Name: ヒト臍帯由来間葉系幹細胞から早産児と正期産児の分離と性状 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 学ぶヒト臍帯由来間葉系幹細胞の分離と性状評価法。早産児と正期産児のUC-MSCを一貫して単離し、増殖能と多分化能を評価する技術です。再生医療や細胞治療の研究に応用可能です。

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この作品は、Scientific Research (C) の補助金によって支えられた (許可番号: 25461644)、若手研究 (B) (番号を付与: 15 K 19614、26860845、17 K 16298) 日本学術振興会科研費の。

この研究用ひと試料の使用は、神戸大学大学院医学部 (承認番号 1370 と 1694) の倫理委員会によって承認され、承認されたガイドラインに従って実施します。
1 UC MSCs の分離と培養
注:UC MSCs は正常に分離培養されているし、このプロトコルを拡張 (以上通路番号 4) 200 以上から UCs 受けます。200 以上の中で UCs、100% 示されている成功の UC MSC 分離増殖停止を示されている 15% と 80% 以上が巧妙な UC MSC 拡張を示されているより小さい 5% 未満が偶発的な汚染を示しています。
<ol><li>
UC を収集します。
	<ol>
<li>イーグル最小必須培地 (アルファ MEM) 4 ° C で修正された無菌のシザー、アルファの 500 mL のボトル、50 mL プラスチック チューブを準備</li>
		<li>無菌 UC 手術約 5-10 cm の長さにハサミでカットし、帝王切開で新生児の出生後すぐにそれを収集します。</li>
		<li>すぐに 50 mL プラスチック チューブに UC を配置し、アルファ MEM チューブに 20-30 mL を追加します。</li>
		<li>それは研究室に運ばれるまでは、常温 (RT) UC を格納します。 注:2 日間の RT で無血清培地で無菌の UC を格納できます。したがって、それが 2 日以内の研究室に配信される場合は、近隣病院から得られる UC を収集できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
UC を解剖します。
	<ol>
<li>プラスチック トレイ、滅菌ハサミ、鉗子、10 mL ピペット 25 mL のピペット、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 2 つ 60 mm ティッシュの培養皿の準備、精製酵素ブレンド (テーブルの材料、滅菌 PBS 濃度で再構成したを参照してください。13 Wünsch 単位/mL の-80 ° C で保存し、)、および減らされた血清中の 500 mL ボトル (材料の表を参照してください)。</li>
		<li>PBS、精製酵素ブレンド減少血清培地をウォーム アップし、右に培養液 [アルファ MEM 含む 10% 牛胎児血清 (FBS) と 1% 抗生物質抗真菌薬ソリューション (AA) の 4 ° C で保存]</li>
		<li>チューブから UC を取り出し、プラスチック製のトレイに置きます。</li>
		<li>重量を量るそして滅菌ハサミで UC の 5 g を解剖します。</li>
		<li>70% エタノール 10 mL を 10 mL のピペットを使用して殺菌のため UC に注ぐ。</li>
		<li>10 ml 2 回 10 mL のピペットを使用して PBS の UC を洗います。</li>
		<li>滅菌 60 mm 培養皿に UC を置きます (図 1ステップ 1 を参照してください)。</li>
		<li>皿に減らされた血清培地 10 mL を追加します。</li>
		<li>約 0.62 Wünsch 単位/ml の最終濃度に到達する精製酵素ブレンドの 0.5 mL を加えます。 注:伝統的なコラゲナーゼの代わりに精製酵素ブレンドの使用は、収量を改善するために示されている、UC から UC MSCs の生存率が分離されました。</li>
		<li>滅菌ハサミ鉗子 (図 12 のステップを参照) と、2 〜 3 mm の部分に UC をカットします。 注:このプロセスは約 30 分です。</li>
		<li>UC 作品を 5% CO2インキュベーターで 30 分の 37 ° C で孵化させなさい。</li>
		<li>25 mL のピペットが流れやすく小さな断片に部分的にしか消化 UC 部分をカットします。 注:このプロセスは約 30 分です。</li>
		<li>5% CO2インキュベーターで 15 時間 45 分の 37 ° C で UC の小さな断片を孵化させなさい。 注:インキュベーションは、乳剤が粘性になるまで継続する必要があります。総消化時間は約 120 分です。早産児から UCs を使用する場合ただし、消化時間短縮できますので、これらを簡単にカットして消化します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
