Name: マウス誘導多能性幹細胞由来腫瘍抗原特異的胸腺移民を生成する三次元胸腺培養システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 学ぶ三次元胸腺培養システムを用いたマウスiPSC由来腫瘍抗原特異的胸腺移民の生成法。ナイーブT細胞様表現型を持つ均一なCD8陽性T細胞を産生し、腫瘍抑制能を有する細胞治療への応用が期待されます。

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私たちは、OP9/DLL1セルラインを親切に提供してくださった川本浩と増田京子に感謝します。アラン・B・ホーフィングとエリナZに感謝します。彼はグラフィカルな援助を受けている。この研究は、米国国立がん研究所(ZIA BC010763)の内部壁画研究プログラムと、NCI(NIH)の細胞ベース治療センターのがんムーンショットプログラムによって支援されました。この活動はミルシュタイン家族財団の支援も受けました。

すべての動物実験は、国立がん研究所(NCI)の機関動物ケアおよび使用委員会によって承認され、NIHガイドラインに従って行われました。
1. iPSCとの共培養のためのOP9/DLL1細胞の調製
<ol><li>OP9培地における培養OP9/DLL1細胞(α-最小必須培地[α-MEM]+20%非熱不活性化胎児ウシ血清[FBS]+1xペニシリン連鎖筋リン+アスコルビン酸[50 ng/mL]およびモノチオグリセロール[100 nM])を37°Cで培養した。OP9/DLL1細胞が80~95%の合流性に達した場合は、1xマグネシウム、カルシウム、フェノール赤フリーリン酸緩衝生理食塩分(以下、PBSといいます)で1回洗浄してください。</li>
	<li>0.05%トリプシンの4 mLを追加し、37°Cで5分間インキュベートします。次いで、OP9培中の4mLを添加し、ピペッティングにより細胞層を解離し、単一のセル懸濁液を作る。</li>
	<li>100 μm セル ストレーナーを介して 50 mL 円錐管にセル懸濁液を移します。4°Cで5分間300xgで遠心分離機を、上清を吸引し、OP9培体の12mLで再中断する。</li>
	<li>OP9/DLL1細胞懸濁液のプレート2 mLを新しい10cm細胞培養ペトリ皿に加え、OP9培地の8mLを追加します。2~3日ごとに繰り返します。 注:FBSおよび培養条件の質は、iPSC分化をサポートする能力を失うことなくOP9/DLL1細胞の膨張を維持するために重要である。したがって、細胞分化および老化を防ぐために、80%の合流性で一貫してFBSと通過の多くを事前に評価することをお勧めします。また、OP9/DLL1細胞の十分な冷凍ストックを作り、4~6週間ごとに新しいストックを解凍することも重要です。</li>
</ol>2. 未熟T細胞へのiPSCの体外分化
<ol><li>
0日目に、OP9/DLL1コンフルエント料理でiPSC共培養を開始します。
	<ol>
<li>トリプシン化による単一細胞懸濁液としてiPSCを収穫し(37°Cで0.05%トリプシンで5分)、細胞を回収し、遠心分離機を4°Cで5分間300xgで回収する。 </li>
		<li>OP9培体の10mL当たり1.0 x 105 iPSCで細胞を吸引し、再中断する。プレート 1.0 x 105 iPSC を CONフルエント OP9/DLL1 10 cm 皿に付けます。 注:OP9/DLL1 10cmの料理は、90~100%の合流率に達するとiPSC分化に使用されます。合流の違いは、iPSC分化の効率に影響を与える可能性があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>3日目に、古いメディアを吸引し、新鮮なOP9メディアの10 mLに置き換えます。</li>
	<li>
6日目に、通過細胞。
	<ol>
<li>PBSの10 mLで各10 cmコンフルエントOP9皿を洗います。皿あたり0.05%トリプシンの3 mLを追加し、室温(RT)で3-5分間インキュベートします。</li>
		<li>OP9培体の4mLを追加し、穏やかなピペッティングで細胞を収集します。100 μm のセル ストレーナーと遠心分離機を 300 x gで 4 °C で 5 分間渡します。上清を捨てる。</li>
		<li>分化媒体の10mLで細胞を再懸濁(5 ng/mLマウスFlt3リガンド[FLT3L]および5 ng/mLマウスIL-7を用いてOP9培地およびプレートセル懸濁液を新しい10cm OP9/DLL1コンフルエント皿に置き換える。</li>
	</ol>
</li>
	<li>9日目に、古いメディアを吸引し、新鮮な分化メディアの10 mLに置き換えます。</li>
	<li>
iPSCコロニーで心筋細胞が観察された11日目に、ピペッティングによって非付着細胞を機械的に剥離し、100μmの細胞ストレーナーを通して濾過する。300 x gで5分間4°Cでスピンします。
	<ol>
<li>上清を吸引し、分化媒体の24 mLで再中断する。confluent OP9/DLL1 6ウェルプレート(4 mL/ウェル)にiPSCをプレートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
15日目に、すべての非付着細胞を収集し、40 μmセルストレーナーを通して濾過します。
	<ol>
<li>300 x gで5分間4°Cでスピンします。</li>
		<li>ステップ2.5.1を繰り返して、3~4日ごとに非付着細胞の通過を続けます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. iTEを生成する3D胸腺臓器培養
<ol><li>マウスの胎児胸腺ローブを収穫し、前述の16としてデオキシグアノシン(dGUO)治療による内因性リンパ球の展開。</li>
	<li>dGUO処理の7日目に、4つの新しい10cmの皿を取り、完全な媒体の20 mLでそれぞれを満たします(ロスウェルパーク記念研究所メディア1640 [RPMI 1640]+10%FBS +1x L-アラニル-L-グルタミン+1xナトリウムピルビン酸+1x必須必須アミノ酸を含む1x最小必須培地(MEM-NEAA)+1xペニシリン連鎖マイシン+[1:1000]2-メルカプトエタノール)</li>
