Name: 酵母におけるポリグルタミン毒性の試金を使用して融合パートナーの蛍光タンパク質の効果 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学ぶポリグルタミン毒性の試金法を用いた酵母モデルにおける蛍光タンパク質の融合パートナーへの影響評価。この迅速でスケーラブルな手法は、神経変性疾患に関連するタンパク質凝集動態の理解に貢献します。

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M.L.D. とパの健康研究のためカナダの機関から営業許可を支えこの研究ここで示した作業は革新のためのカナダの財団からジョン ・ r ・ エバンス リーダー基金受賞によってサポートされパ能にオンタリオ州研究基金から一致する基金に支えられて修士博士課程転送奨学金にシューリックスクール M 学校の長のedicine ・歯学部西部オンタリオの大学で。S.D.G. は、ALS カナダから博士課程奨学金によってサポートされます。

1. 新しい蛍光タグ Httex1酵母式の報道記者の世代
注: このセクションによって変更されているプロトコルから江ら16と Albakriら19。
<ol><li>蛍光タンパク質または PCR によって関心をコードする配列を増幅するプライマーを設計します。前方のプライマーは、制限酵素消化 (GATC) 中に続いて SpeI 制限サイト (ACTAGT) と興味の蛍光タンパク質遺伝子の ATG (ATG を除く) の下流 20 拠点を支援するリーダーのシーケンスを含める必要があります。逆のプライマーは、続いてサリ制限サイト (GTCGAC) と逆の補数 (stop を含む) FP シーケンスの停止コドン上流 20 拠点のリーダー シーケンス (GATC) を含める必要があります。</li>
	<li>次の設定で、たちを使用して PCR の反作用を実行手順 1.1 で設計したプライマーを使用して: 95 ° C、1 分および 30 のサイクル 95 ° C で熱 s、60 ° C、30 秒と 2 分キロバイトごとに PCR の製品のための 72 ° C。18 サイクルを実行することは、十分です。</li>
	<li>Agarose のゲル (トリス酢酸 EDTA は 0.5%) の PCR の反作用を実行します。予想される製品サイズに対応するシングル バンドする必要があります。ゲル精製キットを使用してフラグメントを分離します。</li>
	<li>このプロトコルは、25 (無毒) を運ぶ Httex1ベクトルと 72 polyQ を繰り返す (HD 関連、強力な集計を表示する)。PCR のフラグメントと 37 ° C で 3 時間 SpeI とサリの制限の酵素とベクトルの両方をダイジェストします。</li>
	<li>手順 1.3 のように agarose のゲルを実行することによって消化されたベクトルを浄化します。</li>
	<li>PCR 精製キットを使用して消化の PCR のフラグメントを浄化します。</li>
	<li>結果として得られる消化液の PCR のフラグメントを縛る、p415-GAL1-フラグ-25/72QpolyQ プラスミド1 T4 リガーゼ (室温で 1 h) を使用して。10 μ L 反応 (T4 酵素の 1 μ L、10 X バッファーの 1 μ L、6 μ L の PCR のフラグメント、およびベクトルの 2 μ L) を使用します。</li>
	<li>大腸菌の 50 μ L に ligation の反作用の 2 μ L を変換-有能なセルと 30 分間氷の上にそれらを孵化させなさい。その後、熱ショック 30 42 ° C で細胞 s の追加 SOC 伸長メディアの 1 mL とシェーカーで 1 h の 37 ° C で孵化させなさい。100 μ g/mL アンピシリンを含む LB 寒天培地プレート上の反応の 200 μ L をプレートします。37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。</li>
	<li>3 つの個々 の細菌のコロニーを選択、一晩シェーカーで 37 ° C で 100 μ g/mL アンピシリンを含む流体培養基 LB の 3 mL でそれらを成長し、プラスミド プラスミド精製キットを使用して DNA を抽出します。</li>
	<li>500 の消化によってプラスミッドをチェック 37 ° C および実行 agarose のゲル (トリス酢酸 EDTA は 0.5%) の反応で 1 h の SpeI とサリの制限酵素を用いた DNA の ng。ベクター (〜 7 kb) と挿入の右のサイズで 2 つのバンドをする必要があります (サイズは興味の遺伝子によって異なります)。その後、シーケンスによってプラスミッドを確認します。</li>
	<li>P415-GAL1-フラグ- polyQ FP プラスミド酵母 W303 標準酵母変換プロトコル2を次に変換します。</li>
</ol>2. スポッティング アッセイ
<ol><li>ストリーク酵母は、炭素源としてブドウ糖を酵母選択メディア (合成を完了-SC ロイシンなし) を含む寒天培地プレート上の任意の FP が付いたキャリング 25Q/72Q を複製します。同時にまた 25Q/72Q-ymsfGFP 肯定的な制御として使用するを連勝します。 注: 25Q/72Q 構造蛍光タグが含まれていない毒性はなく、ネガティブ コントロールとして使用できます。</li>