UC MSCs を分離します。
	<ol>
<li>4 50 mL プラスチック チューブと培養液 500 ml を準備します。</li>
		<li>各管で約 7.5 mL で 25 mL のピペットを使用して 2 つの 50 mL プラスチック チューブに UC ホモジネートを分割します。</li>
		<li>各チューブに培養液 20 mL を加え、よく混ぜます。</li>
		<li>UC 由来細胞を収集するために 25 mL のピペットを使用して、新しい 50 mL 採取管の上に置かれた 100 μ m 携帯こし器を通って各 UC の磨砕液をフィルターします。 注:このプロセスは、消化の UC ソリューションは、粘着性、約 15 分をかかります。</li>
		<li>5 分間 1,000 x g で 2 つの管を遠心します。</li>
		<li>慎重に、上清を吸引し、それを破棄します。</li>
		<li>5 ml の培地の 2 つの管の細胞ペレットを再懸濁します。</li>
		<li>5% CO2インキュベーターで 37 ° C で 60 mm の板を新しい文化に細胞懸濁液を転送 (図 1手順 3 を参照)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
文化 UC-MSCs。
	<ol>
<li>トリプシン-EDTA (0.25 w/v%)、PBS をウォーム アップし、培養液 (アルファ MEM 10 %fbs と 1% の AA を含む) に RT。</li>
		<li>セルは、60 mm のプレートに接続されて、培養培地を取り除き、5 mL の破片と赤の血液細胞を削除する 2 回 PBS で洗浄します。 注:添付の電池は通常初期めっき後 3-5 日時に現れる (図 1ステップ 4 を参照してください)。</li>
		<li>週 2 回の培養液を交換し、90-100% の confluency まで 37 ° c 5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。 注:初期めっき後 7-14 日通常かかります。</li>
		<li>5 ml の PBS のセルを 2 回洗うトリプシン-EDTA の 0.5 mL を追加し、5-10 分の 37 ° C で孵化させなさい。</li>
		<li>いつセル丸くなり、分離、培養液 9 mL を加え、よく混ぜるトリプシンを不活化します。</li>
		<li>5% CO2インキュベーターで 37 ° C で 100 mm の板を新しい文化に細胞懸濁液を転送 (図 1ステップ 5 を参照してください)。</li>
		<li>週 2 回の培養液を交換し、90-100% の confluency まで 37 ° c 5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。 注:初期めっき後 4-8 日通常かかります。</li>
		<li>10 ml の PBS のセルを 2 回洗うトリプシン-EDTA の 1 mL を追加し、5-10 分の 37 ° C で孵化させなさい。</li>
		<li>いつセル丸くなり、分離、培養液 9 mL を加え、よく混ぜるトリプシンを不活化します。</li>
		<li>2 つの新しい 100 mm プレートと 37 ° c 5% CO2インキュベーターで培養に細胞懸濁液を転送 (図 1ステップ 5 を参照してください)。</li>
		<li>10 通路までサブカルチャー (1:2 分割) を繰り返します (図 1ステップ 5 を参照してください)。 注:少ない合流条件下で培養した細胞は、以前の増殖停止に到達する傾向がある、ので 1:2 の分割比で細胞を通過することが重要です。</li>
		<li>細胞表面マーカーの解析、細胞分化アッセイおよび他の実験 5 ~ 8 通路でセルを使用します。 注:できるだけ長くのための活発な増殖を保つためには、セルは一般的に以上の 70-80% 合流条件下で培養されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2 UC MSCs の表面マーカーの発現
<ol><li>100 mm プレート内のセルを準備し、1 ml のトリプシン-EDTA 5-10 分の 37 ° C での関連付けを解除します。</li>
	<li>5 分間 1,000 x g で 9 mL の培養液の遠心分離機を追加します。</li>
	<li>上清を吸引し、それを破棄します。</li>
	<li>10 ml の PBS の細胞ペレットを再懸濁します、1,000 x g で 5 分間遠心はこの洗浄工程を 2 回繰り返します。</li>
	<li>〜 1 × 106セル/mL に流れフローサイトメトリー (FCM) バッファー (PBS 2 ミリメートルの EDTA および 10% のブロッキング試薬を含む) を持つ細胞を再懸濁します。</li>
