生体内でシルク/AAV 膜を用いた光遺伝学的タンパク質の発現

この方法は、システム神経科学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。ニューロンアンサンブルの活動が脳内の感覚と認知処理をどのようにサポートしているかなど。この技術の主な利点は、別のウイルス注射手順を必要とせずに、関心のある脳領域にチャンロドプシンやGCaMPのような光遺伝学的タンパク質の正確な標的化を容易にすることです。

この方法の視覚的なデモンストレーションは、シルクとウイルスを小さな光学インプラントに堆積させ、再現性のある結果を達成するためにいくつかの練習を行うことができるので、非常に重要です。まず、解凍したAAVと5~7ポイントの5%のシルクフィブロイン水溶液を200マイクロリットルPCRチューブに1~1の比率で混合します。溶液を数回出入りして軽くピペットし、AAVとフィブロインを十分に混合します。

シルク/AAVを堆積させるために、作られる繊維インプラントの数に必要な溶液の量に加えて、ピペットの詰まりによる損失を収容するために約30%の余分な注入ピペットをロードする。次に、フェルールホルダーをマイクロインジェクターを装備した立体化装置に取り付けます。フェルールホルダーをマイクロインジェクターの上に置き、シルク/AAV混合物を下から塗布します。

光ファイバー表面の中心に触れたり、触れそうになるまで注入ピペットを操縦し、シルク/AAV溶液の10〜20ナノリットルを排出します。その後、ピペットを撤回します。次に、約1分以内に平らなフィルムに乾燥する液体ドームとして現れる平らな表面にシルク/AAVのボーラスを観察します。

必要な量のシルク/AAVが堆積するまで、上記の手順を繰り返します。複数のインプラントを準備する場合は、シルク/AAV溶液を1つのインプラントに塗布し、最初に戻る前に他のインプラントをコーティングする。1時間の乾燥の後、フェルールホルダー全体を真空チャンバーに入れ、約125トルと摂氏4度で一晩真空乾燥します。

翌日、高出力顕微鏡で得られたシルクフィルムの形状と位置を評価する。フィルムが光ファイバ表面の先端に閉じ込められ、比較的薄く、対称であることを確認します。テーパー光ファイバーをコーティングする場合は、テーパの始めに光ファイバの側面にシルク/AAV注入ピペットを配置し、ピペットが光ファイバに触れていることを確認します。

シルク/AAVを20ナノリットル排出してコーティングプロセスを開始し、液滴が光ファイバに付着し、繊維とピペットの界面に残ることを保証します。絹/AAVが乾燥するにつれて繊維先端の端に向かって液滴をそっと拭き、ピペット先端を詰まらせないように注入ピペットを乾燥液滴に接触させておきます。最初のボーラスがほぼ完全に乾燥したら、別の20ナノリットルを排出し、テーパーに沿って液滴を吸い続けます。

少量の絹/AAVを排出し、溶液をテーパの側面まで徐々に乾燥させることで、前のステップを繰り返します。乾燥後、高出力顕微鏡で得られたシルクフィルムの形状と位置を評価する。GRINレンズインプラントをコーティングする場合、GRINレンズインプラントにシルク/AAVを1回の注入で堆積します。

乾燥後、高出力顕微鏡で得られたシルクフィルムの形状と位置を評価し、フィルムがレンズの表面を覆っていることを確認します。ガラス頭蓋窓をコーティングする場合は、シルク/AAVの5マイクロリットルの液滴を3ミリメートルの丸いカバースリップの表面に手ピペットし、液滴がガラス表面全体を覆うために広がります。乾燥後、シルク/AAVコーティングされた光ファイバーを冷却真空デシケータに125トール、4°Cで保管してから、デバイスを埋め込みます。

蛍光性蛍光性蛍光体は、シルク/AAV膜の発現の程度を測る指標となり、一般的な光ファイバーは200ナノリットルのシルク/AAVを容易に収容できる。実験者は、移植された繊維の先端のまわりで信頼性の高い表現を達成できる。塗られた頭蓋窓の2つの問題は、表現が不十分であり、溶解に失敗し、視野をあいまいにするシルクフィルムである。

発現を増加させるために、デュレトミーは、窓を移植する前に行うことができる、および/またはフィルム内のウイルスの量を増加させる。最良の発現は、それぞれシルクとストックタイターAAVの1〜4混合物を使用して達成された。コーティングされた窓のシルクの量は、繊維インプラントよりも10〜100倍多く、フィルムは組織に埋め込まれにくいため、シルクフィルムを溶解できる同じレベルのタンパク質分解活性にさらされない可能性があります。

しかし、いくつかのシルクの存在は、ウイルスだけで作られた膜が手術中に間質体によって洗い流されるため、窓の下であなたの表現を達成するために不可欠です。この手順を試みる間、シルクコーティングされたインプラントを準備し、私たちが記述する方法で保管することが重要です。不適切な貯蔵は、シルクフィルムの特性を変化させるか、またはウイルス発現ベクターの有効性を低下させる可能性がある。

この技術は、神経系の神経科学分野の研究者にとって、マウス、ラット、さらには非ヒト霊長類などの哺乳類の脳内で神経活動がどのように感覚的および認知的処理を促進するかを探求するのに大きな有用性である。ウイルス発現ベクターを使用すると、手袋、ゴーグル、ラボコートなどの危険で個人的な保護具が常にアデノ関連ウイルスで作業している間は着用する必要があります。