Name: 神経科学の TEM セクションをサンプリングの公平なアプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 学ぶ 透過型電子顕微鏡を用いた脳組織の公平なサンプリング手法。自動化されたワークフローによりシナプス密度の定量的解析を効率化し、神経科学研究の再現性と精度を向上させる革新的なプロトコルです。

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<li>Rampon, C., Tang, Y. P., Goodhouse, J., Shimizu, E., Kyin, M., Tsien, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+induces+structural+changes+and+recovery+from+nonspatial+memory+deficits+in+CA1+NMDAR1-knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enrichment induces structural changes and recovery from nonspatial memory deficits in CA1 NMDAR1-knockout mice.</a> Nature Neuroscience. 3 (3), 238-244 (2000).</li>
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</ol>

著者が明らかに何もありません。

ここに示すワークフローでは、研究者は公平な方法で超微細構造の機能でデータを取得できます。これは連続切片からボリューム調査より大いにより少なく時間のかかるです。複数の異なるアプリケーションは、この目標を達成するために使用されます。最初は、当社のカスタムメイドのRPSのソフトウェア (可用性の詳細については、対応する著者までご連絡ください) が用いられるサンプリング領域の座標を選択するランダム ステージ シフトを導入します。これにより、投資収益率の体系的な均等にランダム サンプリング。次に、特定の構造をカウントするため我々 は以前研究13,14,15従来に比べて斬新な方法で、既知の距離と 2 つの連続したセクションの比較、disector メソッド、適応の体系的な均等にランダム サンプリングのカスタムメイドの RPS ソフトウェア。これは連続切片からボリューム全体を 3 D 再構成と比べて時間を節約できます。カスタムメイドの RPS ソフトウェアはワークフローを再現するための制限要因である顕微鏡の種類用に特に開発します。この特定のソフトウェアからの代替をスクリプトことができます、他の機種と互換性のあるアプリケーションとなります。
我々 は正常に私たちの比較研究4、5のこのアプローチを使用しました。神経組織の超薄切片の関心のある領域を説明した、このエリア内で体系的な均一ランダム サンプリングによる撮影を行った。利子海馬歯状回の多形層の領域が我々 のアプローチに有益なことを調査するためではなく小さな領域をあることに注意する必要があります。ランダムに配置された disector 内 DCV の数を評価し、, アダルト NPY ノックアウト マウスとマウス SE EE と大人 WT 入って成体マウスの DGpl におけるシナプスの微細構造機能がいくつか.我々 のアプローチを使用して、収集したデータは、調査のパラメーターのいくつかの変化を示した。これらの調査結果は、幼若動物2の他の同様の研究からのものを確認しました。
このワークフローの実験的使用法の欠点は、ユーザーが (私たちの場合は、ユーザー インターフェイス、TEM シリアル セクションで異なるユーザー インターフェイスに慣れる必要があると、このマルチ アプリケーション アプローチは利便性の面で理想的なないことかもしれません、RPS のソフトウェア、および SerialEM ソフトウェア)。効率的な方法ですべてのアプリケーションを扱うことを学ぶ時間がかかるは、考慮する必要があります。ただし、このワークフローを使用する方法の学習に時間を投資はまだ明確に有利なシリアル断面 TEM 全体ボリュームを分析に必要な時間をかけて。関心のある分野の体系的な均一ランダム サンプリングによって配置 disector を使用しての方法は、セクション/ボリュームの高い金額を調査することがなく信頼性の高いデータ1を提示すれば十分です。