	<li>2-3 d のための 30 の ° C でプレートを孵化させなさい。</li>
	<li>プレートから最大 3 つのシングル コロニーを選択します。</li>
	<li>炭素源として 2% グルコースを添加した SC の 5 mL を接種します。</li>
	<li>一晩カルチャごとの 200 μ L をペレットし、洗って 3 x 滅菌蒸留水します。</li>
	<li>2% ガラクトース polyQ 融合発現を誘導するために炭素源として SC 培地で細胞を再懸濁します。メディアが 30 ° c 管回転で一晩ガラクトースを孵化させなさい。コントロールとしてグルコースを含むメディアを使用してこの手順を繰り返します。</li>
	<li>次の朝、600 の光学濃度に細胞の密度を均等化滅菌 96 ウェル プレートで SC メディアの 0.2 に 100 μ L の nm (外径600)。</li>
	<li>4 つの準備に次もメディアの 80 μ L にも前からサンプルの 20 μ L 分注による滅菌水で各サンプルの 5 倍希釈。</li>
	<li>選択式ナンバー プレート (グルコースやガラクトースを含む) に細胞を発見し, 2 d の 30 ° C で酵母の固定ツールを使用します。</li>
	<li>画像ドキュメント機器とプレートのイメージです。</li>
</ol>3. 液体培養の細胞の成長の定量化
<ol><li>このプロトコルの次の手順 2.1 2.5、細胞培養を準備します。</li>
	<li>分光光度計を用いた OD600を測定します。</li>
	<li>96 ウェル プレートでメディアの 0.1 で 300 μ L の OD600細胞を希釈します。</li>
	<li>3 通では、各サンプルを実行します。</li>
	<li>振動機能を持つプレート リーダー/インキュベーターでプレートを孵化させなさい。600 サンプル、30 ° C の温度、吸光度の数値を設定 nm、24 h 実験と連続振動モードを選択し、15 分の測定間隔の長さ。</li>
	<li>成長曲線を作成して科学的グラフ作成ソフトウェアを使用して曲線の下の領域を定量化します。グラフパッド プリズム 7 をお勧めします。3 つのレプリケーション値を XY テーブルにデータを貼り付けます。成長曲線は、左側にある [グラフ] フォルダーの下に表示されます。曲線下面積を定量化するには、左上で分析を選択し、 XY 解析の曲線下の領域をクリックします。</li>
</ol>4. 蛍光顕微鏡
<ol><li>このプロトコルの次の手順 2.1 2.5、細胞培養を準備します。</li>
	<li>10 セルを希釈 8 ウェル イメージング室に各サンプルの成長メディアと転送 200 μ で x。</li>
	<li>室温で 63 X 計画 Aprochromoat 目的 (1.4 NA) を搭載した共焦点顕微鏡を用いた細胞をイメージします。 注: 共焦点の顕微鏡の使用はオプションです。標準的な広視野蛍光顕微鏡を使用もできます。</li>
	<li>最適な画像の取得のピンホールとレーザー パワーを調整します。72Q 集計はディフューズ 25Q 信号よりはるかに明るいので、よく蛍光信号の飽和を避けるために異なるプラスミド間別の取得の設定を使用する必要があります。</li>
	<li>ImageJ20または別の画像処理ソフトウェアを使用して画像を処理します。この手順では、表示の集計を手動で計算できる細胞の割合が望まれます。</li>
</ol>5. ドットのしみ
メモ: このプロトコルでドットのしみは蛋白質の表現のレベルを調べるため使用されます。このプロトコルの次の手順 2.1 2.5、細胞培養を準備します。
<ol><li>換散バッファー (100 mM トリス、pH 7.5; 200 mM の NaCl; 1 mM EDTA; 5% グリセロール、1 mM ジチオトレイトール [DTT]) でガラス製のビーズを使用して蛋白質の lysates を生成します。プロテアーゼ阻害剤、4 mM 特異フッ化物 (PSMF) とプロテアーゼ阻害剤のカクテルを直接使用する前に追加します。一晩の文化の 5 mL をペレットし、ガラスビーズの 200 μ L、200 μ L の換散バッファーのでそれを再懸濁します。12 ラウンドの渦 30 s。4 ° C 10 分で 12,000 × gで遠心し、上清を収集します。</li>
	<li>総蛋白の濾過装置を用いた硝酸セルロースの膜に同量をスポットします。PBS で膜を prewet し、装置を組み立てます。真空源に接続し、ネジが締まっていることを確認します。真空をオンにし、重力によって膜サンプル フィルター。</li>
	<li>PBS-0.05 %tween/5% 無脂肪牛乳の膜をブロックします。</li>
	<li>4 ° C で一晩一次反フラグ抗体と膜をインキュベートします。モノクローナル抗フラグ M1 をお勧めします。</li>
	<li>膜 3 を洗って 10 分 PSB-0.05% トゥイーンの x。</li>
	<li>膜蛍光に分類された二次抗体 (抗マウス IgG) PBS-0.05 %tween/5% 無脂肪牛乳に室温で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>膜 3 x 10 分 PSB-0.05% トゥイーンを洗います。</li>
	<li>画像 - イムノブロット ドキュメント システムを使用してしみ。</li>
</ol>