	<li>1.5 mL チューブに細胞懸濁液の 50-100 μ L に転送します。フィコエ リスリン (PE) を追加-CD14、CD19、CD34、CD45、CD73, CD90, CD105、または HLA-DR; 抗体の共役45 分間氷の上を孵化させなさい。</li>
	<li>FCM ではセルを洗浄バッファー 2 倍と 0.2% 生存率色素溶液の 50-100 μ L を追加 (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>70 μ m 携帯こし器を通って 15 分、FCM バッファー 2 倍とセルを洗浄するフィルター セルに RT で孵化させなさい。</li>
	<li>FCM を介して細胞を実行し、FCM 製造元の指示に従ってソフトウェアを使用して得られた結果を分析します。</li>
</ol>3. 過形成分化 UC MSCs の
<ol><li>
脂肪細胞形成を実行します。
	<ol>
<li>5 × 103セル/mL の濃度で培養液に細胞懸濁液を準備します。</li>
		<li>12 ウェル プレートで細胞を懸濁液の 1 mL をプレートし、37 ° c ~ 24 h の 5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。</li>
		<li>脂肪細胞分化培地と培養液を交換 (材料表参照) し, 5% CO2インキュベーターで 37 ° C で 2-3 週間。週に 2 回脂肪細胞分化培地を変更します。</li>
		<li>PBS のセルを 3 回洗浄します。</li>
		<li>室温 30 分 4% ホルムアルデヒド溶液セルを孵化させなさい</li>
		<li>洗浄のセル PBS 3 回と 60% イソプロパノール 3 回。</li>
		<li>0.5% オイル赤い O ソリューション準備 84 mg のオイルを溶解することにより赤 O の 100% イソプロパノールと 6.7 mL の追加の 10 mL の蒸留水します。20 分間常温 0.5% オイル赤い O 溶液の 1 ml の細胞を染色します。</li>
		<li>3 回 60% イソプロパノールと細胞を洗浄し、顕微鏡下で可視化します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
骨形成を実行します。
	<ol>
<li>1 × 104セル/mL の濃度で培養液に細胞懸濁液を準備します。</li>
		<li>12 ウェル プレートで細胞を懸濁液の 1 mL をプレートし、37 ° c ~ 24 h の 5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。</li>
		<li>Osteogeneic 分化培地と培養液を交換 (材料の表を参照) と 1-2 週間の 37 ° c 5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。週に 2 回、骨分化培地を変更します。</li>
		<li>PBS のセルを 3 回洗浄します。</li>
		<li>室温 30 分 4% ホルムアルデヒド溶液セルを孵化させなさい</li>
		<li>PBS のセルを 3 回洗浄します。</li>
		<li>アリザリンの 200 mg を溶解することにより 2% アリザリンレッド S ソリューションを準備 10 mL の蒸留水でレッド S。3 分間常温 2% アリザリンレッド S 溶液 1 mL の細胞を染色します。</li>
		<li>3 回 PBS で洗浄し、顕微鏡下で可視化します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
軟骨を実行します。
	<ol>
<li>1.6 × 107セル/mL の濃度で培養液に細胞懸濁液を準備します。</li>
		<li>12 ウェル プレート (存在しており文化) の井戸の中央に細胞懸濁液 5 μ L の液滴を置き、37 ° c 2-3 h の 5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。</li>
		<li>優しく軟骨分化培地 1 mL を追加 (材料の表を参照してください)、4-7 日の 37 ° c 5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。週に 2 回軟骨分化培地を変更します。</li>
		<li>PBS のセルを 3 回洗浄します。</li>
		<li>室温 30 分 4% ホルムアルデヒド溶液セルを孵化させなさい</li>
		<li>PBS のセルを 3 回洗浄します。</li>
		<li>0.05% トルイジン ブルー溶液を準備するには、500 ml の 0.1 M 酢酸緩衝液 ph 4.1 のトルイジン ブルーの 250 mg を溶解します。30 分常温 0.05% トルイジン ブルー溶液の 1 ml の細胞を染色します。</li>
		<li>洗浄のセル PBS で 3 回、顕微鏡の下で視覚化します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

