ひと誘導多能性幹細胞由来血管内皮細胞 (による ECs) へ白血球接着の評価のためのマイクロ流体アッセイ

このステップ バイ ステップのプロトコルによる ECs で炎症反応の評価のためのデータ分析と生理学的流動場下における白血球接着の解析と実験のセットアップの詳細な説明を提供します。

この方法は、ヒト人工多能性幹細胞由来内皮細胞の機能性および炎症反応に関するヒト多能性幹細胞生物学分野における重要な質問に答えるのに役立つ。この技術の主な利点は、ヒト人工多能性幹細胞由来の内皮細胞に対する白血球接着の評価のための実験的なセットアップおよびデータ分析の詳細な説明を提供することです。マイクロ流体チップコーティングの場合、10センチメートルの滅菌ペトリ皿に無菌バイオチップを入れ、10マイクロリットルのピペットチップを使用して、作りたてのフィブロネクチン作業溶液を10マイクロリットルずつバイオチップの各チャネルに注入します。

ペトリ皿を覆い、加湿したチャンバーに摂氏4度で一晩置きます。翌朝、バイオチップを摂氏37度インキュベーターで予熱し、新鮮な内皮細胞血清フリー培地で所望の濃度で80〜100%コンフルエント細胞培養から採取したヒト誘導多能性幹細胞由来内皮細胞を再懸濁した。次に、フィブロネクチン溶液をマイクロ流体チップの全てのチャネルから吸引し、細胞を十分に混合して均質な細胞懸濁液を得た後、10マイクロリットルのピペットチップを使用して各チャネルに6マイクロリットルの細胞を注入する。

バイオチップを顕微鏡で調べ、細胞が高い細胞密度で均一に分布していることを確認します。摂氏37度で15分後、各チャネルの両側にある培地貯留層に40マイクロリットルの内皮細胞無血清培地FULLを加えます。そして、1時間インキュベーターにバイオチップを戻します。

次に、さらに50マイクロリットルの内皮細胞無血清培地FULLを各チャネルの両側の貯留層に加えます。シードセルのライブイメージングでは、マイクロ流体セットアップの準備が整い、ライブイメージングチャンバーが37°Cまで平衡化され、CO2レベルが5%に達したことを顕微鏡チップホルダーに取り付け、チップホルダーを顕微鏡イメージングステージに取り付けます。マニホールドを介してバイオチップをポンプに接続するには、8ピンアダプタをチップの出口貯留層の近くに置き、ピンを完全に接続せずにメディア内のすべてのピンを深めます。

マイクロ流体ポンプソフトウェアで、洗浄/チップに接続を選択し、アッセイステップの実行をクリックして、各ピンを通して30マイクロリットルのRPMI培地を分配します。その後、8ピンアダプタをバイオチップの出口に挿入します。ピペットを使用して、バイオチップのすべての入口貯留層から手動で媒体を吸引し、ウォッシュアウト/チップウォッシュアウトとランアッセイステップを選択して、40マイクロリットルの内皮細胞血清フリー培地で一度に1つのチャネルをパーフューズして死んだ細胞や破片を除去します。

すべてのチャネルが洗浄されると、目的のチャネルの入口貯留層からの培地を、RPMI培地中のミリリットル濃度当たり6細胞に2.5倍10倍に希釈したヒト白血球の100マイクロリットルに置き換える。「セルアッセイ/ステップの説明」および「現在のチャネル/ステップの説明を設定」をクリックし、対象チャネルをオンに設定し、他の7つのチャンネルを「オフ」に設定します。

入口貯留部の残りの白血球を完全なRPMI培地の100マイクロリットルに交換してください。そして、細胞アッセイステップの説明と実行アッセイステップをクリックして、チャネルをRPMI培地で5分間パーフュージョンして、非接着白血球を除去します。次に、チャネル内の少なくとも3〜4つの異なる位置から画像を取得し、接着された白血球を可視化する。

接着白血球を定量化するには、CellProfiler 画像処理ソフトウェアを開き、数白血球パイプラインファイルをインポートします。[入力モジュール] で [イメージ] を選択し、添付白血球の生画像を含むフォルダを [ファイル] リスト ウィンドウにドラッグ アンド ドロップします。[解析モジュール]で[主オブジェクトを識別]を選択し、接着白血球の最小直径と最大直径をピクセル単位で示します。

[解析モジュール] で[フィルタ オブジェクト]を選択します。次に、フィルタリング条件を選択し、オブジェクトの最小許容領域をピクセル単位で入力し、[画像の分析]をクリックして解析を開始します。最適ヒト誘導多能性幹細胞由来内皮細胞解離は、細胞塊を含まない単一細胞懸濁液をもたらすべきである。

典型的には、注入後15分で内皮細胞がチャネルの底部に付着し、広がり始める。注入の1時間以内に、内皮細胞は、フローアッセイで使用する準備ができている時点でチャネル全体に十分に広がる単層を形成するべきである。実証された無料のオープンソース画像処理ソフトウェアを使用すると、最小の領域に基づいて特定されたオブジェクトをフィルタリングし、細胞の破片、自己蛍光、またはその他の非特異的蛍光シグナルなどの誤って識別されたオブジェクトを除外することができます。

この手順を試みる間、炎症を起こして炎症を起こさせるサイトカインを用いて刺激を最適化し、陽性の対照として初代ヒト臍帯静脈内皮細胞を含める事が重要である。一次哺乳類の細胞および細胞株を使用することは非常に危険であり、実験室のコート、手袋、目の保護を着用するなどの予防措置は、常にこの手順を実行している間に取られるべきであることを忘れないでください。