	<li>胸腺ローブを持つすべてのニトロセルロース膜を1つの10センチメートルの皿に移します。個々の葉を鉗子で膜から取り外し、メディアに浸かるようにします。膜を捨てるRTで1時間インキュベートします。</li>
	<li>胸腺ローブを完全なメディアで新しい10cmの皿に移し、RTで1時間インキュベートします。</li>
	<li>鉗子を使用して、甲状腺ローブを皿に固定し(一度に1つずつ)、もう一方の手で中央に100〜200 μmの深い切開を行い、ローブの直径の半分を拡張して、T細胞前駆子の葉への移動を容易にする。</li>
	<li>完全な分化媒体で満たされた新しい10cmの皿に胸腺ローブを移す(完全な媒体+ 5 ng/mLマウスIL-7 + 5 ng/mLマウスFLT3L+ 5 ng/mL SCF)。</li>
	<li>必要に応じて、下部および上位のグリッドを持つ 3D 培養プレートを使用する場合は、両方のグリッドを滅菌 PBS で塗りつぶして、吊り下げ滴の蒸発と乾燥を防ぎます。</li>
	<li>ステップ3.6から1つのdGuo処理された胸葉を含む完全な培地の30 μLを3D培養プレートの各ウェルに移します。</li>
	<li>OP9/DLL1共培養(16~21日目)(ステップ2.6.2)から非付着性T系統細胞(iPSC由来未熟T細胞)を集め(ステップ2.6.2)、20μL培地当たり2-5 x 103 T系細胞で再中断する。</li>
	<li>3D培養プレートの各胸葉に20μLのT系統細胞懸濁液を加えます。5%CO 2で37°Cで一晩インキュベートします。
</li>
	<li>P200ピペを30μLに設定し、各井戸から数回ピペッティングした後、甲状腺ローブを囲むすべての細胞を取り除く後、メディアを吸引します。メディアを破棄し、30 μL の完全なメディアを追加します。この手順を5~7回繰り返し、ローブに移行しない余分な未熟なT細胞を除去します。その後、メディアの25~30 μLを毎日変更します。</li>
	<li>4~5日目に始まるローブの周りにiPSC由来の胸腺移民(iTE)のハローの形成を光顕微鏡で確認する。</li>
	<li>ローブの中断なしでメディアをピペッティングすることにより、毎日iTEを収集します。毎日メディアを変更し、約12日間まで収集を続けます。</li>
	<li>収穫されたiTEは、分子解析(図2、図3、図4、図5)または生体内移植実験に使用する準備ができています。</li>
</ol>4. 抗原提示細胞の調製(APC)
<ol><li>頸部脱臼によるC57BL/6マウスを犠牲にし、上述したようにラボソーカーマットの上に置きます。</li>
	<li>脾臓を取り出し、100 μm のセル ストレーナーの上に置く。12 mLシリンジプランジャーを使用して脾臓をストレーナーに圧縮し、単一の細胞懸濁液を作ります。</li>
	<li>無菌の40 μmセルストレーナーを介して細胞懸濁液を移す。懸濁液を300 x gで5分間4°Cで遠心分離し、細胞をペレットする。</li>
	<li>上清を吸引し、赤血球(RBC)を排除するために、塩化カリウム(ACK)リシスバッファーの2 mLで細胞ペレットを再中断する。RTで5分間インキュベートします。</li>
	<li>10 mLのPBSを添加してACKリシスバッファーをクエンチする。4°Cで5分間300xgで遠心分離によって細胞をペレットする。</li>
	<li>上清を吸引し、完全な培養剤の10 mLで細胞ペレットを再懸濁し、10 cmの無菌ペトリ皿に移す。</li>
	<li>細胞増殖を防ぐために照射装置(γ放射線)を用いて3500ラッドの脾細胞を照射する。</li>
	<li>照射した細胞を直ちに37°Cインキュベーターに戻し、一晩培養する。</li>
	<li>照射されたセルを APC として使用するか、セルバンカーで凍結します。</li>
</ol>5. 抗原を使ったAPCのパルス
<ol><li>ノイバウアーヘモサイトメーターとトリパンブルー染料を使用して、ライブ照射APCをカウントします。ペプチド(hgp100)またはヌクレオタンパク質でAPCを37°Cで30分間インキュベートします。</li>
	<li>余分なペプチドを除去するために、PBSの10 mLでAPCを2回洗浄します。</li>
	<li>iTE をカウントし、100 IU IL-2 および 5 ng/mL IL-7 を持つ完全なメディアで 1:1 の比率で APC と混合します。アリコット100μLの細胞混合物(総濃度:1x 106細胞/mL)を、37°Cで48時間の超低アタッチメントUボトム96ウェルプレートおよび培養の各ウェルに入れる。</li>
	<li>48時間後、マルチチャンネルピペットを使用して新しいプレートに細胞を移し、その後2~3日ごとに通過する。</li>
	<li>
3日目に細胞内抗体を染色してサイトカイン分泌プロファイルを分析し、フローサイトメトリー(図3)で分析する。
	<ol>
<li>タンパク質輸送阻害剤の0.67 μL/mLを追加し(例えば、GolgiStop)、サイトカインの細胞内蓄積を高めるために6時間37°Cでインキュベートします。10 mLのPBSで洗浄します。</li>
		<li>3 mLの冷たい(4°C)PBSで細胞を再中断し、ゆっくりと冷たい4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液の1 mLを追加します。</li>
		<li>10分後、4°Cで5分間300xgで細胞をスピンダウンし、上清を捨て、10 mLのPBSで洗浄します。 </li>
		<li>1 mL PBS + 1% FBS + 0.1% ニオニオン界面活性剤で細胞を再中断し、10〜15分間4°Cに置きます。</li>
		<li>抗体を追加し、光からサンプルを保護し、30分間4°Cに置きます。</li>
		<li>4°Cで5分間300xgで細胞をスピンダウンし、上清を捨て、10mLのPBSで洗浄する。 </li>
		<li>4°Cで5分間300xgで細胞をスピンダウンし、PBSの1 mLで細胞を再中断します。 細胞は流れ細胞計で分析する準備ができている。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者ラウル・ヴィスカルド、ニコラス・D・クレメン、ニコラス・P・レシポは、出願中の国際特許出願PCT/US2017/65986の発明者であり、2017年12月13日に出願された「甲状腺移民細胞の単離または精製集団を準備する方法」同じ方法を使用して治療の方法。