<ol><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li>
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</ol>

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この記事で Httex1 polyQ 展開と酵母の増殖への影響の集計を測定する様々 な試金がどのように異なる蛍光を勉強するはモデルとして採用されたタンパク質蛍光レポーターのコンテキストでその融合パートナーの変更.肯定的な制御として GFP バリアント (ymsfGFP) を使用して、示した polyQ 毒性と異なる蛍光タグ間集計の大幅な変化を検出とこに対して polyQ FP 融合パフォーマンスの直接かつ迅速な比較では、GFP 付けられた構造16,19。
この議定書は蛍光蛋白質に焦点を当てて、プロトコルのさまざまな部分が他の蛋白質のタグの効果をテストする容易に合わせることができます。さらに、この議定書は、コピー数 (一般に 1 ~ 2 コピー) セル25の存在の点で異なることができます低コピー酵母セントロメア ベクトルを採用しています。実験の条件統一式を確実に統合のベクトルを使用してこの問題を回避...

オワンクラゲ1、遺伝子にエンコードされた FPs の広いパレットから緑色蛍光タンパク質 (GFP) の初期特性が開発されているので同時にローカライズし、追跡する細胞生物学者が複数にできます。生活イベント/タンパク質は細胞2,3です。FPs は、サンゴとしたがって、彼らのそれぞれの蛍光スペクトルを超えて広く流用表示特定生物物理プロパティにクラゲから複数の有機体から派生します。これらのプロパティには、明るさには、光安定性、2,4他の間で oligomerize する傾向が含まれます。適切なタグの選択の重要な側面は、単量体の FPs を選択する不適切な相互作用と融合パートナーの機能の変化を最小限に抑え、レポーターの効率を最大化するために、蛍光レポーターを設計するとき、細胞内コンパートメント4,5,6を与えられました。GFP、時間をかけて、進化されているフュージョン パートナー5,7、8、蛍光タグの影響を最小限に抑えるため、FP の新しい亜種を実行と比較してどのように GFP のまま評価することは困難です。
FPs の動作を特徴付けるいくつかの方法が存在します。それらのほとんどは、超遠心法などの生化学的アプローチを使用して FPs の生物物理特性のテストを含むし、ゲルろ過プロトコル9,10、11,12。このようなメソッドがあるのままなセルの動作に少し洞察力を提供するソリューションで精製された FPs を使用して警告。組織の円滑な小胞体 (オゼ) 試金提供の開発生活 oligomerize FPs' 傾向の定量的評価細胞13発現 FPs に小胞体尿細管を再編成する能力をテストすることによってオゼ渦巻き14。この手法は、GFP のモノマー ・ オリゴマーのバリエーション、および他の FPs の間の変更を正常に検出できます。主一時的に transfected セルで過剰発現に依存し、定量、画像解析を時間がかかること、自動データ収集および解析ワークフロー技術を採用しない限り、します。
これらのアプローチを補完するために酵母15,16毒性に関する蛍光タグの効果と polyQ 展開の集計の活用を試金を設立しました。以上 36 polyQ ストレッチの拡大は huntingtin 蛋白質 (Htt) がハンチントン病17,18と関連付けられている遺伝子の最初のエクソン内で繰り返されます。拡張 Httex1ミスフォールド Htt タンパク質が重度の成長障害に結合の強い凝集酵母で発現。興味深いことに、これらの表現型は強く FPs15,16を含む polyQ ストレッチを並べる順序によって影響されます。それは FPs のさまざまなプロパティも差動酵母 polyQ 毒性に影響を与えることができます合理化されました。確かに、GFP のような FPs と比べると、赤の蛍光タンパク質とその進化形態を示している減らされた毒性と集計16。この原稿は、次世代 FPs の polyQ 毒性と酵母の凝集の効果を評価するために詳細なプロトコルを提供します。この試金は以前の特徴と並行使用できる FP の亜種の迅速かつ潜在的高コンテンツ分析新しい FPs の最適な評価方法評価方法彼らは GFP と比較して実行できます。

<table><tbody><tr><td>5-α 有能な大腸菌 (高効率)</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>C2987</td><td></td></tr><tr><td>SpeI-HF</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>R3133</td><td>高忠実度酵素が好ましい</td></tr><tr><td>SalI-HF</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>R0138</td><td>高忠実度酵素が好ましい</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>BP160</td><td></td></tr><tr><td>LB-寒天</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>BP1425</td><td></td></tr><tr><td>LB-Broth</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1760</td><td></td></tr><tr><td>PfuUltra ハイフィデリティ DNA ポリメラーゼ</td><td>Agilent Technologies</td><td></td> 600382 <td></td></tr><tr><td>EPOCH2 マイクロプレート分光光度計</td><td>BioTek Instruments inc</td><td>EPOCH2TC</td><td></td></tr><tr><td>酵母ピンリプリケーター</td><td>V&Pサイエンティフィック株式会社</td><td></td><td></td>VP407AH</tr><tr><td>SPIイメージ</td><td>ャーS&ピーロボティクス株式会社</td><td>spImager-M</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 800 共焦点</td>と <td>AryScan カールツァイス顕微鏡</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>8 well Lab-Tek イメージングチャンバー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12565470</td><td></td></tr><tr><td>バイオドット装置</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>Chemi Doc XRS+</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>抗FLAG M1抗体</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>F3040</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG alexa 555二次抗体</td><td>Thermo&nbsp;</td><td>A32727</td><td></td></tr><tr><td>プラスミド MiniPrep キット</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>プラスミドゲル抽出キット</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>K0831</td><td></td></tr><tr><td>PCR 精製キット</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>K0702</td><td></td></tr><tr><td>Prizm</td><td>GraphPad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TAE (Tris-Acetate-EDTA)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>BP13354</td><td></td></tr></tbody></table>

