Name: 大腸菌の無細胞タンパク質合成のベース: 堅牢な柔軟性とアクセス可能なプラットフォーム技術のためのプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学ぶ大腸菌由来無細胞タンパク質合成の簡便なプロトコル。初心者でも迅速かつ低コストで実施でき、機能ゲノミクスやバイオセンサー、教育用途など幅広い応用が可能です。

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著者は、博士ジェニファー VanderKelen、アンドレア ・ Laubscher とテクニカル サポートのトニー Turretto、ウェズリー ・花王、Layne ウィリアムズ役に立つ議論のためのクリストファー ・高さを確認したいと思います。著者も認める法案とリンダ霜基金、バイオ テクノロジーの創造活動助成プログラム (RSCA 2017) Scholarly、シェブロン バイオ テクノロジー応用研究基金助成、Cal Poly 研究応用センター資金・国立科学財団 (NSF-1708919)。MZL は、カリフォルニア州立大学大学院助成を認めています。MCJ は、陸軍研究所 W911NF-16-1-0372 を認めている、全米科学財団助成金 MCB 1413563 と MCB 1716766、空軍研究所優秀グラント FA8650 センター-15-2-5518、防衛脅威削減局許可ダビデとルシール パッカード財団、カミーユ ドレイファス先生学者プログラム部門のエネルギー BER グラント デ-SC0018249、人間のフロンティア科学プログラム (RGP0015/2017 年)、エネルギー省の共同ゲノム研究所 ETOP グラント HDTRA1-15-10052/P00001 とサポートのためシカゴのコミュニティ信頼でサール資金からのサポートとシカゴ医療コンソーシアム。

1. メディアの準備と細胞増殖
<ol><li>
日 1
	<ol>
<li>グリセロールから連勝大腸菌BL21*(DE3) 細胞 LB 寒天培地プレート ストックし、37 ° C で少なくとも 18 時間インキュベート</li>
		<li>121 ° C で 30 分の液体のサイクルで LB 媒体のオートクレーブ ソリューション 50 mL を準備します。常温で保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
日 2
	<ol>
<li>補足情報の説明に従って 0.4 M D-グルコース溶液 250 mL 2 x YTP メディアの 750 mL を準備します。</li>
		<li>オートクレーブの 2.5 L 困惑してフラスコとオートクレーブ 500 mL ガラス瓶の中に D グルコース溶液に 2 x YTP メディアを注ぐ。オートクレーブ 121 ° C で 30 分の液体のサイクルの両方のソリューション</li>
		<li>両方の滅菌ソリューションは 37 ° c で保存されます細胞増殖で接種時に成長率を最大化するために、次の日に実行する場合を確認します。接種までのソリューションを結合しません。 注: ソリューションは 2 x YTP メディアが汚染しやすいが、1-2 d 必要な場合のための 4 ° C で保存できます。</li>
		<li>50 mL LB 媒体の汚染を避けるため滅菌ループと生殖不能の技術を使用して BL21(DE3) の単一コロニーを再接種によって BL21(DE3) の一晩かけて培養を開始します。</li>
		<li>インキュベーターの振動 250 rpm 37 ° C に BL21*(DE3) LB 文化の 50 mL を置き、一晩 15 18 h の成長します。</li>
		<li>準備および日間、3、4 を含む必要なすべての材料を殺菌: 2 1 L 遠心ボトル、4 x 冷 50 mL の円錐管 (重さと 3 つのレコードの固まり)、多くの 1.5 mL microfuge の管。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
日 3
	<ol>
<li>揺れインキュベーターから LB の BL21*(DE3) 50 mL 一晩文化を削除し、測定分光光度計、1:10 を使用して外径600 LB 媒体で希釈。一晩かけて培養開始外径600 0.1 のためメディアの 1 L に追加する必要の体積を計算 (たとえば、1:10 希釈を 0.4 として読むの外径600原液外径600 25 mL を接種する場合は 2 の 1 L に 4.0 一晩文化を = x YTPG)。</li>