T-iPSCを使用して腫瘍抗原特異的T細胞を再生することは、持続性を改善した若い細胞を生成することによってACTの現在の障害の多くを克服することができる。OP9/DLL1共培養系を用いたいくつかの方法は、CD8 SP細胞6、7、10、13を産生するCD8分子および腫瘍抗原特異的TCRを発現する、グローバル遺伝子を生成することが報告されている。発現パターンと機能解析は、これらの非チル的に再生されたCD8 SP細胞がナイーブT細胞とは異なっていることを示している(図4)。ここでは、マウスT-iPSCから高い忠実度と均質性を持つiPSC由来のタイムミック移民(iTE)を生成できる3D胸腺培養システムについて述べます。iTEは、グローバル遺伝子発現パターンおよび機能性において、確立された腫瘍15に対する記憶形成および生体内抗腫瘍効果などのナイーブT細胞に似ている。
古典的なFTOCシステムは、インビトロで胸腺選択を要約する方法です。胸腺細胞23の胸腺内発達を研究するために使用されており、RTE24の生成に使用されているFTOCのいくつかの報告があります。ただし、FTOC システムにはいくつかの制限があります。人工臓器培養における酸素の不足に対処するために、いくつかのグループは、半乾燥膜ベースの培養23、または高酸素浸漬培養システム25のいずれかを使用している。しかし、現在の方法では、常に胸後T細胞の均質な集団を生成することはできません。古典的なFTOCシステムの限界を克服するために、我々は従来の方法15よりも技術的な改善を提供する3D胸腺培養システムを設計しました。例えば、当社の3D胸腺培養法を使用して、最大酸素交換と表面ローブの機械的ストレスの不在は、より生理的な環境で胸葉を保ちます。さらに、長期培養は成熟したT細胞が甲状腺葉から自然に出て行くことを可能にする。最後に、リアルタイムの観察とマイクロ操作により、腺ローブを物理的に妨げることなく、メディア交換とiTEの一定のコレクションが可能になります。したがって、3D胸腺培養法は、以前は利用できなかったチメックに選択されたナイーブT細胞を研究するための手段と同様に、大幅な技術的改善を提供する。
この3D胸腺培養システムを使用してiTEを成功させるための重要なポイントがいくつかあります。FBSおよび培養条件の質は、iPSC分化をサポートする能力を失うことなくOP9/DLL1細胞の膨張を維持するために重要である。したがって、細胞分化および老化を防ぐために、FBSロットの事前評価と80%の合流性で一貫して通過することをお勧めします。さらに、合流の違いが効率に影響を与える可能性があるため、iPSCを未熟なT細胞にインビトロで分化するには、コンフルエントOP9/DLL1培養が必要です。最後に、胸腺葉の胚年齢は、iTEの生成に不可欠です。E14.5 - 15.5胸腺ローブを使用することをお勧めします。
他の新しいプロトコルと同様に、この方法には制限があり、改善の対象となります。ここで提示される培養技術は、1日あたり約1000 iTEを2週間の期間で生成する。iTE生成の増加は、酸素濃度、培地量、および3D培養プレートのタイプの最適化を含むさらなる改変によって可能である。サイトカインの添加または除去、ならびにサイトカイン濃度の変化は、iTE収率の向上にも寄与し得る。
ここで紹介する3D胸腺培養システムが完全にexvivoシステムで胸腺移民を生成できることを考えると、この技術は、Tを含むが、これらに限定されない様々な免疫学的および養子細胞移植研究プロジェクトに適用することができる。細胞分化、胸後T細胞成熟、造血前駆体または幹細胞からの抗原特異的T細胞の生成。この方法はヒトサンプルに直接適用できないが、iTEと3D胸腺培養システムは、正と負の選択の分子機構を解明する大きな可能性を秘めており、それを可能にする培養システムの構築を促進する可能性がある。ACTのための臨床的に関連する腫瘍抗原特異的なナイーブ様T細胞の生成。