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MSCs は、といったさまざまな組織から分離することができますで、同じ表現型マーカーすべてエクスプレスを行う細胞の異種集団です。ここでは、我々 は早産児と正期の幼児からコレクションと UC の郭清をガイドして UC MSCs の分離と培養したりできるようにプロトコルを説明しました。このプロトコルに従って正常に胎児・幼児妊娠 19 40 週で配信され、難治性疾患の病態のいくつかの側面を表すことを示したから ISCT 基準19を満たす UC MSCs を分離しました。期間は出生前の開発11,12。
BM 由来 Msc (BM MSCs) で若いドナー由来の BM MSCs は一般的に古い同等より大きい増殖や発生の可能性を表示し、細胞療法20,21のより多くの可能性を保持します。同様に、胎児の妊娠の 8-12...

間葉系幹細胞 (MSCs) が分離された (BM)1,2骨髄から特徴、さまざまな組織の脂肪組織、滑膜、皮膚、歯髄、胎児附属物などから取得することも3。 MSCs が増殖と脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞に分化することができますする異種細胞集団として認識されます。また、MSCs は傷害のサイトに移行し、抑制する免疫応答を調節する能力を所有している改造し、傷害を修復します。さまざまなソースからの MSCs が数移植片対宿主病、心筋梗塞、脳梗塞45,などの難治性疾患に対する細胞治療のソースとして関心を集めている現在、.
BM は MSCs の最もよく特徴付けられたソースが、BM 吸引の侵襲性は倫理的、アクセシビリティを制限します。MSCs の増殖と分化の能力がバミューダ諸島から得られた一般的にドナーの年齢とともに減少します。これに対し、胎盤、臍帯血 (UCB) など胎児附属物から得られる胎児の MSCs と臍帯 (UC) サンプリングと堅牢な増殖と分化能力6についてあまり倫理的問題を含むの利点があります。,7します。 通常は医療廃棄物として破棄される胎児の肢、間 UCB と UC と見なされます胎児器官胎盤は臍と見なされます。さらに、胎盤と UCB サンプリングし、胎盤と UC を収集、新生児の配信後に処理されるに対し、新生児の配信の瞬間に収集する必要があります。したがって、UC は細胞療法8,9有望な MSC のソースです。
人間 UC 妊娠 4-8 週で羊膜腔の進歩的な拡張の開発を開始、50-60 cm の長さまで成長を続けている、新生児配信10の全体の期間中に分離することができます。難治性疾患の病態への洞察力を得るため、様々 な妊娠年齢11,12で提供される幼児から UC 由来 Msc (UC MSCs) を使用します。このプロトコルを特定し妊娠 19 40 週で胎児・幼児から UC MSCs を特徴付ける方法をについて説明します。