		<li>LB 文化の 50 mL と一緒に 37 ° C の定温器から温めた 2 x YTP メディアと D-グルコース ソリューションを削除します。(困惑してフラスコの側面を回避) 2 x YTP メディアに D-グルコース溶液を注ぐ無菌技術を使用して、慎重に。 注: D-グルコース添加完了 2 の 1 L のレシピ x YTPG。</li>
		<li>生殖不能の技術を維持し、0.1 外径6001 L 文化を開始する 2 x YTPG 溶液 50 mL 文化の適切な量の 1 L を接種します。すぐに 200 rpm でインキュベーターを揺れ 37 ° C に接種の 1 L 文化を配置します。</li>
		<li>成長の最初の 1 時間後を読んで初めて OD600を取る (典型的な遅れ位相が 1 h)。文化を薄めないでください。外径600に達する 0.6 まで 20-30 分毎に約外径600測定を服用し続けます。</li>
		<li>外径600に達する = 0.6、1 M IPTG の 1 mL を追加 (1 L 文化の最終濃度 = 1 mM) 2 x YTPG 文化。 注: 最適な誘導外径600は 0.6;ただし、0.6 から 0.8 の範囲は、許容範囲です。IPTG による誘導は内因性生産の T7 RNA ポリメラーゼ (T7RNAP) のためです。</li>
		<li>誘導後に、、3.0 に達するまで OD600約 20-30 分毎を測定します。 注: は、この時間の間に 4 ° C に遠心分離機を冷やします。詳細の補足情報として冷たい S30 バッファーを準備します。S30 バッファーを事前に準備する場合は、DTT は利用日まで追加されていないことを確認します。</li>
		<li>外径600 3.0 (図 2 a) に達すると、氷水浴の冷たい 1 L 遠心ボトルに文化を注ぐ。遠心分離機でバランスとして使用される等しい重量の水で満たされたボトルの 1 L 遠心分離機を準備します。 注: 吸光度値は、計測器-計測器によって異なります。BL21(DE3) の収穫の OD600は敏感な変数が、ユーザーの評価し、トラブルシューティング手段としてこの変数を最適化、それをお勧めします。小さいキュベット ベース分光光度計と比較して比較的低い外径600測定値の大きい分光光度計があります。</li>
		<li>5,000 × g とペレットのセルに 10 ° C で 10 分の 1 L ボトルを遠心します。</li>
		<li>上清から処分施設の生物学的廃棄物手順に従ってゆっくりと注ぐ。氷の上には、ペレットを配置します。</li>
		<li>滅菌へらを使用して、遠心ボトルから細胞ペレットをこすりし、冷たい 50 mL の円錐管にそれを転送します。</li>
		<li>円錐管に 30 mL の冷たい S30 バッファーを追加し、氷なしの塊と完全に再停止されるまでの短いバースト (20-30 秒) と休憩時間 (1 分) ボルテックスによって細胞ペレットを再懸濁します。</li>
		<li>ペレットが完全に再停止される一度、g、10 ° C (4 ° C に冷却済み) × 5000 で水でバランスと 10 分間遠心する別の 50 mL のコニカル チューブを使用します。 注: これは細胞を収穫するときに必要な 3 洗浄の 1stを完了します。</li>
		<li>上澄みと機関の生物学的廃棄物手順に従って廃棄を注ぐ。寒さの S30 バッファーと 10 ° C (4 ° C に冷却前) 5000 × g で 10 分間遠心の 20-25 mL でペレットを再懸濁します。 注: これは 3 洗浄の 2ndを完了します。</li>
		<li>もう一度、清と機関の生物学的廃棄物手順に従って廃棄を注ぐ。S30 バッファーとペレットを再懸濁しますして渦の丁度 30 mL を追加します。</li>
		<li>割り切れる滅菌ピペットで 10 mL の再懸濁のペレット/S30 バッファー混合物の 3 円錐管のそれぞれに 3 あらかじめ重量を量られた、冷たい 50 mL の円錐管と血清ピペット注入口使用します。 注: セルを分割 3 管必須ではありませんが、このステップの結果より小さい細胞ペレット (~ 1 g) 後の手順で利便性の向上のため。</li>
		<li>5000 × g と 10 ° C (4 ° C に冷却済み) で 10 分間、必要に応じて適切なバランスを使用して、すべてのチューブを遠心します。 注: これは最終的な洗浄ステップを完了します。</li>
		<li>上澄みと機関の生物学的廃棄物手順に従って廃棄を注ぐ。慎重に円錐管とクリーンな組織; とキャップの内側を拭くことによって余分な S30 バッファーを削除します。ペレットを触れないでください。</li>