養子T細胞療法(ACT)は、進行癌患者の一部に有効な治療法とすることができる。残念ながら、多くの患者は腫瘍回帰を経験せず、転移した細胞は注入後も持続しない。これは、注入されたT細胞の品質に起因する可能性がある。ACTマウスモデルは、ナイーブまたはそれ以下の分化された中心記憶T細胞と比較して、末端分化エフェクター細胞は生体内持続性1の不十分さのためにあまり強力ではないことを示し、臨床データ2によっても支持される観察、 3.
現行のACTの有効性を改善する取り組みとして、T細胞由来多能性幹細胞(T-iPSC)が広範囲に研究されている4,5.T細胞をT-iPSCに再プログラムし、T細胞に再分化すると、TCR遺伝子の再配置構成はT-iPSCに継承され、その後再分化されたT細胞が継承されます。従って、T-iPSCが無制限のインビトロ膨張を受ける能力は、このような細胞が腫瘍抗原特異的T細胞から設計された場合に、新生原特異的T細胞受容体(TCR)を担う未熟なT細胞の効率的な再生を可能にする6 、7.しかしながら、T-iPSCを成熟したT細胞に分化させる正確な方法は、分化性の低い表現型と抗腫瘍効力を有する癌抗原特異的T細胞の産生を可能にする、解明されたままである。
OP9マウス間質細胞の共培養を用いたT-iPSC分化は、ヒトノッチリガンドDLL1を過剰発現させ、インビトロ6、7でT細胞を産生する確立された方法である。マウスとヒトにおいて、この共培養システムはiPSCを一貫して区別することができ、それによって未熟なT細胞系統段階6、7まで胚盤胞期から発達事象を要約することができる。これらのバイオテクノロジーの進歩にもかかわらず、CD4+CD8+二重陽性(DP)段階後の生理学的分化は、達成することは依然として困難である。その理由の一つは、生体内CD4+CD8-およびCD4-CD8+単一陽性(SP)T細胞が胸腺に生成され、外来抗原特異性を持つT細胞の成熟と選択を担う器官であるが、自動反応性8ではありません。これらの選択的プロセスは、それぞれ正と負の選択として定義されます。しかし、胸腺のT細胞を成熟させるために必要な分子機構のほとんどはまだ完全に理解されていないため、このプロセスをインビトロで再構築することは困難です。この生理的ハードルを克服するために、いくつかのグループは、抗CD3抗体またはアゴニストペプチドを使用してTCR複合体を刺激している。これらのインビトロ技術は、腫瘍抗原特異性を保持しながら、CD3、CD8αβ、TCRαβ、およびCD62Lのような主要なT細胞マーカーを発現する細胞産物を生成する。残念ながら、これらの外血的方法によって生成されたT細胞は、不完全な陽性選択、生来のような特徴、TCR非特異的死滅、記憶形成の不能、およびおよび及びおよび及び生体内8、9、10、11における非持続性抗腫瘍効果。これらの異常は、このような細胞が、治療用途に使用される場合、リンパ腫および皮膚および骨の異常を含む様々な副作用を引き起こすかもしれないという懸念を提起している12,13,14.
インビトロ分化系で現在欠落している生理シグナルを再現するために、腫瘍抗原特異的T-iPSCは、採取された胸腺を用いて分化した。T細胞の胸腔内発達を研究するために設計された古典的な胎児胸腺臓器培養(FTOC)系は、甲状腺教育を完了したT細胞を正常に産生した3D培養システムを用いて改善された。iPSC由来の胸腺移民(iTE)として指定されたこれらの胸腺後T細胞は、ナイーブ様特性15を示した。iTEは、確立されたB16黒色腫腫瘍に対するマウスモデルにおいて増殖、記憶形成、および適切な抗腫瘍効果を示した。この資料では、3D 培養システムを使用したこの新しい FTOC システムのプロトコルについて詳しく説明します (図1)。