私たちの研究の結果を最大にするには、だったサンプル準備中に良い世話をする重要な組織と構造の保全は関心のある領域を明確に識別するためにも、構造の機能を評価するために重要ではないです。極めて重要な要因、おそらくこのメソッドの欠点は超薄切片のペアの高品質が必要である: 必要があります穴やしわ、セクションのいずれかでの調査で領域をカバーして切片厚がある必要があります同質を維持しました。研究者は、よく訓練された超でなければなりません。ケアは、イメージング、TEM のセクションのセクションの電子線照射損傷に敏感であるし、容易に引き裂くことができるときに取られるもあります。さらに、投資収益率のサンプリング領域の適切な数を選択することが重要です。実験の目的に応じて電子顕微鏡の倍率は慎重に設定します。実験の具体的には、中枢神経系のシナプスを数える 30.25 μ m2の領域に 1 つのセクションの利子の 20 地域が最適。信頼性の高い結果を得るため (当社の場合シナプス、シナプス機能と DCV) で、問題の機能を認識し、人材育成をお勧めします。シナプスを識別するためにシナプスの小胞を識別する必要があります、これは少なくとも 10 の解像度を必要とする nm。このため、5000 X の倍率は最適なだが、倍率が種類やカメラの位置などハードウェアのパラメーターに依存し、他の顕微鏡やカメラの種類について、適合する必要がありますに注意します。プロトコルが 1 つの TEM に固有のアプリケーションを使用することと、他のモデルとユーザーがセットアップの違いを考慮することを明記しています。
当社のワークフローについて、適合できるだけでなく神経科学、生物科学、また物質科学の幅広い分野で他の多くのアプリケーション (電子顕微鏡の高分解能が必要な) 場合研究の質問は、体系的な制服が要求されたときと考えていますランダム サンプリングと試料の量は、分析の時間の効率的な方法を求めています。たとえば、現在ヒトの脳における鉄店のローカライズに興味を持っております。このため、我々 は最近ランダムに選択されたエリアの超薄切片の元素分析を有効にする、私たちのワークフローを適応しています。ワークフローに必要なアプリケーションの数を最小限にするため事前ランダムに選択することができますポイントを設定する段階を移動するプログラミング可能であるのでだけ、SerialEM ソフトウェアを使用してを適用する目的とします。ワークフローを完全自動化することを目的に、TEM を制御するための独自のスクリプトを作成しました。これは満足のいく結果に至らなかったフィルターの画像モードでオート フォーカスを除いて可能な証明。したがって、焦点を当て、エネルギー フィルター画像を得る DM のソフトウェアを使用しました。
要約すると、公平な方法で電子顕微鏡像を得ることに支援するソフトウェア ソリューションを紹介します。

電子顕微鏡のサンプル セクション内の代表的な領域への挑戦です。、、オブザーバーとしてしばしば偏っているサンプルでは、顕著な特徴によって私達の注意に描かれた特定の地域を見ても分散、公平なサンプリングを防止します。関心領域のすべての部分は、電子顕微鏡写真1で終わるのと同じチャンスを取得する場合、サンプリング バイアスを回避のみことができます。どこにステージを停止、サンプリング領域を選択するために、画像を見もせず手動で顕微鏡のトラック ボールを押すことによってソフトウェア ソリューションなしサンプリング バイアスを避けるために不可能です。厳密に言えば、これは意識的にあるいは無意識のうちに、ユーザーは、ステージの動きに影響を持つことができ、また、これはサンプリング領域を選択するの洗練された方法ではありませんので、ランダムなプロシージャではありません。ランダム サンプリングはステレオロジー1セクション、離れた既知の距離のペアを必要とするため、ある特定の容積、たとえば、構造体の数を評価するためにセクションの組み合わせを使用する場合に特に重要になります。構造が非常に小さい場合を除きのより大きい構造の分布密度を過大評価する捜査官アプローチではこの傾向しますが、また 1 つのセクションだけを見るし、特定の構造2の数を推定することが可能になります。切片厚を比較。別のアプローチは、連続切片から組織のボリュームを再構築し、従って目的のデータ3を得るが。しかし、これは非常に時間がかかり、(大きい) の比較研究可能なアプローチしません。
これらの問題を克服するためには、超薄切片内で定期的な間隔で電子顕微鏡写真を取得するためのサンプルを自動的に選択する研究者を可能にするワークフローを開発しました。電子顕微鏡写真の位置はランダムで、公平なサンプリングを可能です。アプローチが適して両方の構造 (たとえば、ある神経ボリューム4,5内シナプス) の数値の密度と構造の機能 (たとえば、幅シナプス間隙の寸法を決定するためまたはシナプス後密度4、5の直径)。