		<li>分析用天秤にチューブを reweigh、各チューブに最終的なペレット重量を記録します。 注: プロトコルをこの時点で一時停止できます。ペレットは、液体窒素で凍結し、エキスの準備のために必要になるまでの年まで-80 ° C で保存されているフラッシュすることができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 原油細胞エキスの準備 - 4 日目
<ol><li>エキスの準備のため細胞を維持冷たい氷の上各段階。1 mL の細胞ペレットの質量の 1 g あたりの寒さの S30 バッファーを追加します。2 mM の最終的な集中に S30 バッファーに補われたそのジチオトレイトール (DTT) を確認します。 注: は、この時間の間に 4 ° C に遠心を冷やします。</li>
	<li>完全に再停止されるまで氷の上の短いバースト (20-30 秒) と休憩時間 (1 分) ボルテックスによって細胞ペレットを再懸濁します。巻き上がりが困難である場合は、解凍する 30 分間氷の上ペレットを残します。</li>
	<li>1.5 mL および microfuge の管に再懸濁細胞の 1.4 mL を転送します。</li>
	<li>ビーカーの氷水風呂に再懸濁細胞の 1.4 mL を含む 1 つの 1.5 mL チューブを配置します。45 超音波の s に続いて 59 50% で振幅の 3 総サイクル オフ s を設定。閉じ、優しくオフ期間中にミックスするチューブを反転します。合計では、再懸濁細胞 (図 3 a ・ 3 b) の 1.4 mL を含む各 1.5 mL および microfuge の管にエネルギーの 800-900 J を提供します。 注: この手順は超音波発生装置タイプに敏感とモデル使用し機器がこの手順に記載されているよりも異なる場合に最適化する必要があります。この手順で抽出量をスケール アップ 2 つの相補的なアプローチを使用できます: 1) 複数の 1.5 mL microfuge の管は、並列で超音波処理することができますおよび/または 2) より大きなボリュームは、円錐管で超音波処理することができます (最大 15 mL チューブあたり細胞を再懸濁の)、 29,45を前述したエネルギーの供給量をスケーリングします。</li>
	<li>超音波処理を完了後すぐにライセートの 1.4 mL に 1 M (補足 2 mM DTT) DTT の 4.5 μ L を追加し、ミックスする数回を反転します。氷の上には、チューブを配置します。手順 2.4 および 2.5 を遠心分離に進む前に再懸濁細胞の任意の追加のチューブ。</li>
	<li>遠心試料 18,000 × g と 4 ° C 10 分 (図 3)。</li>
	<li>上清を新しい 1.5 mL および microfuge の管にピペットします。ペレット; 操作不可します。収量を最大化する取り組みで、ペレットを混乱させるよりも純度を維持するためにいくつかの上澄みを残すことをお勧めします。</li>
	<li>(これは流出反応) インキュベーターの動揺のプラットホームにチューブをテープで 250 rpm と 37 ° C, 60 分前の手順から上澄みを孵化させなさい。</li>
	<li>遠心 10,000 × g と 4 ° C 10 分のサンプル。</li>
	<li>ペレットを乱すことがなく上澄みを除去し、新しい管にそれを転送します。ストレージのためのエキスの多くの 100 μ 因数を作成します。 注: プロトコルがここでは、一時停止にできるし、液体窒素で凍結し、株当たり反応のために必要になるまでの年までの-80 ° C で保存抽出物がフラッシュすることができます。抽出 (図 4) の生産性を損なうことがなく、少なくとも 5 凍結融解サイクルを受けてすることができます。</li>
</ol>3. 無細胞タンパク質合成バッチ形式の反応
<ol><li>ソリューション A と B、DNA テンプレート、BL21(DE3) エキス (冷凍) 場合、T7RNAP、および分子グレード水の因数分解しなさい。 注: CFPS 反応テンプレートは、補足情報を見つけることが。ソリューション A と B のレシピは補足情報を提供され、当たりの PANOx SP ベースのエネルギー システムをサポートするための多数の試薬の特定濃度に対応します。各試薬と当たりをサポートすることができますこれらの試薬濃度の許容変動の役割は、決められた50をされています。補足情報51T7RNAP の浄化のプロトコルを見つけることができます。補足 T7RNAP 体積の収量を増やすことができますが、T7RNAP はセル成長の間に誘導される場合は必要ありません。プラスミド DNA のテンプレート (pJL1 sfGFP) は、PCR 精製キット (図 2 b) を使用して処理後の DNA クリーンアップ続いてキットに洗浄バッファーを使用して 2 つの洗浄と maxiprep キットを用いて調製できます。株当たり反応の線形 DNA のテンプレートが使えます。</li>