<table><tbody><tr><td>Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-deoxyguanosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>312693-72-4</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール (1,000x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Gibco</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R21001</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini</td><td>100-500</td><td></td></tr><tr><td>FLT-3 リガンド</td><td>R&D Systems</td><td>427-FL</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>hgp100</td><td>Genscript</td><td>282077-1, KVPRNQDWL</td><td></td></tr><tr><td>Interleukin-2</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ402-ML</td><td></td></tr><tr><td>インターロイキン-7</td><td>R&D Systems</td><td>407-ML</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>MEM 粉末</td><td>Gibco</td><td>61100061</td><td></td></tr><tr><td>モノチオグリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-6145</td><td></td></tr><tr><td>核タンパク質</td><td>グローバルペプチド</td><td>ASNENMETM</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 pH 7.4 (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Stem Cell Factor (SCF)</td><td>R&D Systems</td><td>455-MC</td><td></td></tr><tr><td>Stemfactor LIF, Mouse Recombinant</td><td>STEMGENT</td><td>03-0011-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Vessels and others</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm dish</td><td>Corning, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>353003</tr><tr><td>12 mLシリンジ</td><td>Covidien&nbsp;Monoject</td><td>22-652-090</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>Corning/Coster</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー 100 &mu;m</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー 40 &mu;m</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-363-547</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>デュモン</td><td>0108-5PO</td><td></td></tr><tr><td>ラボ ソーカー マット</td><td>Versi-ドライ</td><td>キャット。EF2175CX 74018-00</td><td></td></tr><tr><td>メンブレンフィルター ( 0.8 &mu;m, 47diam)&nbsp;</td><td>ワットマン</td><td>WHA7408004&nbsp;ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Perfecta3D Hanging Drop Plate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HDP1096</td><td></td></tr><tr><td>U Bottom 96 well plate</td><td>Corning/Coster</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Experimental Cell lines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD3-iPSC</td><td>Vizcardo et al., Cell Report 2018</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MEF-iPSC</td><td>Vizcardo et al., Cell Report 2018</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>マウス胚性線維芽細胞(MEF)</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1040;RRID:MGI:5007926</td><td></td></tr><tr><td>OP9/N-DLL1</td><td>理研バイオリソースセンター</td><td>Cat# RCB2927;RRID:CVCL_B220</td><td></td></tr><tr><td>Pmel-iPSC</td><td>Vizcardo et al., Cell Report 2018</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Experimental mouse models</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyCrCrl&nbsp;</td><td>チャールズ川</td><td>ひずみコード564;RRID:IMSR_CRL:564</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6N</td><td>NCI/Charles River</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pmel-1 マウス</td><td>Overwijk et al.</td><td>J Exp Med 198(4):569-80</td><td></td></tr><tr><td>抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗aTCR</td><td>バイオレジェンド</td><td>109202;RRID:AB_313425</td><td></td></tr><tr><td>アンチCD3</td><td>abcam</td><td>ab11089;RRID:AB_369097</td><td></td></tr><tr><td>抗CD4</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>553730;RRID:AB_395014</td><td></td></tr><tr><td>抗CD44</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>559250;RRID:AB_398661</td><td></td></tr><tr><td>抗CD45.1</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>553775;RRID:AB_395043</td><td></td></tr><tr><td>抗CD45.2</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>553772;RRID:AB_395041</td><td></td></tr><tr><td>抗CD62L</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>560516;RRID:AB_1645257</td><td></td></tr><tr><td>抗CD69</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>552879;RRID:AB_394508</td><td></td></tr><tr><td>抗CD8a</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>557959;RRID:AB_396959</td><td></td></tr><tr><td>抗CD8b</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>550798;RRID:AB_393887</td><td></td></tr><tr><td>Anti-H-2Kb</td><td>BD Biosciences</td><td>553570;RRID:AB_394928</td><td></td></tr><tr><td>反IFN-g&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>557998;RRID:AB_396979</td><td></td></tr><tr><td>抗IL-2</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>554428;RRID:AB_395386</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TCRb</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>35-5961-81;RRID:AB_469741</td><td></td></tr><tr><td>抗TCRVb13</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>553204;RRID:AB_394706</td><td></td></tr><tr><td>抗TNFa</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>557644;RRID:AB_396761</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス誘導多能性幹細胞由来腫瘍抗原特異的胸腺移民を生成する三次元胸腺培養システム

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

事前に再配置されたT細胞受容体(TCR)とそのエピジェネティックな若返りの継承は、誘導多能性幹細胞(iPSC)由来T細胞を養子T細胞療法(ACT)の有望な供給源にする。しかし、iPSCから再生されたT細胞を産生するための古典的なインビトロ法は、自然的または末期的に分化したT細胞のいずれかをもたらし、これは、典型的かつ機能的にナイーブT細胞とは異なる。最近、新しい三次元(3D)胸腺培養システムが開発され、増殖能力、記憶形成を含むナイーブT細胞様機能表現型を持つCD8αβ+抗原特異的T細胞の均質なサブセットを生成する。、および生体内の腫瘍抑制。このプロトコルは、異常な発達の運命を回避し、iPSC由来の子宮内移民(iTE)として指定された臨床的に関連するiPSC由来T細胞の生成を可能にすると同時に、必要なその後の機能を解明するための強力なツールを提供します。胸腺選択後のT細胞の成熟のために。

