マウスと次世代シーケンサーによるひと抗体のレパートリーの同定

本ビデオでは、抗体レパートリーをグローバルレベルで可視化・解析する、シンプルで効率的な方法を説明します。免疫刺激に応答して、個人のB細胞レパートリー全体とその動的変化を記述することが可能です。この方法は、新たなウイルス感染の患者からの病理学的サンプルを分析し、感染の病因に関する前例のない洞察を持つデータを得るために適用することができる。

アプリケーションのための最もエキサイティングな分野の一つは、ワクチンコントロールです。ワクチン投与された個体におけるグローバル抗体レパートリーのダイナミクスを分析することによって、ワクチンの有効性を評価することができる。この方法の新しい個人は、抗体遺伝子増幅の効率が出発物質の種類に依存するため、PCR条件を最適化する必要があるかもしれません。

免疫グロブリンアンプリコンの同定のためのフラシェール。これらのアクションを視覚的に示す必要があります。この手順のデモンストレーションは、山口さゆさんと、私の研究室の技術者で大学院生のハンビン・シュエさんです。

この手順を開始するには、8週齢のC57ブラック6マウスから組織を解剖し、2ミリリットルのPBSでステンレススチールメッシュを通過して分散した細胞を得る。細胞懸濁液を2ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移し、遠心分離機を600倍g、摂氏4度で5分間移動します。上清を捨て、800マイクロリットルのACKライジングバッファーをペレットに加えます。

氷の上で2分間インキュベートし、組織の赤血球をライスします。次に、各洗浄に対して3ミリリットルのPBSを用いて組織細胞を3回洗浄する。600倍g、摂氏4度で5分間再び遠心分離機を使用します。

上清を捨て、800マイクロリットルのフェノール/グアニジンイソチオシアネート試薬をペレットと渦に十分に加えます。摂氏25度で5分間インキュベートします。その後、200マイクロリットルのクロロホルムを加え、手動で15秒間振ります。

摂氏25度で2分間インキュベートします。12,000倍gの遠心分離機と25度の相を分離する。上水相を新鮮なチューブに移します。

70%エタノールの1つのボリュームを加えます。渦を簡単に、この混合物をシリカスピンカラムに適用します。30~100マイクロリットルの水でRNAを溶出します。

この後、フルオロメーターを使用して初期RNA濃度を定量化します。精製したRNAをマイナス80°Cで保存します。まず、メーカーの指示に従って、5'RACE CDSプライマーとSMART-PCRオリゴヌクレオチドを使用して、全RNAテンプレートの2〜10マイクログラムから第1鎖cDNAを合成します。

マウス免疫グロブリンの場合、PCRは、テキストプロトコルで概説されているように、ユニバーサルフォワードプライマーおよび免疫グロブリンクラス特異的リバースプライマーを使用して、高忠実度DNAポリメラーゼを有するcDNAを増幅する。ヒト免疫グロブリンについては、タグ配列を有するユニバーサルフォワードプライマーおよび免疫グロブリンクラス特異的リバースプライマーを用いて、最初のPCRを行う。インデックス配列プライマーを使用して、2番目のPCRによって各サンプルのインデックス配列を含めます。

次に、2%アガロースゲル上のいずれのPCR産物をエレクトロフォレス化した。UVトランスイルミエーター上のDNAバンドを視覚化し、600と800塩基対の間の広いバンドを含むゲルスライスを切除します。ゲルスライス10ミリグラムあたり10マイクロリットルの膜結合溶液を加えます。

ゲルスライスが完全に溶解するまで50~65°Cで混ぜ合わせてインキュベートします。次いで、シリカ膜スピンカラムにゲル溶液を移す。洗浄バッファーでカラムを1回洗浄し、50マイクロリットルのヌクレアーゼを含まない水でDNAを溶出します。

フルオロメーターを使用して、精製されたアンプリコンを定量化し、NGSシーケンシングのために等量の各免疫グロブリンクラスからアンプリコンをプールします。この後、DNAサイジングチップを備えたマイクロキャピラリーベースの電気泳動を使用して、ライブラリのサイズと濃度を決定します。図書館をマイナス20度で保管してください。

まず、テキストプロトコルで概説されているように、シーケンス実行のサンプルスプレッドシートを生成します。次に、試薬カートリッジおよびライブラリを解凍します。水酸化ナトリウムの0.2正常溶液を作り、望ましいモル濃度を得るためにライブラリを希釈します。

次に、フローセルをすすいで乾燥し、希釈および変性されたライブラリー溶液の600マイクロリットルを試薬カートリッジのウェルに加え、シーケンシング実行を開始する。マウス抗体レパトア全体の視点は、脾臓、骨髄、リンパ節、または血液などの細胞または組織から得ることができる。IgM、IgG1、IgG2c、および免疫グロブリン軽鎖レパートリーの代表的な結果を、ナイーブマウス脾臓からここに示す。

3D V(D)JプロットによるV(D)Jの再配置では、各ボールのサイズは読み取りの相対的な数を表します。すなわち、B細胞全体における抗体mRNAの数を表す。3Dメッシュは、110個の免疫グロブリン重鎖V遺伝子、12個の免疫グロブリン重鎖D遺伝子、および染色体上の順序を反映するように整列された4つの免疫グロブリン重鎖J遺伝子で構成されています。

2D VJプロットは、IGLレパートリーにおけるVJ再配置のプロファイルを示しています。各バーの長さは、読み取りの相対的な数を表します。X軸は101個の免疫グロブリン軽鎖V-κ遺伝子、及び3つの免疫グロブリン軽鎖V-λ遺伝子、及びY軸は4つの免疫グロブリン軽鎖J-κ遺伝子、及び3つの免疫グロブリン軽鎖J-λ遺伝子を表す。

ヒト抗体レパトア全体の視点は、末梢血単核細胞や病的組織を含む様々な組織から分析することができる。IgMの代表結果は、全IgG、総IgA、IgD、IgE、およびIgLレパートリーの正常末梢血単核細胞からのレパートリーを示す。マウスモデルと同様に、V(D)J再配置のレパートリープロファイルは、各ボールのサイズが読み取りの相対的な数を表す3D V(D)Jプロットに示されています。

3Dメッシュは、56個の免疫グロブリン重鎖V遺伝子、27個の免疫グロブリン重鎖D遺伝子、および6つの免疫グロブリン重鎖J遺伝子で構成され、染色体に現れる順に整列する。IgLレパートリーにおけるVJ再配置のプロファイルは、各バーの長さが読み取りの相対的な数を表す2D VJプロットに描かれています。X軸は、41個の免疫グロブリン軽鎖V-κ遺伝子、および32個の免疫グロブリン軽鎖V-λ遺伝子を表し、Y軸は5つの免疫グロブリン軽鎖J-κ遺伝子、および5つの免疫グロブリン軽鎖J-λ遺伝子を表す。

このプロトコルの研究材料では、フローサイトメトリーまたは病理学的サンプルのクライオセクションによって少数の並べ替えられた細胞が使用できる。ただし、PCR 条件の慎重な最適化が必要になります。このプロトコルの出力情報は巨大であるため、バイオインフォマティクスリテラシーは抗体ネットワークの構造を見つけるのに役立ちます。

それは免疫系の深い理解に先行しないだろう。