酵母におけるポリグルタミン毒性の試金を使用して融合パートナーの蛍光タンパク質の効果

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

蛋白質のローカリゼーションと生細胞イメージングを用いた人身売買の調査、研究者は、しばしば蛍光レポーターに興味の彼らの蛋白質の融合に依存します。遺伝的に符号化された蛍光蛋白質 (FPs) の常に進化するリストは、それは蛍光融合設計に来るときいくつかの選択肢を持つユーザーを示します。各 FP は、結果として得られる蛍光融合の生化学的な携帯電話、および機能のプロパティに影響を与えることができます特定の光学的・生物物理プロパティを持ちます。たとえば、いくつかの FPs はフュージョン パートナーの機能を阻害する影響を受けやすい無指定のオリゴマーを形成する傾向があります。残念ながら、少数の方法だけは、FPs の蛍光レポーターの動作への影響をテストする存在します。ここでは、出芽酵母出芽酵母におけるポリグルタミン (polyQ) 毒性の試金を使用して FPs の影響を迅速に評価できるようにする簡単な方法をについて説明します。PolyQ 拡大 huntingtin 蛋白質は、拡張の huntingtin が有毒なオリゴマーと封入体に集約 (HD)、ハンチントン病の発症に関連付けられます。集約と酵母 polyQ 展開の毒性、蛍光タグ、FPs の動作への影響を研究する理想的な実験プラットフォーム提供の存在を含め、polyQ 地域を並べる順序に大きく依存、フュージョン パートナー。

FPs プロパティを持つ異なる生物物理 oligomerize、傾向を含む蛍光レポーターのコンテキストでその融合パートナーの行動に影響を与えることができます。このプロトコルでは、有毒な polyQ 展開に複数 FPs を融合することができます簡単な方法について説明します。PolyQ 毒性は並ぶ polyQ ストレッチ15シーケンスに依存、ので、この試金は蛍光 polyQ 融合記者 (図 1) の迅速かつ直接比較を可能します。HD-関連付けられている polyQ 長さ (25Q) ネガティブ コントロールとして使用され、有意な毒性または集計15,16,21,22が表示されません。強い成長阻害と polyQ 凝集を含...

この資料では、蛍光タンパク質凝集の効果と蛍光レポーターのコンテキストで新しく, 蛍光タンパク質の迅速な評価のための誤って折りたたまれたポリグルタミン拡張の毒性を評価するためにプロトコルについて説明します。