共培養胎児胸腺を切除し、iPSC由来のT系統細胞が甲状葉に移行できるかどうかを分析した。未播種対照ローブは、内因性CD3+細胞を展開したアストロサイト様胸腺上皮ウェブ17を特徴とする組織アーキテクチャを有していた。一方、iPSC由来の未熟T細胞を播種した胸腺葉は、CD3+単核細胞で再始動し、iPSC由来の未熟T細胞を葉への移行を示す(図2A)。
その後、胸腺微小環境内に移行して成熟したT細胞は、その後iTEとして出力される。その発話性の特徴付けを試験するために、C57BL6胸腺細胞、Pmel iPSC由来未熟T細胞(外チル)、および胸葉(iTE)から出る細胞のフローサイトメトリック解析を行った。OP9/DLL1上の骨外T細胞は、陽性選択マーカーMHC-Iの発現なしにCD4+CD8+(DP)T細胞およびCD8αSP T細胞を示したが、iTEはCD8αSP MHC-I+T細胞表現型の明確な集団を有し、それらのことを示した。 胸腺葉から出る前に肯定的な選択を通して成功した通過。iTEは一貫してMHC-IおよびCD62Lを発現し、高増殖能力、サイトカイン産生、末梢生存、およびリンパホーミング18、19、20に関連するマーカーである。この表現型は、胸腺20における単一陽性T細胞の最も成熟した集団であるM2 SP胸腺細胞と一致しており、これはiTEが正常な胸腺発達プログラムを介して移行したことを示唆している(図3)。iTE生成の効率を監視するために、個々の胸葉から出ていた細胞を単離した。7日目、胸腺ローブは1 x 103ライブCD8SP CD45.1+ CD3+ iTE/日の平均を生成しました(図3B)。iTE産生の同様の速度は、3D胸腺共培養の6日目から12日目まで観察される。
サイトカインの抗原依存性活性化と分泌を分析し、子宮内教育を受けたiPSC由来未熟T細胞の機能特性を観察した。無関係なペプチド(ヌクレオタンパク質)の存在下で、Pmel-iTEはTNF-α、IL-2、またはIFN-γのかなりの量を放出しなかった。Pmel T細胞(hgp100)のコグネイトペプチドを用いて刺激すると、Pmel-iTEはTNF-αおよびIL-2の堅牢な量を放出し、同時に低量のIFN-γ(図4)を産生し、そのコグネイトペプチドを認識できることを示す。自然最近の胸腺移民(RTE)に似たプロファイルを持つエフェクターサイトカインを分泌する。
子宮内膜教育の有無にかかわらずOP9/DLL1で分化したiPSC由来T系統細胞間の転写物の違いを調べるために、RNA-seq分析をこれら2つの集団に対して行い、比較した。OP9/DLL1(DP)および一次ナイーブCD8+Pmel T細胞を用いて分化したDP T系統細胞のそれと。T細胞オントジェニー、胸腺細胞活性化、および記憶形成において重要な役割を果たす102個の遺伝子の発現を、15、20、21、22を分析した。これらの4つの研究集団の主成分分析は、非チル的に生成されたDPとCD8SP T細胞が一緒にクラスター化し、iTEがナイーブT細胞に近いクラスター化していることを示した(図5)。これらのデータは、iTEが骨外法によって生成されたT系統細胞よりもナイーブT細胞に近い表現型を持っていることを示している。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig1.jpg"> 図 1:OP9/DLL1および3D胸腺培養を用いたiTEへのiPSCの分化の概略図プロトコルには、3 つの別々の差別化手順が含まれます。(左)op9/DLL1上の造血系統細胞(0~6日目)、造血系統細胞からサイトカインを用いたOP9/DLL1の未熟なT細胞(6日目~16~21日目)、未熟T細胞(16~21日目)へ(右)3D胸腺培養システムを用いてiTE。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig2.jpg"> 図 2: iPSC由来の未熟なT細胞に播種した胸腺ローブの免疫組織化学。上:iPSC由来未熟T細胞の播種の有無にかかわらず、胸腺ローブのH&amp;E染色。2番目の上から下へ:DAPI(核)、CD3(T細胞)、およびマージで染色された断面ローブの共焦点画像。スケールバー = 100 μm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig3.jpg"> 図 3:iTEは、胸骨後T細胞表現型を示す。(A) FACSは、甲状腺細胞、骨外T細胞(OP9/DLL1共培養系)およびPmel-iTEの分析を行った。生細胞を前因CD45+上でゲートした。CD8 SP集団をCD62LおよびMHC-I発現についてさらに分析した。(B) シード前7日後に1枚当たり1枚のCD8SP CD45.1 iTEの平均数。データは12の独立した実験から収集された。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig3large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig4.jpg"> 図 4: iTEは抗原特異的刺激により様々なサイトカインを産生する。FACSは、iTEによるサイトカインの細胞内産生を分析する。iTEは、無関係(ヌクレオタンパク質)またはコグネート(hgp100)ペプチドを3日間プリロードしたAPCと共培養した。右上象限に示されている数値は、サイトカインを産生するiTEのパーセンテージを示しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig4large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58672/58672fig5.jpg"> 図 5:全転写解析は、素朴なCD8に向かうiTE遺伝子発現のシフトを明らかにする+Tセルプログラム。DP、骨外CD8 SP、iTE、およびナイーブT細胞からのRNA-seqデータの原理成分分析(PCA)。(公的データベースGSE105110を用いて、胸腺分化に関連する102個の遺伝子の解析)15.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58672/58672fig5large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

本論文では、三次元(3D)胸腺培養系により腫瘍抗原特異的誘導多能性幹細胞由来の甲状腺系(iTE)を生成する新しい方法について説明する。iTEは、増殖、記憶形成、腫瘍抑制の能力を有するナイーブT細胞と密接に関連するT細胞の均質なサブセットである。