<table><tbody><tr><td>50 mL プラスチックチューブ</td><td>AS One Coporation, 大阪, 日本</td><td>Violamo 1-3500-22</td><td></td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>AGC Techno Glass, Tokyo, Japan</td><td>Iwaki 3815-012</td><td></td></tr><tr><td>60 mm dish</td><td>AGC Techno Glass, Tokyo, Japan</td><td>Iwaki 3010-060</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer (100 &mu;m)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州&nbsp;</td><td>Falcon 35-2360</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー (70 &mu;m)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州&nbsp;</td><td>Falcon 35-2350</td><td></td></tr><tr><td>Alpha MEM</td><td>和光純薬 Pure Chemical, 大阪, 日本</td><td>135-15175</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>172012</td><td></td></tr><tr><td>Reduced serum medium</td><td>Thermo Fisher Scientific, waltham, MA</td><td>OPTI-MEM Gibco 31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-antimycotic</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA&nbsp;</td><td>Gibco 15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>和光純薬, 大阪, 日本</td><td>209-16941</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Takara BIO, 滋賀, 日本</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>精製酵素ブレンド</td><td>ロシュ, マンハイム, ドイツ</td><td>リベラーゼ DH 研究用グレード 05401054001</td><td></td></tr><tr><td>CD14 BD に対する PE-標識マウス一次抗体</td><td>BD バイオサイエンス, フランクリンレイクス, ニュージャージー</td><td></td>州 <td>347497 ロット: 3220644、RRID:</td></tr><tr>CD19 BD Bioscienceに対するAB_400312<td>PE標識マウス一次抗体</td><td>、フランクリンレイクス、ニュージャージー</td>州 <td></td><td>340364ロット:3198741、RRID:</td></tr><tr>CD34 BDバイオサイエンスに対する<td>AB_400018 PE標識マウス一次抗体</td><td>、フランクリンレイクス、ニュージャージー</td>州 <td></td><td>555822ロット:3079912、RRID:</td></tr><tr>CD45 BDバイオサイエンスに対する<td>AB_396151 PE標識マウス一次抗体</td><td>、フランクリンレイクス、ニュージャージー</td>州 <td>555483</td><td>Lot: 2300520, RRID: AB_395875</td></tr><tr><td>PE-conjugated mouse primary antibody against CD73</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>550257</td><td>Lot: 3057778, RRID:</td></tr><tr><td>AB_393561 PE-conjugated mouse Primary Antibody against CD90</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>555596</td><td>Lot: 3128616, RRID:</td></tr><tr><td>AB_395970 PE-conjugated mouse Primary Antibody against CD105</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>560839</td><td>ロット:4339624、RRID:</td></tr><tr><td>AB_2033932 PE標識マウス一次抗体、HLA-DR</td><td>BD Bioscience、フランクリンレイクス、ニュージャージー</td>州 <td>347367</td><td>ロット:3219843、RRID:AB_400293</td></tr><tr><td>PE標識マウスIgG1 kアイソタイプ</td><td>BDバイオサイエンス、フランクリンレイクス、ニュージャージー</td>州 <td>555749</td><td>ロット:3046675、RRID:AB_396091</td></tr><tr><td>PE標識マウスIgG2a kアイソタイプ</td><td>BDバイオサイエンス、フランクリンレイクス、ニュージャージー</td>州 <td>555574</td><td>ロット:3035934、RRID:AB_395953</td></tr><tr><td>PE標識マウス IgG2b k アイソタイプ</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>555743</td><td>Lot: 3098896, RRID: AB_396086</td></tr><tr><td>Viability dye</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>Fixable Viability Stain 450 562247</td><td></td></tr><tr><td>Blocking reagent</td><td>大日本製薬, 大阪, 日本</td><td>Block Ace UKB80</td><td></td></tr><tr><td>FCM</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>BD FACSアリア&nbsp;III Cell Sorter</td><td></td></tr><tr><td>FCMソフトウェア</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>BD FACSDiva</td><td></td></tr><tr><td>Adipogenic differentiation medium</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01</td><td></td></tr><tr><td>骨分化培地</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>StemPro 骨形成分化キット A10072-01</td><td></td></tr><tr><td>軟骨分化ミディアム&nbsp;</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>StemPro 軟骨形成分化キット A10071-01</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Polyscience, Warrigton, PA</td><td>16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Arizarin Red S</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td></td><td></td>198161</tr><tr><td>顕微鏡</td><td>キーエンス 大阪府</td><td>BZ-X700</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト臍帯由来間葉系幹細胞から早産児と正期産児の分離と性状

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

間葉系幹細胞 (Msc) はかなり治療可能性を秘めているし、バイオメディカル分野で注目を集めます。MSCs は、もともとに分離し骨髄 (BM) から特徴、脂肪組織、滑膜、皮膚、歯髄、胎盤など胎児附属物などの組織から得られる臍帯血 (UCB) と臍帯 (UC)。MSCs は、(1) 標準的な培養条件、(2) 表面マーカー発現 CD73 のプラスチックへの付着のための容量を持つ異種細胞集団+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19-/HLA-DR-の表現型、および (3) 過形成分化脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、細胞療法 (ISCT) 国際社会で現在定義されています。BM は MSCs の最も広く使用されているソースが、BM 吸引の侵襲的な性質は倫理的、アクセシビリティを制限します。MSCs の増殖と分化の能力がバミューダ諸島から得られた一般的にドナーの年齢とともに減少します。対照的に、UC から得られる胎児の MSCs 活発な増殖と分化能力などの利点があります。それは通常、医療廃棄物としてみなされると UC のサンプリングで倫理的な懸念はありません。人間 UC 妊娠 4-8 週で羊膜腔の成長を継続的に開発を開始して長さ、50-60 cm に到達するまでの成長を続け、それは全新生児の配信期間中に分離することができます。難治性疾患の病態への洞察力を得るためには、様々 な妊娠年齢で提供される幼児から UC 由来 Msc (UC MSCs) を使いました。このプロトコルでは、分離、19-40 週間の妊娠時胎児・幼児から UC MSCs の評価について説明します。

UC コレクションから MSC 文化までの手続きは、図 1にまとめます。約 5-10 cm の長さの UC は、すべての新生児の帝王から収集できます。UC は、妊娠の 4-8 週間で開発を開始して、図 2に示すように、長さ 50 ~ 60 cm まで成長を続けています。図 3と図 4に示すように、2 つの動脈 (A)、1 つ静脈 (V)、コード ライニング (CL)、Wharton のゼリー (WJ) UC があります。UC MSCs は、すべてのコード領域または全体のコード13から分離できます。早い妊娠年齢児から UC は壊れやすく、単一コード領域に郭清困難、UC MSCs は全体のコード11,<sup class="...