ワークフローでは、サンプリング (RPS) のソフトウェア (スクリプト ソフトウェアは我々 の顕微鏡に付属を使用して Java スクリプトで書かれた) 超薄片への関心の定義済み領域内のグリッドの位置を自動的に計算するカスタムメイドのランダムな点を使ってください。RPS ソフトウェアは、電子顕微鏡写真は、各ポイントで行うことができますので、電子顕微鏡のステージをこれらのあらかじめ定義されたポイントに移動します。まず、ユーザーは関心薄いセクション内の領域を定義します。次に、RPS のソフトウェアは、この領域内のグリッドの位置を計算します。X/最初の位置の y 座標をランダムに作成され、残りの位置は、最初の位置に点で通常のグリッド間隔で配置されます。関心領域のすべての部分は検査対象の同じチャンスがあるのでこれは最小限のデータ コレクションを実行できます。サンプリングのこのアプローチは組織的均等にランダム サンプリングとも呼ばれます (を参照してください詳細については、6、7を参照)。
構造物の数値の密度を決定するため、離れた既知の距離にあるセクションのペアで取り組んでいます。電子顕微鏡写真を所定の位置の 1 つの最初のセクションから取得後、電子顕微鏡連続切片ソフトウェア (私たちの電子顕微鏡に付属しているソフトウェア パッケージの一部) を移動 2 番目のセクションの対応するポイントに対応する位置の電子顕微鏡写真を取得します。定義済みのグリッド内のあらゆる場所にこれを繰り返します。我々 のアプローチで、disector を使用して、電子顕微鏡写真8,9の各ペアの粒子数をカウントします。Disector は、カウント フレーム各セクション8,9の 1 つのペアで構成されます。オブジェクトの分布密度のみ表示されるオブジェクトをカウントすることによって決定されます最初のセクション (または参照セクション) はなく、2 番目のセクション (または参照セクション)。これにより、高速かつ効率的な方法8,9内のオブジェクトの数値の密度を推定します。さらに 1 つのセクションに二次元の構造的特徴を測定できます。
豊かな環境 (EE) 住宅住宅条件4、5、標準的な環境 (SE) と比較して条件にさらされたマウスの海馬のシナプス数の違いを評価するために正常にこのワークフローに用いています。また野生型 (WT) マウスと神経ペプチド Y(NPY) KO マウスの微細構造の違いを評価する SE と EE5の下で続けた。我々 の目標を見ていた具体的数値のシナプス密度などのニューロンの構造的特徴断面にアクティブなゾーンとシナプス後密度、シナプス間隙とシナプス小胞の数の幅の長さために神経接続と異なる実験条件の間活性化の変化を評価します。さらに、特定の脳領域のストアドの神経ペプチドの量を決定するニューロンの芯小胞 (DCV) の分布密度に関心がありました。
次の手順では、上記で説明した研究の取り組みの成功に基づいて人間の脳のサンプル内の公平な元素分析の領域を選択する私たちのワークフローを適応しています。これは、イメージの鉄は、フェリチン分子神経細胞とグリア細胞の両方に格納されます。このため、我々 は定義された領域内の脳のセクションのランダムなスクリーニング プロセスの操作のほとんどを自動化できるスクリプトをコンパイルしました。

<table><tbody><tr><td>ペントバルビタール</td><td>SigmaAldrich</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>メルク</td><td>1040051000</td><td>1kg</td></tr><tr><td>グルタルジアルデヒド</td><td>サイエンス サービス</td><td>E 16210</td><td>25%; 100ml;EMグレードの</td></tr><tr><td>カコジル酸緩衝液</td><td>メルク</td><td>C4945</td><td>250g;ジメチルアルシン酸ナトリウム三水和物</td></tr><tr><td>チオニンアセテート/セリステイン</td><td>メルク</td><td>861340</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>メルク</td><td>1000631000</td><td>1 L</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>メルク</td><td></td><td>1064951000 1 kg、ペレット</td></tr><tr><td>四酸化オスミウム</td><td>サイエンスサービス</td><td>E 19110</td><td>10x1g</td></tr><tr><td>TAAB 