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

この方法は、蛍光タンパク質が融合パートナーにどのような影響を与えるかなど、蛍光タンパク質の分野における重要な質問に答える手助けとなります。この技術の主な利点は、蛍光タンパク質とその融合パートナーの効果を迅速かつ容易にスケーラブルに評価できることです。この方法は、蛍光タンパク質の挙動に関する洞察を提供することができますが、他の遺伝的にコードされたタグにも適用できます。また、この手順を実証するのは、ウェスタン大学の大学院生であるソーニャ・ディ・グレゴリオです。この方法で試験される各蛍光タンパク質は、まず、無毒な25Q反復またはハンチントン病関連毒性72Q反復のいずれかを収容するFLAGタグ付きHTTエキソン1のガラクトース誘導性バージョンをコードする酵母発現ベクターにクローン化される。クローンは、シーケンシングによって選択され、検証され、その後酵母に変換されます。各種アッセイ用の細胞培養を調製するために、炭素源としてグルコースを含む酵母選択培地を含む寒天プレート上に目的の蛍光タンパク質を有する25Qまたは72Qタグを有する酵母クローンをストリークする。同時に、25Qまたは72Q酵母を運ぶストリーク酵母は、正のコントロールとして機能するように、モノマースーパーフォルダGFPを最適化した。2~3日間、30度でプレートをインキュベートします。各プレートから3つの単一コロニーまで選択し、炭素源として2%グルコースを添加した合成完全培地の5ミリリットルを接種する。一晩摂氏30度で培養します。翌日、各一晩培養物200マイクロリットルをマイクロ遠心チューブと遠心分離機に移して細胞をペレット化する。滅菌蒸留水で少なくとも3回洗浄してください。GAL1プロモーターの誘導を抑え込むのに寄与する可能性のあるブドウ糖の痕跡をすべて排除するために、細胞をうまく洗うことが重要です。先に示したように細胞を調製し、ポリQ融合の発現を誘導する炭素源として2%ガラクトースを含む合成完全培地で再懸濁する。コントロールとして、グルコース含有培地中の細胞を再懸濁する。一晩チューブ回転機で摂氏30度で細胞をインキュベートします。翌朝、分光光度計を用いて各培養液の600ナノメートルで光学濃度を測定する。無菌96ウェルプレートで合成完全培地の100マイクロリットルの2の光学密度600に細胞密度を均等にします。前の井戸から20マイクロリットルのサンプルを次の井戸の80マイクロリットルの培地にピペット処理して、各サンプルの4つの5倍希釈液を調製します。酵母ピン留めツールを使用して、細胞を選択的プレートにスポットし、摂氏30度で2日間インキュベートします。イメージドキュメンテーションデバイスを使用してプレートをイメージします。このアッセイ用の細胞培養物を調製し、分光光度計を用いて各培養物のOD600を測定する。96ウェルプレートの300マイクロリットルの培地で1のOD600に細胞を希釈します。各サンプルを三重に準備します。プレートリーダーインキュベーターに揺れ機能を備えたインキュベートします。サンプル数、温度を摂氏30度、吸光度を600ナノメートル、実験の長さを24時間、測定間隔を15分に設定します。連続揺れモードを選択します。実験が完了したら、成長曲線を作成し、科学的グラフ作成ソフトウェアを使用して曲線下の領域を定量化します。3 つのレプリケート値を持つ XY テーブルにデータを貼り付けます。成長曲線は左側のグラフフォルダーの下に表示されます。