ひと臍帯 (UC) は、早産、用語は、結果として周産期の期間中に得ることができるし、postterm 配信。このプロトコルで述べる分離・同定 UC 由来間葉系幹細胞 (UC MSCs) の胎児・幼児から妊娠 19 40 週で。

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

この方法は、細胞治療のためのUSMSCの最良の供給源など、UCMSCの審議における主要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、早年期および期産児からのUCMSCの一貫した分離および活発な増殖を可能にすることです。この技術の意味は、難治性疾患の治療にまで及ぶ。この方法はUCMSCの審議に関する洞察を提供することができますが、脂肪組織、滑膜、皮膚、歯髄などの他のMSC源にも適用できます。一般的に、この方法の新しい個々の方法は、臍解剖および間葉系幹細胞分離のステップに非常に多くのバリエーションがあるので苦労します。この方法の視覚的なデモンストレーションは、見落とされがちな点がいくつかあるため、これらの手順を理解することが困難であるため、非常に重要です。臍帯の解剖を開始するには、まず金属トレイ、滅菌ハサミ、鉗子、10ミリリットルピペット、25ミリリットルピペット、および2つの60ミリメートル組織培養皿を準備します。温めるPBS精製酵素ブレンド、500ミリリットルの減らされた血清培地及び培養培地を、室温にする。アルファMEMの50ミリリットルチューブから以前に分離された臍帯を取り出し、プラスチックトレイに入れる。臍帯の重さを量り、殺菌したはさみを使って5グラムのコードを解剖する。臍帯を殺菌するには、10ミリリットルのピペットを使用して、その上に70%エタノールの10ミリリットルを注ぎます。その後、10ミリリットルのピペットでPBSの10ミリリットルを加えることによってコードを2回洗います。洗浄した臍帯を滅菌した60ミリメートルの組織培養皿に入れ、10ミリリットルの減らされた血清培地と0.5ミリリットルの精製酵素ブレンドを加えます。滅菌したはさみと鉗子を使用して、コードを2〜3ミリメートルに切ります。皿を5%の二酸化炭素インキュベーターに入れ、37°Cで30分間インキュベートします。その後、部分的に消化した部分を小さく切り、ホモジネートが粘性になるまで5%の二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度でインキュベートします。最後に、ホモジネートが25ミリリットルのピペットを通って容易に流れることを確認してください。まず、500ミリリットルの培養培地のボトルに4本、50ミリリットルのプラスチックチューブを調製する。25ミリリットルのピペットを使用して、臍帯ホモジュネートを各チューブに約7.5ミリリットルの2つの50ミリリットルのプラスチックチューブに分割します。その後、各チューブに20ミリリットルの培養培地を加え、よく混ぜます。25ミリリットルのピペットで各ホモジュネートを収集し、新しい50ミリリットルのコレクションチューブの上に置かれた100マイクロメートルの細胞ストレーナーを通してフィルター。遠心分離機1000gで濾過物を付けたチューブを2本、室温で5分間行います。遠心分離が終了した後、上清を慎重に吸引し、廃棄する。各チューブに5ミリリットルの培養培地を加え、細胞ペレットを再懸濁する。細胞懸濁液を新しい60ミリメートルプレートに移し、5%の二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で培養します。UCMSCを培養するために、PBS、トリプシンEDTA、および培養培地を室温まで温める。細胞がプレートに取り付けられている場合は、培地を取り除き、5ミリリットルのPBSで2回洗浄して、破片や赤血球を除去します。培養培地を加え、5%の二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度でインキュベートします。培地を週に2回交換し、90~100%の合流に達するまで細胞を培養します。その後、PBSの5ミリリットルで細胞を2回洗浄し、0.5ミリリットルのトリプシンEDTAを加え、摂氏37度で5〜10分間インキュベートします。細胞が丸くなり、剥離したら、9ミリリットルの培養培地を加え、よく混ぜてトリプシンを不活性化する。新しい100ミリメートルのプレートに細胞懸濁液を追加します。彼らは90〜100パーセントの合流に達するまで、5%の二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で細胞を成長させます。トリプシン化を繰り返し、10番目の通過まで2つの新しいプレートに分割します。UCMSCの表面マーカー発現は、その特性評価の基準として用いられた。適切な抗体をインキュベートし、フローサイトメトリーで分析したところ、MSCのシグネチャーマーカーに陽性が見つかりましたが、単球マクロファージには陰性、血液系幹細胞およびエキシセル細胞に対して陰性、B細胞に対して陰性、汎性白血球、および主要な組織適合性複合体マーカーに対して陰性であった。早産および期産児からのUSCMSCの三分化能力を評価するために、細胞は、有分細胞、骨細胞、および軟骨細胞に分化するように誘導された。UCMSCは、その分化能力を確認する3種類の中胚葉全てに正常に分化した。この手順を試みる際には、4 つの重要な手順があることを覚えておくことが重要です。コードを2〜3センチメートルに切断し、より小さな部分に切断し、ホモジネートが25ミリリットルのピペットを通って容易に流れ、100マイクロメートルの細胞ストレーナーを通してホモゲネートを濾過します。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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このプロトコルは、間葉系幹細胞および実験的移植の目的のために自己のペアを生成するために動物血清を使用することなく、内皮コロニー形成細胞の分離とその後の展開について説明します。...