	<li>株当たり反応のために必要の microfuge の管の必要な量をラベル付けします。 メモ: 様々 な容器サイズで反応を行うことが、小さい容器の体積蛋白質収量 (図 2) を減らすことができます。同じサイズの容器内で反応をスケーリング場合も少なく体積収量減少体積比表面積の減少により、酸素交換の機能として。100 μ L の上の反作用ボリュームを増加する場合は、底が平らなウェル プレート31,37,52を使用することをお勧めします。</li>
	<li>溶液の 2.2 μ L を追加、ソリューション B、BL21*(DE3) の 5 μ L の 2.1 μ L エキス、T7RNAP の 0.24 μ g (16 μ g/mL 最終濃度)、0.24 DNA のテンプレート (16 ng/mL 最終濃度)、そして 15 μ L の最終巻をさせる水の ng。 注: 渦解 A と反応セットアップ中によく B 成分の沈降を避けるために、各反応が各ソリューションの均質な因数を受け取ることを確認します。ボルテックス抽出物を避けるために、代わりにミックスするチューブを反転します。</li>
	<li>すべての試薬は反応に追加されている後、最終的な反応混合物が結合されて単一 15 μ L ビーズ 1.5 mL および microfuge の管の下部に確保しながら上下にピペッティングまたは軽くボルテックスによって各チューブをミックスします。</li>
	<li>4 時間または 30 ° C を一晩振盪せず 37 ° C の定温器にそれぞれの反応を配置します。 注: 正常な反応質的評価できます視覚的に当たり反応混合物 (図 3 D) 内の sfGFP 製品の緑の色に基づいて。興味の蛋白質の表現は、SDS ページ (補足図 2) によっても確認できます。</li>
</ol>4. [sfGFP] レポーター蛋白質の定量
<ol><li>よく定量化 (通常は反応チューブあたり 3 通で実行されます) に必要なそれぞれに 0.05 m HEPES、pH 8、48 μ L をロードします。</li>
	<li>インキュベーターから反応を削除します。ピペットの上下各反応を混在させるし、0.05 m HEPES、pH 8 48 μ L に 2 μ L の反応を転送します。ミックスに井戸に再び上下ピペットで移しなさい。</li>
	<li>すべての反応は読み込まれ、混合、一度、蛍光光度計 96 well プレートに配置し、sfGFP エンドポイント蛍光を測定します。 注: sfGFP 蛍光定量化のための励起と放射の波長は、485 nm、510 nm、それぞれ。</li>
	<li>以前に生成された標準的なカーブを使用すると、得られる蛍光の測定値から [sfGFP] を決定します。 注: sfGFP 蛍光強度と濃度の標準曲線を生成する手順は、補足情報 (補足図 3) で提供されます。ユーザーは、測定器の感度が異なる場合がありますので、それらの楽器の標準曲線を確立する必要があります。</li>
</ol>

著者はない競合する金銭的な利益やその他の利害の関係があることを宣言します。

無細胞タンパク質合成は、様々 な生化学システムのラピッドプロトタイピング製造に至るアプリケーションに強力な有効にする技術として浮上しています。広範なアプリケーションは、監視、操作、およびリアルタイムでの細胞機械装置を強化する能力によってサポートされます。このプラットフォーム技術の拡大の影響から、広範な適応は推移しているメソッドの実装の技術的なニュアンスのため遅い。この取り組みを通じて、新しいラボでこの技術を確立するため、シンプルさと明快さを提供するために目指しています。これに向けて、私達のプロトコル、エシェリヒア属大腸菌の-ベースの無細胞タンパク質合成プラットフォームを 4 日の起動時間訓練所非専門家、大学生 (図 1) などが実現できます。また、試薬および抽出物の在庫が生産され、一度それ以降当たりバッチ反応を設定、抱卵でき 5 h だけで定量化します。単一の 1 の L 細胞の増殖につながります 400 15 μ L 当たり反応のため十分に抽出無細胞試薬の 1 つのバッチの準備が何千もの反応をサポートできますが。試薬の準備はさらに大きなストックが必要な場合上...