カーブの下の領域を定量化するには、左上の解析を選択し、XY 解析で曲線の下の領域をクリックします。調製した細胞を10倍の増殖培地で希釈することにより、この手順を開始する。各サンプルの200マイクロリットルを8ウェルイメージングチャンバーに移します。標準的な広視野蛍光顕微鏡を使用して細胞を画像化します。画像取得のイメージング設定を調整します。72Q凝集体は拡散した25Q信号よりはるかに明るいので、蛍光シグナルの飽和を避けるために、異なるプラスミド間で異なる集録設定を使用することがしばしば必要とされる。適切な画像処理ソフトウェアを使用して画像を処理します。このプロトコルでは、ドットブロットを使用してタンパク質発現レベルを調べます。タンパク質ライセートを生成するためのバッファーを調製し、フェニルメチルスルホニルフッ化物の4マイクロモルとプロテアーゼ阻害剤カクテルをリシスバッファーに添加します。遠心分離により一晩培養したペレットを5ミリリットルずつペレット化する。200マイクロリットルのガラスビーズと200マイクロリットルのライシスバッファーで細胞を再懸濁します。12ラウンドで30秒間渦を起し、ラウンドの合間にアイシングします。摂氏4度で12,000倍Gで10分間遠心分離機を回収し、上清を集めます。ニトロセルロース膜上の全タンパク質の量を等しく発見するために、精密ろ過装置を使用してください。膜をPBSで予め濡らし、装置を組み立てます。真空源に接続し、ネジが締め付けされていることを確認します。サンプルをロードし、真空をオンにし、重力によって膜を通してサンプルをフィルターさせます。30分間、PBS 05%Tween 5%無脂肪ミルクで膜をブロットします。一次抗フラグ抗体を一晩摂氏4度で膜にインキュベートする。翌日、PBS 05%Tweenで、膜を10分間3回洗浄します。PBS 05%Tween 5%脂肪フリーミルクを室温で1時間、蛍光標識二次抗体で膜をインキュベートします。膜をPBS 05%Tweenでそれぞれ10分間3回洗浄します。続いて、アミノブロットドキュメンテーションシステムを使用して膜を画像化します。酵母に融合した25Qまたは72Q HTTエキソンのいずれかを発現する酵母は、酵母最適化モノマースーパーフォルダGFPまたは酵母最適化モノマータグBFP2を一晩グルコースまたはガラクトース培地で培養し、寒天プレート上で発見するか、さらに液体培地にインキュベートした。72Q酵母最適化モノマースーパーフォルダGFPは、重大な成長欠陥を誘導する一方で。72Q酵母最適化モノマータグBFP2は、蛍光タグの性質が細胞内のpolyQ拡張挙動を妨げることができることを示す非毒性25Q対応に類似した増殖表現型を表示する。蛍光顕微鏡による蛍光ポリQ融合の凝集の評価は、72Q酵母最適化モノマースーパーフォルダGFPが有意な凝集を示し、72Q酵母最適化モノマータグBFP2は非毒性25Q対応物と同様の拡散細胞質シグナルを表示することを示している。様々なポリQ融合の発現レベルが毒性に影響を与える可能性があるため、ドットブロットはタンパク質レベルを評価するために行われた。細胞ライセートの5倍希釈からの結果が示される。この技術は、GFP変異体との特徴のない蛍光タンパク質との迅速な比較を可能にしますが、オリゴマー化を直接評価することはできません。この手順に従って、他の手段、例えば哺乳動物細胞における潰瘍アッセイは、蛍光タンパク質の単量体状態などの追加の質問に答えるために行うことができる。