包埋樹脂</td><td>サイエンスサービス</td><td>TAT001</td><td>500g</td></tr><tr><td>DMP-30</td><td>Science Services</td><td>TAD024</td><td>100g</td></tr><tr><td>DDSA</td><td>Science Services</td><td>TAD025</td><td>500g</td></tr><tr><td>酢酸ウラニル二水和物</td><td>Plano GmbH</td><td>19481</td><td>枯渇、25g</td></tr><tr><td>Ultrastain 2</td><td>Leica</td><td>16707235</td><td>クエン酸鉛</td></tr><tr><td>トルイジン ブルー溶液</td><td>寒天 Scientific</td><td>AGR1727</td><td>10g</td></tr><tr><td>ピオロホルム</td><td>Plano GmbH</td><td>R1275</td><td>10g 粉末</td></tr><tr><td>プロイレンオキシド</td><td>SigmaAldrich</td><td>82320-1L</td><td>1L</td></tr><tr><td>DPX 埋め込み媒体</td><td>Plano GmbH</td><td>R1320</td><td>スライドガラス上の半薄切片用埋め込み媒体、50 ml</td></tr><tr><td>ビブラートーム、ライカ VT 1000</td><td>ライカ マイクロシステムズ、ウィーン、オーストリア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライカ ウルトラカット UCT、ウルトラマイクロトム</td><td>ライカ マイクロシステムズ、ヴェッツラー、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai G2 20</td><td>FEI、アイントホーフェン、オランダ</td><td></td><td></td></tr>メガ<tr><td>ビュー広角カメラ</td><td>Olympus Soft Imaging Solution、M&uuml;nster, ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>US 1000 デジタルカメラ</td><td>Gatan, Pleasanton, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM Imaging Analysis Software</td><td>FEI,Eindhoven, Netherlands</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FEI Serial Section Software</td><td>FEI,Eindhoven, Netherlands</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji, ImageJ 1.52e</td><td>National Institute of Health, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPSS 20.0</td><td>SPSS Inc., Chicago, IL,コロ</td>ラド大学の米国<td></td><td></td></tr><tr><td>SerialEM</td><td>リージェント</td>RPS(ランダムポイントサンプリング)ソフトウェア0.9aカスタムメイドDisector v1.0.2(ImageJマクロ)カスタムメイドEFTEMSerialEM(SerialEMスクリプト)カスタムメイド<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

神経科学の tem セクションをサンプリングの公平なアプローチ

An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience

