3 D プリントのための新規プロセス脱行列
January 7th, 2019
このプロトコルでは、埋め込まれたポリ乳酸 (PLA) 微粒子構造組織構造 3 D プリントの脱行列 (DM) を含むポリカプロラクトン (PCL) フィラメントの生産について説明します。
この方法は、組織設計足場のための構造合成物および生物学的成分の両方の共同印刷を可能にする。これらの足場は、より正確にネイティブ組織環境を複製することができ、培養細胞にとって有益であり得る。この技術の主な利点は、組織工学のためのオールインワン技術で足場内にカプセル化された生物学的材料を損傷することなく機械的に健全な構造を印刷できることです。
目的のマトリックスをカプセル化したマイクロスフィアを作製します。これらの微小球は、ブタの後肢から脱細胞化軟骨で作られた。彼らはサイズが異なります。
ふるい機械と一緒に、均一なサイズの微小球を得る。3つのふるいトレイが使用前に十分に洗浄され、乾燥されていることを確認します。上に大きいメッシュトレイ、中央に小さいメッシュトレイを使用して、ふるいシェーカーを組み立てます。
ふるい鍋を底に置きます。一番上のトレイに乾いた微小球を入れる。次に、トレイに蓋を置きます。
8〜10分間の粗いふるい。その後、8〜10分間細かいふるい。待っている間、ふるいにかけた球体のための計量紙を配置します。
ふるいが完成したら、ふるいトレイを慎重に取り外します。トレイを重量紙の上に逆さまに置きます。側面を軽くタップして、球体の大部分が落ちないようにします。
すべてのふるい板を計量紙の上に空にして、特大の小さい球体を捨てます。残りの球は、以降のステップで使用する正しいサイズを持っています。これらの球をラベル付きの遠心管に配置します。
必要になるまでチューブを摂氏20度冷凍庫に保管してください。フィラメント材料を作るのに必要な材料の重量を量る。少なくとも25グラムの微小球を含むポリカプロラクチン粉末に対する微小球の1対4の重量比を作る。
粉末混合物をミニチュアローリングミキサーに移します。粉末を毎分20回転で5分間混ぜます。5分後、回転を停止し、コンテナを反転させます。
その後、さらに5分間20rpmで混ぜます。続行するには、押出機とスプーラのセットアップに混合物を取ります。押出機を設定して、その出口がスプーラの入口から約60センチメートルになるようにします。
次に押出機発熱体で、絶縁ジャケットがないことを確認してください。押出機とスプーラの中間にデスクトップファンを置いて押出しを冷却します。暖房ジャケットの近くに別のファンを置き、周囲の空気でそれを冷却します。
次に、適切なノズルが押出機に取り付けられていることを確認し、発熱体温度を設定します。冷却ファンを起動し、機器が安定した状態に達することを許可します。20〜30分後、マイクロスフィアPCL混合物を取得し、押出機ホッパーを充填します。
スプーラーと押出機のオーガーをオンにしてフィラメント押出を開始します。鉗子を使用し、手動で最初の押し出しフィラメントを引っ張ります。フィラメントをフィラメントスプーラーに供給します。
押し出される時、フィラメントを観察してその組成を識別する。しばらくすると、フィラメント組成物が望まれる均一に見える。フィラメントの周りにテープを巻き付け、均一な領域の開始をマークします。
スプーラローラーの向こう側に、フィラメントの直径を監視します。直径が目的の1.75 mmに近いかどうかをテストするために、キャリパーを使用します。必要に応じて、スプーラと押出機の速度と温度を調整します。
フィラメント径を調整するには、まずスプーラと押出機の速度を変更します。押出機の温度を変更することもできますが、通常は必要ありません。ホッパーを補充し、粉末がすべて使用されるまで押し出しを続けます。
ホッパーがほとんど空のとき、PCL粉末をホッパーに加え、微小球混合物を洗い流します。PCLパウダーを添加しながら押出を監視します。最初は、微小球は押し出し中にまだ見えます。
最終的にマイクロスフィアが見えない場合は、PCL の追加を停止します。フィラメントを所望の濃度でマイクロスフィアで分離し、ラベルを付けます。ホッパーに最小限の粉末がある場合は、押し出しを停止し、機器をオフにします。
フィラメントは、標準的な融合蒸着モデリングプリンタで使用できます。フィラメントを、所望の直径のノズルを取り付けたプリンタに積み込みます。モデルをロードした状態で、印刷の温度と直線速度を設定し、フィラメントの堆積を開始します。
カスタムフィラメントは、層によって層に堆積される。最初のレイヤーに特別な注意を払い、必要に応じて設定を調整します。これら2つの3Dプリントされた足場は、このスケールでは区別するのが難しいです。
一方はポリカフララクチンを含むフィラメントを有し、PCLのみである。もう一つは、ポリ乳酸および脱セル化マトリックスの埋め込みマイクロスフィアを有するPCLフィラメントを有する。走査型電子顕微鏡を用いて見ると、PCLのみの足場はほとんど滑らかに見える。
対照的に、他のフィラメントについては、PCLに埋め込まれた微小球がサンプル全体に見える。この手順を試みる際には、大小球または小小球が押出機の材料の流動態に影響を与える可能性があることを覚えておくことが重要です。このため、使用前にマイクロスフィアを適切に準備してください。
廃棄物を最小限に抑えるために、より小さなバッチをより頻繁に作成するのではなく、すべての実験に必要なフィラメントの大きなバッチを1つ作成することをお勧めします。フィラメント生産の専門知識は、時間の経過とともに来ます。この手順に従って製造された足場は、他のバイオプリント足場と比較して強化された誘導および機械的強度に関する追加の質問に答えるために、インビトロおよびin vivoをさらに評価することができる。
その開発後、この技術は、組織工学の分野の研究者が3D足場内の脱細胞化されたブタマトリックスの逆起性誘導を探求する道を開いた。小さな微粒子を扱う作業は、呼吸器系の危険を引き起こす可能性があることを忘れないでください。この手順の間に小さな粒子状マスクを着用することが奨励されます。
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概要
このプロトコルは、組織工学的スキャフォールドを作成するために構造的合成物と生物学的構成要素を共同印刷する方法を説明しています。これらのスキャフォールドは、培養細胞に利益をもたらす、より正確にネイティブ組織環境を再現することができます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 組織工学
- 3Dプリンティング
- 生体材料
背景
- 細胞除去マトリックス（DM）は、スキャフォールドの機能性を向上させるために使用されます。
- ポリカプロラクトン（PCL）とポリ乳酸（PLA）は、スキャフォールド生産の重要な材料です。
- マイクロスフェアは、生物学的材料を損傷することなくカプセル化することができます。
- この技術により、スキャフォールドに機械的および生物学的特性の統合が可能になります。
研究の目的
- 機械的に安定した組織工学的スキャフォールドを生産すること。
- 細胞培養を強化するために細胞除去マトリックスをマイクロスフェア内にカプセル化すること。
- 1つの印刷プロセスで構造的および生物学的構成要素を組み合わせる方法を開発すること。
使用された方法
- 埋め込まれたPLAマイクロスフェアを含むPCLフィラメントの生産。
- ブタの後肢からの細胞除去軟骨の使用。
- スキャフォールド製造のための3Dプリンティング技術。
- マイクロスフェアのサイズと特性の特徴付け。
主要な結果
- 構造的完全性を維持するスキャフォールドを成功裏に作成しました。
