタンブロット分析の専門知識が必要です。
- 遠心分離、ガス制御、および定量イメージング設備へのアクセスが必要です。
- サンプル調製およびアッセイのタイミングについて、チーム間での標準化が求められます。
- 生理学的妥当性に留意することで、in vitroおよびin vivoモデルの両方に適応可能です。
- 不安定なNO誘導リン酸化状態を維持するため、迅速な処理が必要であるという制約があります。