ニューロンとそのシナプスの微細構造の機能の調査のみ電子顕微鏡観察で可能です。特にため、このような特徴量の分布密度の変化の比較研究、公平なサンプリング プロトコルは、信頼性の高い結果に不可欠です。脳のサンプル画像の獲得のためのワークフローを紹介します。ワークフローが定義されている脳領域内で体系的な均等にランダム サンプリングを可能にし、disector を使用して画像を分析することができます。この手法は連続切片の広範な検査よりもはるかに高速ですが、まだ密度と微細構造の特徴量の分布を推定する実現可能なアプローチを提示します。埋め込み、前にステンド グラス vibratome セクションは調査、全体的な試料準備を助けた速度の処理中の脳の領域を識別するために参照として使用されました。このアプローチは、マウス脳におけるいくつかの微細構造パラメーターで濃縮住宅環境の効果を調査し、比較研究のために使用されました。脳試料の元素分析を目的として適応したワークフローの使用の成功に基づいて、我々。我々 はユーザーとの対話の時間の面でプロトコルを最適化されています。オープン ソース ソフトウェア SerialEM 用のスクリプトをコンパイルすることによってすべての時間のかかる手順を自動化することにより、元素マップを取得の主な仕事に集中するユーザー。元のワークフローと同様に、信頼性の高い結果を保証する公平なサンプリング アプローチに着目。

ここでは、透過電子顕微鏡用自動かつ公平な方法で領域を選択するワークフローについて述べる。ユーザーは、電子顕微鏡の下で極薄セクション内で関心のある分野を選択し、領域内の 20 のサンプリング領域の座標を自動的に計算する私たちのRPSソフトウェアを含むワークフローのいくつかのソフトウェア ソリューションを使用して関心します。その後、TEM ステージは、写真の各サンプリング領域に移動されます。これセクションの一つを分析してセクション、捜査官のバイアスのないイメージングのための領域を選択することができます既知の距離を離れてのペアを分析するための両方可能です。
このワークフローは、マウスの脳のセクション4、5の微細構造の機能を文書化するときに貴重な証明しました。これらの研究では関心のある領域として海馬歯状回 (DGpl) の多形細胞層を調べた。超薄片に収まる背 DG (前 −1.3) の冠状断面とその輪郭が低倍率で容易に認識されるので、DG を調べるに適した手法を証明しました。他の頭脳領域を検討するなら、彼らのサイズおよび実験を計画する前に特徴を確認することが重要でしょう。
ここで説明したワークフローを適用する EE 住宅が大幅では DGpl4、標準的な住宅事情を尊重し、シナプス間隙の幅を増加することを示した。また、EE 収容動物4、神経ペプチドの世帯の変化を示すは密中心の小胞の数が低下しました。WT と NPY のノックアウト マウスは、EE の条件の下で保たれた、ニューロン/µm³、DGpl の数増やさ SE 住宅5点で DCV の密度が減少します。対照的に、NPY ノックアウト条件5の住宅の独立した予約プール (ドッキング解除されたシナプス小胞) のシナプス小胞の大幅な増加となりました。シナプスの裂け目の幅に及ぼす EE は EE 建物重量と NPY KO マウス5の重要な違いの結果 NPY の島グループで逆転しました。WT と NPY の行動の研究と一緒ノックアウト動物は NPY の EE5の神経生物学の効果のための重要な役割を示すこのどちらの住宅条件の下で開催。
人間の脳に格納された鉄を視覚化するには、スクリプトはコンパイル時のエネルギーを得ることを目的と全体に極薄のセクション内から獲得のポイントは、これらの各ポイントでの電子顕微鏡像をフィルター処理をランダムに選択する SerialEM ソフトウェア.電子顕微鏡には、セクションをロードした後、スクリプト実行セクションの安定化 (すなわち。、' 標本料理 ' ルーチン) 一晩。スクリプトは、図 3に格子が付いているものからユーザーが定義済みのポイントの数をランダムに選択します。テストの顕微鏡写真を生産しその灰色レベルをチェック、スクリプトは、選択したポイントがグリッド線に上陸ポイントを拒否するセクションの目に見える部分に位置するかどうかをチェックしました。ワークフローのほとんどは、ユーザーの最小限の操作でスクリプトによって処理されました。ただし、それはなかった (このセットアップ)、エネルギー フィルタ リング顕微鏡写真を自動的に記録することが可能 SerialEM のオート フォーカス ルーチンのあまりにも小さな光があったと。したがって、我々 はすぐにスクリプト各ポイントにステージを移動手動でフォーカスを調整し、鉄の透過イメージを作った DM のソフトウェアに切り替えました。死後人間の脳から EFTEM 鉄イメージの例を図 4に示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig1.jpg"> 図 1。ワークフローの図。(A) (矢印の方向) にサンプル準備の主な手順を示します: vibratome セクション (i)、embedding(ii)、半薄いと超薄いセクション (iii) を切断し、銅グリッド (iv) の超薄切片のペアをキャッチします。