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

3D胸腺器官培養によるiPSC由来の胸腺移民の生成は、腫瘍抗原特異的ナイーブ様T細胞の均質集団を再生する初のインビボ法である。主な利点は、iTEがより生理学的に関連しており、この方法は、より強力であり、その後、他のインビボ差動法は、常に特定のT細胞を生成する。iTEは、増殖、再改変、および生体内の腫瘍抑制の能力を含む、ナイーブT細胞様機能的表現型を有するCD8α-β抗属特異的T細胞の均質な動揺である。手順を実証することは、私の研究室のポストドクターラフィクルイスラムになります。OP9培地で37°Cで培養OP9/DLL1細胞を開始する。細胞が80〜95%の合流度に達したら、1つのXマグネシウム、カルシウム、フェノールレッドフリーPBSで1回洗浄します。ポイントゼロ5パーセントトリプシンの4ミリリットルを追加し、5分間摂氏37度でインキュベートします。その後、4ミリリットルのOP9培地とピペットを加えて、細胞層の関連付けを解除し、単一の細胞懸濁液を作ります。100マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して50ミリリットルの円錐形の管に細胞懸濁液を移す。300Gで遠心分離機、摂氏4度で5分間。吸引し、OP9培地の12ミリリットルで細胞を再懸濁します。次に、OP9/DLL1細胞懸濁液の2ミリリットルを新しい10センチメートルの細胞培養ペトリ皿にプレートします。OP9メディアを8ミリリットル追加します。この節を2~3日ごとに繰り返します。ゼロ日にトリプシン法により誘導多能性幹細胞を単一細胞懸濁液として収穫する。細胞と遠心分離機を摂氏4度で300Gで5分間回収します。上清を吸引し、OP9培地10ミリリットルあたり100,000細胞の密度でIPCを再中断する。その後、コンフルエントOP9 / DLL1 10センチメートル皿に100,000個の細胞をプレートします。5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベーションを続ける。3日目に古いメディアを吸引し、新鮮なOP9メディアの10ミリリットルに置き換えます。6日目には、10ミリリットルのPBSで各10センチメートルコンフルエントOP9皿を洗います。各皿にポイントゼロ5パーセントトリプシンの3ミリリットルを追加します。室温で3~5分インキュベートします。OP9培地を4ミリリットル加え、穏やかにピペットを使って細胞を採取します。100マイクロメートルの細胞ストレーナーと遠心分離機を通して300G、摂氏4度で5分間細胞を通過させます。その後、上清を捨てます。分化培地の10ミリリットルで細胞を再中断します。新しい10センチメートルOP9 / DLL1コンフルエント皿に細胞懸濁液をプレートします。5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベーションを続ける。9日目に、古いメディアを吸引し、新鮮な分化メディアの10ミリリットルに置き換えます。37°Cと5%のCO2で細胞をインキュベートし続けます。iPSCコロニーで心筋細胞が観察される11日目には、ピペットを使用して非接着細胞を機械的に切断する。100マイクロメートルの細胞ストレーナーと遠心分離機を300Gで、摂氏4度で5分間濾過します。この後、上清を吸引し、分化培地の24ミリリットルで細胞を再懸濁する。iPSCをコンフルエントOP9 /DLL1 6ウェルプレートにプレートします。5%の二酸化炭素で37°Cで細胞をインキュベートします。15日目に、非接着細胞をすべて採取し、40マイクロメートルの細胞ストレーナーを介してそれらをフィルタリングします。300Gで遠心分離機、摂氏4度で5分間。前述のように、非接着細胞を3~4日ごとに受け継ぎ続ける。DGWO治療の7日目に、4つの新しい10センチメートルの皿を取り出します。完全なメディアの20ミリリットルで各料理を埋めます。胸腺ローブを含むニトロセルロース膜のすべてを10センチメートル皿に移します。鉗子を使用して、個々のローブを膜から取り外し、媒体に沈めることを可能にする。常温で1時間、ローブをインキュベートします。その後、完全なメディアで新しい10センチメートルの皿に胸腺ローブを転送します。室温で1時間インキュベートする。この移管を繰り返し、さらに2回インキュベーションを行います。鉗子を使用して、胸腺ローブを皿に固定し、もう一方の手を使って中央に100〜200マイクロメートルの深部切開を行い、ローブの直径の半分を伸ばし、T細胞前駆物質をローブに移動させる。完全な分化培地で満たされた新しい10センチメートルの皿に胸腺ローブを移します。下層と上のレベルのグリッドを持つ3D培養プレートを使用する場合は、両方のグリッドに滅菌PPSを充填して、吊り下げ滴の蒸発と乾燥を防ぎます。次に、1つのDGWO処理された胸腺葉を含む完全な培地の30マイクロリットルを3D培養プレートの各ウェルに移す。OP9/DLL1 の共培養から非接着 T リネージ セルを収集します。そして、培地20マイクロリットル当たり2,000〜5,000T細胞系統細胞の密度で細胞を再懸濁する。T系統細胞懸濁液の20マイクロリットルを3D培養プレートの各胸腺葉に加えます。5分の二酸化炭素で摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、P200ピペットを30マイクロリットルに設定します。胸腺葉を取り巻くすべての細胞を取り除くために、各井戸にメディアを数回上下にピレットします。その後、各ウェルからメディアを吸引し、完全な媒体の30マイクロリットルを交換します。このプロセスを繰り返し、メディアを5~7回パイプ、除去、交換して、ローブに移行しない余分な未熟なT細胞を除去します。毎日25~30マイクロリットルのメディアを交換するように、ローブのインキュベートを続けます。4日目または5日目には、軽い顕微鏡を使用して、ローブの周りにiPSC由来の胸腺移民のハローの形成を確認します。ローブの中断なしにメディアをパイプすることで、iTEの毎日を収集します。メディアを毎日変更し、収集を約 12 日間継続します。収穫されたiTEは分子分析または生体内移植の実験に使用する準備ができている。本研究では、共培養された胎児の胸腺を切除し、iPSC由来のT細胞系系細胞が胸腺葉に移行できるかどうかを分析した。非播種対照葉は、内因性CD3陽性細胞に展開されたアストロサイト様胸腺上皮ウェブを特徴とする組織アーキテクチャを有する。しかし、iPSC由来未熟T細胞を播種した胸腺葉は、iPSC由来の未熟T細胞の葉への移行を示すCD3陽性単核細胞で再移植される。胸腺微小環境内に移行し、成熟するT細胞は、その後iTEとして出る。フローサイトメトリック解析は、様々な細胞の表型特性を検定するために使用されます。余分胸腺T細胞は、CD4、CD8ダブル陽性T細胞およびCD8アルファ単一陽性T細胞を陽性選択マーカーの発現なしに示し、一方、iTEはCD8α単一陽性MHCクラス1陽性T細胞表現型の均質集団であり、胸腺葉から出る前に陽性選択を経て正常な通過を示す。iTEは、同結合ペプチドに対して抗原特異性を有する。iTEは、核タンパク質として無関係なペプチドをプリロードした抗原提示細胞と共培養しても、サイトカインの細胞産生には見えない。しかしiTE共培養抗原提示細胞は、同結合ペプチドGP100でプリパルスし、TNFαインターロイキンiiとインターフェロンガンマを細胞内に産生する。開放型細胞培養はABSスロットに強く依存していることを覚えておいてください。生成されたiTEは、従来のT細胞で働く他のアッセイに使用することができる。例えば、T細胞清算アッセイ、サイトカイン産生アッセイ、生体内腫瘍退縮試験、T細胞分化試験、エトセトラ。この技術は、多くの免疫学的またはそのようなプロジェクトに適用することができます。T細胞分化、パルスタイミングT細胞成熟、ヘマトクリット前駆体または幹細胞からの抗原特異的T細胞の生成を含む。このビデオを見た後、視聴者は、3D胸腺臓器培養システムを使用して、誘発多能性、幹細胞由来、腫瘍抗原特異的胸腺移民を生成する方法を理解する必要があります。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