effect-fluorescent-proteins-on-fusion-partners-using-polyglutamine

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

分裂酵母の定量的なライブセル蛍光-顕微鏡解析

本稿ではポリグルタミンの毒性を評価するための3つの相補的なプロトコル（polyQ）拡張酵母のタンパク質について説明します。...

成長アッセイ酵母におけるポリグルタミン毒性を評価する

このビデオは、老化によるプロテオスタシスの低下を決定するためのin vivoイメージングベースのアッセイを示しています。このアッセイでは、ポリグルタミンYFP融合タンパク質を体壁筋に発現する線虫Caenorhabditis...

蛍光レポーターベースの麻痺アッセイ:線虫Caenorhabditis elegansにおけるポリグルタミン蛍光レポーターの加齢に伴う進行性形成と関連麻痺を評価する技術

この資料は、調査するホタルルシフェラーゼ-GFP融合タンパク質の使用を記載...

のリフォールディング監視タンパク質を結合アッセイ<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

この記事では、タンパク質分解の遺伝的要件を決定するための酵母増殖ベースのアッセイについて説明します。また、ウェスタンブロッティングに適した酵母タンパク質の迅速な抽出方法を示し、分解要件を生化学的に確認します。これらの技術は、さまざまなタンパク質の分解を監視するために適応させることができます。...

増殖に基​​づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

私たちは、分裂酵母の性的なライフサイクルの長期顕微鏡検査のための再現可能な基本的な方法を提供します。説明されているわずかな調整で、提示されたプロトコルは、生殖プロセスのさまざまなステップに研究の焦点を当てることができます。...

分裂酵母セクシャルライフサイクルの顕微鏡観察

PCRによる遺伝子改変は、酵母細胞およびタンパク質の可視化および定量化を容易にする、 カンジダ種で蛍光タンパク質融合体を生成するために使用することができます。ここで、我々は、 カンジダ・パラプシロシスに蛍光タンパク質融合（ENO1-FP）を構築するための方策を提示します。...

蛍光タンパク質融合物中の生成<em&gt;カンジダ</em&gt;種

このプロトコルは、NLS-NES-GFPタンパク質の核内取り込みにおけるリアルタイム変化を定量化することにより、運動ニューロン様NSC-34細胞内の核細胞質輸送速度を敏感に測定する方法を記載する。...

運動ニューロン様NSC-34細胞内のリアルタイムでの核細胞質輸送を測定するアッセイ

酵母の過剰発現の交尾ベース ライブラリ スクリーニング

パーキンソン病の病態を研究・理解するためには、α-シヌクレインの in vivo...

ヒト化酵母モデルを用いたα-シヌクレインの毒性と凝集の研究法

ここでは、分裂酵母を異種宿主として利用し、FtsZやMreBなどの細菌細胞骨格タンパク質をGFPとの翻訳融合タンパク質として発現させ、それらの重合を可視化します。また、重合に影響を与える化合物は、蛍光顕微鏡を用いたイメージングによって同定されます。...

細菌の細胞骨格タンパク質を標的とする抗菌薬スクリーニングのプラットフォームとしての分裂酵母

学ぶポリグルタミン毒性の試金法を用いた酵母モデルにおける蛍光タンパク質の融合パートナーへの影響評価。この迅速でスケーラブルな手法は、神経変性疾患に関連するタンパク質凝集動態の理解に貢献します。

酵母におけるポリグルタミン毒性の試金を使用して融合パートナーの蛍光タンパク質の効果

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