顕微鏡サプライヤーのソフトウェアおよびカスタムメイドの RPS ソフトウェアの使用状況を記録サイトを決定するサンプリング領域座標を作成する(B) 。セクションのコーナー ポイントは、顕微鏡ソフトウェアに格納され、投資収益率 (半薄いセクションの助けによって識別される) の通りです (私は);ROI の領域をサンプリングのグリッドが生成されます、ランダム シフト (赤矢印) が x で導入されたと y。(Ii); 記録サイトを決定するシフトを持ってない、黒の正方形ではなく、ランダムに移される青の正方形が使用されるように、シフトは (黒矢印)、サンプリング領域間の距離よりも小さい(黒と青の正方形として描画) 投資収益率の枠内でのみサンプリング領域は、記録に使用されます。顕微鏡写真は、参照セクション (黒い正方形) と参照セクション (青い四角) の対応する場所の両方に作られています (iii)。(C)の顕微鏡写真は十分な倍率での各サンプリング分野で行われます。(この場合は 2 x 2 の画像が一緒に合併) に必要な場合にいくつかのマージされた画像から成るモンタージュは、(i);構造フレーム内と、'受け入れ回線で' (点線の枠線) はカウントされますにはなく、これら「禁制線」(固体フレーム ライン) カウント フレームを生成し画像オーバーレイとして示す、(ii).<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig2.jpg"> 図 2.公平なカウント フレームと超薄切片のペアに微細構造パラメーターを測定します。(A)カウントおよび細胞構造の分析に使用する ImageJ ウィンドウの概要。左側は、オーバーレイとしてカウント フレームと電子顕微鏡写真を示します。右側: ドロップ ダウン メニュー (上) と (下) のツールバー ImageJ ユーザー インターフェイス (青い四角形)ObjectJ オブジェクト エディター (緑色の四角形)。測定するためのツールを選択することができますObjectJ ツールウィンドウ (オレンジ色の四角形) とすべての測定値が記載されていますObjectJ 結果ウィンドウ (黒の四角形)。電子顕微鏡写真 (両方のセクション - 矢印のシナプス; 参照セクション矢印でのみシナプス) 上の表示マークのシナプスから(B)の詳細。それらはのマルチポイント ツールを使用してマークされて(赤い円) ImageJ のツールバーから。(C)名前とシナプス機能の計測パラメーターはObjectJ ツールを使用してを定義されています。マーカー ツールと関心がある機能を選択および構造に沿って左マウス クリックによってイメージで描かれたアウトライン。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig3.jpg"> 図 3。選択するエネルギー フィルター電子顕微鏡の ROI 内元素マッピングのための領域をサンプリングします。SerialEM は、関心領域を選択する、一定の間隔 (A と B の画像のピンクの十字) でサンプリング エリアの高い数を示唆するに使用されます。スクリプトは、(これらの定義済みの座標) から獲得のためのサンプリング エリアをランダムに選択します。貧しい照明サンプリング エリアは、できるだけ早く 20 よく照らされたサンプリング領域を ROI 内で選択されているグリッド線とスクリプト停止を避けるために拒否されます。(A)関心、説明可能なサンプリング エリアの数が多いと、多角形の全体の領域の概要は、X のランダムな選択の前にサンプリング エリアを表示(B)に詳細でマーク。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig4.jpg"> 図 4。元素マップ (EFTEM) 取得の例。獲得ポイント周辺の(A)明視野 TEM 顕微鏡写真ランダムに選択された領域は元素マップを得るために使用された、黒の四角形でマークします。(B) EFTEM 済みエッジ ウィンドウ画像ランダムに選択されたエリアで行われました。(C) EFTEM 後エッジ ウィンドウ イメージの同じエリアで行われました。(D)同じ面積 (M エッジ) の鉄の元素マップ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

脳組織の電子顕微鏡による調査のための斬新なワークフローを紹介します。メソッドでは、公平な方法で神経機能を調べることができます。元素分析は、ランダム サンプリングのワークフローのほとんどを自動化スクリプトを述べる。

神経科学の TEM セクションをサンプリングの公平なアプローチ

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative ...