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ここで我々が​​分離し、これらの組織から間葉系幹/間質細胞（MSC）の拡大が続く人間の満期胎盤から胎児と母体組織の切開のための方法を記載しています。...

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ここで、我々は、ヒト臍帯（UC）および臍帯に胎児胎盤サンプル単離のための（CL）、ウォートンゼリー（WJ）、臍帯胎盤接合（CPJ）、および胎児胎盤（FP）裏地の解剖のためのプロトコルを提示しますそして外植片培養技術を用いて、間葉系間質細胞（MSC）の特徴付け。...

ヒト臍帯及び胎児胎盤由来間葉系間質細胞の単離および特徴付け

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ひと臍帯血由来の血管内皮前駆細胞の分離

ヒト臍帯組織から間葉系幹細胞を単離し、骨格筋系統に分化させるためのプロトコルについて説明する。...

ヒト臍帯組織からの間葉系幹細胞の生成と骨格筋系統への分化

この研究は、ウォートンゼリー(WJ)の完全性を維持するための独自の鈍的解剖手順を提示し、その結果、損傷を受けたWJが少なくなり、収穫された間葉系幹細胞(MSC)の量と生存率が向上します。この方法は、従来のシャープな解剖法と比較して、優れた収率と増殖能力を示します。...

高収率で低損傷の臍帯由来間葉系幹細胞の単離

不均一なヒトUC-MSCを構成する3つの主要なサブグループの1つであるBAMBI高MFGE8高 MSCの単離は、このサブタイプの特性と機能を完全に理解するために役立ち、特定の疾患における臨床効果を改善するための将来の応用に役立ちます。ここでは、BAMBIの高MFGE8高...

ヒトBAMBI高MFGE8高 臍帯由来間葉系間質細胞の単離

間葉系幹細胞(MSC)は、可溶性因子や特定の生体材料で刺激されると、骨芽細胞系譜への分化の可能性を持っています。この研究は、ウシ骨基質ヌクボン(NKB)を足場として採用したヒト羊膜(AM-hMSC)からのMSC送達のための新しいオプションを提示します。...

ヒト間葉系幹細胞の単離および多孔質骨基質上での栽培

ヒトの筋肉に由来する主な接着細胞タイプは、筋原性細胞と線維芽細胞です。ここでは、CD56抗原に基づく磁気活性化細胞ソーティングを用いて細胞集団を濃縮します。その後、特異的抗体による免疫標識と画像解析技術の使用により、個々の細胞の細胞質および核特性を定量化できます。...

ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

このプロトコルは、9週齢のラットのbranchiomeric頭筋からの衛星細胞の単離を記載しています。筋肉は異なる鰓弓に由来します。次いで、衛星細胞は、それらの分化を研究するためのミリメートルサイズのスポットコーティング上で培養されます。このアプローチは、衛星細胞の増殖および継代を避けることができます。...

ラットヘッドBranchiomeric筋肉から衛星細胞の単離とキャラクタリゼーション

学ぶヒト臍帯由来間葉系幹細胞の分離と性状評価法。早産児と正期産児のUC-MSCを一貫して単離し、増殖能と多分化能を評価する技術です。再生医療や細胞治療の研究に応用可能です。

ヒト臍帯由来間葉系幹細胞から早産児と正期産児の分離と性状

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