このビデオでは胸腺の文化を再集合させる2 -...

胸腺文化を再集合させる

人工多能性幹（iPS）細胞からTリンパ球の生成は、T細胞ベースの免疫療法のために胚性幹細胞を使用する代替アプローチを提供します。メソッドは、どちらを利用することによってことを示しています...

Tリンパ球に向かって誘導多能性幹細胞の分化の指示

ヒト化マウスを用いた腫瘍特異的T細胞の生成および特徴付けは、ここで説明されます。ヒト胸腺組織、遺伝子組み換えヒト造血幹細胞を免疫不全マウスに移植されています。抗腫瘍免疫応答の生体観察を可能に設計されたヒト免疫系の再構成でこの結果。...

幹細胞ベースの遺伝子治療腫瘍モデルとしてBLTヒト化マウスを用いた

このビデオでは、iPS細胞由来の未熟T細胞から、三次元胸腺培養システムを用いて機能的な抗原特異的T細胞を作製するプロトコールを実演しています。iPS細胞由来の未成熟T細胞を内因性リンパ球枯渇マウスの胎児胸腺葉と共培養した結果、T細胞の成熟に成功し、CD8αβ+ MHCクラスI+...

iPS細胞由来胸腺移民を作出する3次元胸腺培養システム

このビデオは、腫瘍抗原特異的人工多能性幹細胞(iPSC)由来のCD8αβ+ T細胞を生成するアッセイを示しています。腫瘍抗原特異的iPS細胞は、間質細胞単層上で増殖し、造血前駆細胞(HPC)に分化します。HPCは、分化培地を用いてCD4+...

人工多能性幹細胞からの単一陽性CD8 T細胞の生成

現在の2D培養システムはin vivoのシナリオを模倣していないため、in...

髄質胸腺上皮細胞の増殖、分化および無差別遺伝子発現を支える3D器官共培養モデル

このプロトコルの目標は、メラノーマ腫瘍浸潤リンパ球を人工多能性幹細胞に再プログラミングするためのプロトコルを示すことです。...

ヒトメラノーマ腫瘍浸潤リンパ球から誘導多能性幹細胞の生成

本稿では、OP9/DLL1共培養系を用いて機能性腫瘍抗原特異的人工多能性幹細胞由来CD8αβ+単陽性T細胞を生成する方法について説明する。...

腫瘍抗原特異的T細胞の生成にヒト誘導多能性幹細胞を用いた

ここでは、マウス腫瘍モデルにおける腫瘍固有および末梢由来腫瘍浸潤リンパ球の特性評価のための腫瘍移植プロトコールを提示する。フローサイトメトリーによるレシピエント由来免疫細胞の流入の特異的追跡は、抗腫瘍免疫応答中のこれらの細胞の表現型および機能的変化のダイナミクスを明らかにする。...

マウスにおける腫瘍浸潤CD8+ T細胞の動態を評価するための腫瘍移植

このプロトコルでは、マウス胸腺からのダブルネガティブ胸腺細胞の単離とそれに続くレトロウイルス形質導入、およびさらなる機能分析のためのデルタ様4発現骨髄間質細胞株共培養システム(OP9-DL4)での共培養について説明します。...

T細胞白血病における癌遺伝子研究のためのデルタ様4発現間質細胞上でのマウス胸腺細胞の共培養と形質導入

ここでは、胸腺上皮細胞(TEC)の成熟と長期維持、およびin...

三次元フィブリンハイドロゲルにおけるヒト胸腺オルガノイドの形成

学ぶ三次元胸腺培養システムを用いたマウスiPSC由来腫瘍抗原特異的胸腺移民の生成法。ナイーブT細胞様表現型を持つ均一なCD8陽性T細胞を産生し、腫瘍抑制能を有する細胞治療への応用が期待されます。

マウス誘導多能性幹細胞由来腫瘍抗原特異的胸腺移民を生成する三次元胸腺培養システム

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