電子顕微鏡では、公平なサンプリングプロトコルが不可欠です。ある脳領域のシナプスや他の構造の数値密度を定量化したい場合、私たちの技術の主な利点は、それが公平であり、最小限のユーザー介入で電子顕微鏡写真を自動的に生成することができるということです。この技術は、神経科学などの他の研究分野でも有益であり、神経ネットワークの強度を評価するのに使用できます。プロトコルを適用するためには、サンプル調製や遷移電子顕微鏡の操作など、電子顕微鏡技術の経験が必要です。私たちの手順を実証するのは、私の研究室のポストドクターであるステファン・ヴェルニッツニッヒ博士です。このプロトコルは、電子顕微鏡用の脳サンプルを準備し、薄いセクションのペアを切断するで構成されています。次に、特定の分野で定義された数の電子顕微鏡写真を自動的に生成する方法を説明する。次に、計数フレームを使用して、構造フィーチャの数値密度を評価します。まず、添付のテキストプロトコルに従って、目的のサンプルを解剖、修正、修正後、および埋め込み樹脂に埋め込みます。次に、サンプルをウルトラミクロトームに置き、55ナノメートルの超薄型シリアルセクションを生成します。1ミリメートルの寸法を2ミリメートルずつ、ピオラ状でコーティングしたスロットグリッド上にセクションを配置します。次いで、2%の酢酸を使用してスロットグリッド上の超薄いセクションを30分間対抗し、続いて室温で30秒間クエン酸鉛を付ける。グリッドを TEM に配置し、TEM を使用して、TEM を使用して、セクションの方向を調整し、その品質を評価するグリッド上のセクションを確認します。次に、TEM シリアル セクション ソフトウェアを起動し、[セクション]を選択し、[挿入]を選択して参照セクションとルックアップ セクションのコーナー ポイントを追加します。ポップアップ ウィンドウの指示に従います。参照セクションから開始し、ルックアップ セクションに進みます。点 1 と 2 が入力されるため、断面のエッジが次のセクションに平行であることを確認します。次に、低倍率で参照セクションを視覚化し、対象領域を特定します。参照セクションの TEM 画像解析を使用して、ROI の複数のコーナー ポイントに顕微鏡ステージを移動し、ROI のアウトラインを作成します。ランダム ポイント サンプリング ソフトウェアを使用して、結果のポリゴンの座標を記録します。このためには、セクションの ROI のアウトラインを作成するために必要なポリゴンの各ポイントで、ランダム ポイント サンプリング ソフトウェアのダイアログ ボックスで[座標の追加]を押します。次に、ランダムポイントサンプリングソフトウェアに、サンプリングエリアとエリア間の距離に適したサイズを定義して入力します。次に、[ラスターを計算]を押して、ポリゴン内のマイクログラフの位置に対して、体系的で均一でランダムな方法で座標を生成します。ランダムポイントサンプリングソフトウェアとTEMシリアルセクションソフトウェアを使用して、参照セクションとルックアップセクションにサンプリングポイントを保存します。これらは、その後に記録されるモンタージュの座標です。ランダムポイントサンプリングソフトウェアで、次の位置に移動して、顕微鏡ステージを参照セクションの各サンプリング領域のx、y座標に移動します。次に、[場所] を選択し、[挿入] を選択して、参照セクションの TEM シリアル セクション ソフトウェアでこれらの座標をインポートします。すべての座標に対してこの手順を繰り返します。参照セクションの座標をルックアップセクションに反映するには、[セクション]を選択して[セクションへ移動]を選択します。ダイアログ ウィンドウでルックアップ セクションの番号を入力します。モンタージュの記録については、前に説明したように参照セクションとルックアップセクションを切り替え、参照セクションの位置を場所で変更して番号に移動します。ダイアログウィンドウで次の座標を選択します。SerialEM モンタージュの場合、各サンプリング座標で[ファイル]に移動し、ドロップダウンメニューから[新しいモンタージュ]を選択します。ダイアログ ウィンドウで、正しいタイル数とオーバーラップの割合を選択します。本研究では、5000倍率で研究上のシナプス特徴を認識するのに十分である。しかし、CCDカメラの限られた視野は、2枚の画像でモンタージュを作る必要があります。モンタージュはシリアルEMに作られています。各モンタージュを記録する前に、フォーカスを再調整するか、録音ソフトウェアのオートフォーカスオプションを有効にします。モンタージュファイルを保存するフォルダを選択し、SerialEM の左側にあるモンタージュサブメニューで Start キーを押してモンタージュの記録を開始します。マイクロディセクタを開始し、必要に応じて、カウント フレームのサイズとセグメント数を定義します。デセクタ マクロを使用してシナプス密度をカウントします。