- 生物学的材料を効果的にカプセル化する能力を示しました。
- スキャフォールド内の改善された細胞培養条件を示しました。
- 複雑な組織工学的構造を生産する手法を検証しました。
結論
- この方法は機能的な組織スキャフォールドを作成する可能性を高めます。
- 共同印刷技術は合成材料と生物学的材料の間のギャップを埋めることができます。
- 将来の応用には再生医療と組織修復が含まれる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Integrating decellularized matrices within 3D-printed scaffolds enables the creation of tissue-engineered constructs that combine mechanical integrity with biologic functionality. This approach addresses a critical challenge in early discovery and preclinical research by preserving bioactivity during fabrication, supporting predictive confidence in tissue modeling. The method positions bioprinting as a platform for developing disease-relevant systems and advancing translational biomaterials research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell-matrix interactions in a controlled 3D environment.
- Supports functional validation of biomaterial cues for progenitor cell behavior.
- Facilitates mechanistic de-risking by preserving biologic agent activity during scaffold fabrication.
- Improves predictive confidence in tissue engineering hypotheses.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible 3D scaffolds for downstream cell-based assays.
- Enables quantitative comparison of scaffold surface features and cell responses.
- Supports assay scalability and platform reuse for compound or biomaterial screening.
- Prepares validated biological systems for reliable evaluation of regenerative cues.
Translational & Preclinical Research
- Aligns scaffold composition with disease-relevant tissue environments for translational studies.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of tissue repair strategies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by maintaining biologic function in constructs.
- Facilitates in vitro and in vivo assessment of scaffold performance.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery, assay development, and preclinical research by enabling the fabrication of biologically active, mechanically robust 3D scaffolds.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cell-matrix interactions and biological de-risking.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative scaffold outputs for assay readiness.
- Analytics: Provides measurable surface features and composition for comparative analysis.
- Translational Research: Maintains functional biomaterial cues for preclinical model alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for diverse tissue engineering applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence and target validation in tissue engineering.
- Operational Value: Standardizes scaffold production with reproducible and scalable outputs.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk and supports efficient go/no-go decisions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of regenerative medicine programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomaterials processing and 3D printing instrumentation.
- Demands analytical infrastructure for scaffold characterization and quality control.
- Necessitates cross-team standardization of microsphere preparation and extrusion parameters.
- Adaptation may be needed for different tissue types or biologic agents.
- Proper handling of particulates and batch scaling are essential for reproducibility and safety.