ツールバーにあるマルチポイントツールを使用して、非セクタの 2 本の禁止線と交差するシナプスを制限しますが、逆の受け入れラインでシナプスをカウントします。参照セクションに表示されるが、参照セクションには表示されないカウントフレーム内のすべてのシナプスを、楕円形の選択でマークします。シナプスパラメータを測定する場合は、参照セクション上にある断面でシナプス裂孔を持つシナプスのみを選択します。これは、デセクタに使用されるイメージ フレーム内に収まる必要があります。次に、プラグインに移動し、次に分析に移動し、ドロップダウンメニューからプラグイン ObjectJ を起動します。[ObjectJ] ドロップダウン ダイアログから新しいプロジェクトを開き、マーカー ツールで構造のアウトラインとマークを付けるためのウィンドウが開きます。まず、マーカーツールを使用して、構造に沿って線を引くことによってシナプス前膜の長さとシナプス後の密度の長さを測定します。次に、多角形を描くことによってシナプス裂の平均幅を求め、シナプス前およびシナプス後膜の両方を覆う。ドッキングされた小胞の数を決定するには、1小胞径以下のシナプス前膜からの最大距離を有するすべての小胞を数えます。次に、同じシナプスでドッキングまたは他のドッキングされていない小胞からの1つの小胞径の最大距離を持つ小胞を数えることによって、ドッキングされていない小胞の数を決定する。プロトコルの適合版は超薄いセクションの中で公平に得られた場所で元素分析を可能にする。このためには、TEMイメージングモードで、SerialEMを起動し、新しいプロジェクトを開きます。次に、ナビゲータを開き、カメラコントロールとスクリプトコントロールでカメラの設定を確認し、ビューと記録と開始ビューを確認します。超薄いセクションのコーナーマップを作成するには、「ナビゲータ」ウィンドウで「ポイントを追加」を選択します。次に、超薄い断面のエッジにコーナーポイントを設定します。右マウスキーを押しながら、ステージをコーナーポイントに移動します。セクションの角に達したら、左クリックでコーナーポイントを追加します。この手順を繰り返して、さらに 3 つのコーナーポイントを追加します。「ナビゲータ」ウィンドウで、格納されているポイントのコーナーポイントの C ボックスにチェックが付いていることを確認します。コーナーモンタージュを開始するには、シリアルEMメニューバーのナビゲーターに移動し、ドロップダウンメニューからモンゲジンググリッドとセットアップコーナーモンタージュを選択します。「ナビゲータ」ウィンドウで「多角形を追加」を選択し、マウスの右クリックを複数回実行して対象領域の輪郭を描きます。次に、[ナビゲータ] ドロップダウン メニューで [ポイントのグリッドを追加] を選択し、ポイント間の距離を定義します。EFTEMSerialEM スクリプトを起動し、スクリプト・コマンドに従い、ナビゲーターに示すようにグリッドポイントの数を入力し、取得ポイントの数を入力します。次に、スクリプトがグリッド バーを回避できるように、イルミネーションのしきい値を設定します。スクリプト コマンドに従って、グリッド バーの 4 分の 1 で視野を覆うようにステージを手動で移動します。表示された値に従って、表示される値よりも高いしきい値のイルミネーション値を入力します。取得ポイントが選択され、調理ルーチンが終了するまで待ちます。これは長い時間がかかり、一晩で行うことができます。エネルギーフィルタによる TEM 要素解析の設定後、要素固有の設定で要素マップを取得します。偏りのないサンプリングアプローチは、特定の脳領域のシナプス特徴をカウントして分析するのに役立ちます。さらに、シリアルEMソフトウェア用のEFTEMSerialEMスクリプトは、これらの各点でエネルギーフィルタ電子顕微鏡写真を得ることを目的として、超薄型セクション全体から取得ポイントをランダムに選択することができます。スクリプトは、グレーディングでマークされたものからユーザーによって事前に定義された多数の点をランダムに選択しました。テスト顕微鏡写真を作成し、その勾配レベルを確認することで、スクリプトは、選択されたポイントがセクションの可視部分に配置されているかどうかを確認し、グリッドバーに着陸した点を拒否しました。ワークフローのほとんどは、ユーザーの操作を最小限に抑え、スクリプトによって処理されました。しかし、ここに示すサンプルでは、SerialEM のオートフォーカスルーチンに対しては光が少なすぎました。そのため、スクリプトがステージを各ポイントに移動するとすぐに、フォーカスが調整され、元素マップが鉄でできています。関心領域を慎重に選択し、同じ数のサンプリング ポイントが各対象領域に入るようにすることが重要です。検体の調製に使用される化学物質の多くは有毒であることを忘れないでください。だから、ラボコートと保護手袋を着用し、煙のカバーの下で動作します。

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