無細胞タンパク質合成 (当たり) は、タンパク質の生産、機能ゲノム学、代謝工学と最後の 50 年間1,2以内に詳細のための新しい機会の数をアンロックしている技術として浮上しています。株当たり標準生体内タンパク質式プラットフォームと比較して、3 つの利点を提供します: 1) 携帯無料自然のプラットフォームの潜在的毒性や細胞の3,4 外国語になるタンパク質の製造を可能に ,5,6;2) ゲノム DNA の不活性化および興味の遺伝子を符号化する DNA テンプレートの導入が関心のタンパク質の生産への反応の中で全身のエネルギーのすべてをチャネルします。・ 3) プラットフォームのオープンな性質により、ユーザーが変更したり、反応条件とリアルタイム7,8の組成を監視します。この反応への直接アクセスをサポートしている拡張化学や新規タンパク質の生産と代謝過程2,9,のチューニングのための酸化還元状態の生物学的システムの増強10. 直接のアクセスは、ユーザーがより迅速な設計、ビルド、テスト サイクル11のシングル ポット システムで活性測定法と当たりの反応を組み合わせることもできます。紙ベースのデバイスのさらなるサポート ハイスループット探索努力とラピッドプロトタイピング12,13,14,15 または少量の水滴で当たり反応を実行する能力 ,16。これらの利点は、システムのプラグ アンド プレイの性質の結果として当たりが一意に溶けてエクスプレス体内しにくいタンパク質の生産などのバイオ テクノロジーのアプリケーションのさまざまなを有効に17、 18,19,20, 疾患21,22,23, 需要製造18,24 の検出、25,26,27、および教育28,29、柔軟性と携帯無料プラットフォームのユーティリティを表示します。
CFPS システムは様々 な原核生物と真核生物の細胞から粗野な lysates から生成できます。これにより、対象のアプリケーションによって一長一短があるそれぞれの選択のシステムで多様なオプション。CFPS システムは準備時間、コスト、および生産性にも大きく異なります。最も一般的エキス、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、昆虫細胞、大腸菌細胞、後者はタンパク質30 の最高の容積の生産に最も費用対効果されてから生成されるセルを活用.他の当たりのシステムはその生得的な翻訳後修飾機械に有利であるが、新興の大腸菌を使用してアプリケーション-ベース機械が生成 site-specifically リン酸化によってギャップを埋めることができると需要31,32,33,34,35の糖蛋白質。
株当たりの反応は、いずれかのバッチ、連続交換携帯無料 (展) または連続的なフロー セル無料 (CFCF) 形式で実行できます。バッチ形式は、その反応の有効期間は反応物と反応の抑制の副産物の蓄積の減少量により制限クローズド システムです。展と CFCF 方法、反応の寿命を延ばすし、それによってバッチ反応と比較して増加した体積蛋白質収量の結果します。これは、新しい反応の反応2コース全体で供給している反応容器から削除するタンパク質合成の副産物を許可するで。CFCF の場合は、反応室、展、半透膜36,37から成る反応室のままに興味の蛋白質の中から興味の蛋白質を削除できます。これらのメソッドは特に関心38,39,40,41,42、エクスプレス難しいタンパク質の低体積収率を克服するための貴重です 43。展と CFCF アプローチの実装の課題は、1) 一方、彼らは転写と翻訳を担当バイオ機械のより効率的な使用の結果、特に大きい増加の全体的なコストと 2 試薬量が必要)複雑な反応セットアップとバッチ形式44と比較して特殊な装置が必要です。新しいユーザーのためのアクセシビリティを確保するためにプロトコルに記載フォーカス ミリリットル スケールの反作用ボリュームを増加させるための特定の推奨事項 15 μ L の反応ボリュームでバッチ形式で。
記載方法は、細胞増殖を実装、エキスの準備、および、エシェリヒア属大腸菌の形式反応セットアップをバッチ (学生) など基本的な実験技術と非専門家を有効にする-ベースの当たりシステム。この方法は、反応のキット ベース セットアップの容易さを損なうことがなく市販のキットと比較して費用対効果です。さらに、このアプローチにより、アプリケーション実験室およびフィールド。当たりを実装するかを決める、新しいユーザーする必要があります当たりはすべてのケースで優れてはないかもしれないスタートアップ投資の従来の蛋白質の表現システムの有効性を評価徹底的に。ここで説明 CFPS 方法機能ゲノミクス、高スループット テスト、フィールドと同様に、体内式の扱いやすいタンパク質の生産を含む、アプリケーションのさまざまなを直接実装するユーザーを有効にします。バイオ センサー、合成生物学の教育キットを含むアプリケーション。代謝工学などの追加アプリケーション チューニングのタンパク質式条件、病気の検出、およびスケール アップを使用して展または CFCF メソッドはまだ可能ですが、さらに反応の編集 CFPS プラットフォームとの経験があります条件。我々 の方法は、超音波処理、次に最適化されたプレミックス45を利用して簡易 CFPS 反応セットアップを介してセル換散の比較的迅速かつ再現性のある方法と成長リッチなメディアと困惑してフラスコを組み合わせます。細胞の増殖方法はややこのフィールド内で標準化になるが、セル換散方法が異なります。一般的な換散方法のほか超音波、フレンチ プレス、ホモジナイザー、ビーズ ビーターやリゾチーム、他生化学的および物理的な中断方法46,47,48,の利用49。 私たちのメソッドを使用すると、セルの 1 L あたり原油細胞抽出液の約 2 mL が得られます。細胞抽出液のこの量は 400 をサポートできる 15 μ L 当たり反応、各生産 〜 900 μ g/mL テンプレート プラスミドの pJL1 sfGFP から記者 sfGFP 蛋白質の。この方法で費用 $0.021/μ g sfGFP 生産 ($.019/μ L 反応)、労働および機器 (補足図 1) のコストを除きます。スクラッチから始めて、このメソッドは、一人で 4 日間で実装することができ、CFPS 反応時間 (図 1) 以内に完了することができますを繰り返します。さらに、ユーザーのニーズに合わせて試薬調製の大きなバッチ量プロトコルを拡張できます。重要なは、それだけ基本的な実験技術を必要とは、ここで提示されたプロトコルを訓練所の非専門家、学生などによって実装できます。以下に説明する手順とそれに伴うビデオは、特に広範な使用のためのエシェリヒア属大腸菌株当たりプラットフォームのアクセシビリティを改善するために開発されています。

<table><tbody><tr><td>ルリアブロス</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12795027</td><td></td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>フィッシャー バイオ試薬</td><td>73049-73-7</td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>フィッシャー バイオ試薬</td><td>1/2/8013</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>S3014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム二塩基</td>性 <td>シグマ-アルドリッチ</td><td>60353-250G</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム 一塩基性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958-500G</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Mg(OAc)2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661-250G</td><td></td></tr><tr><td>K(OAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1190-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris(OAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066-500G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>ThermoFisher</td><td>15508013</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>フォリン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878-100MG</td><td></td></tr><tr><td>NTPs</td><td>ThermoFisher</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>シュウ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0963-100G</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8535-15VL</td><td></td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3144-25MG</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>860077-250MG</td><td></td></tr><tr><td>K(Glu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501-500G</td><td></td></tr><tr><td>NH4(Glu)</td><td>MP Biomedicals</td><td>02180595.1</td><td></td></tr><tr><td>Mg(Glu)2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605-250G</td><td></td></tr><tr><td>スペルミジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266-5G</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D13208-25G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>分子グレード水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>L-アスパラギン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7219-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-バリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0500-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-トリプトファン</td><td>Σ-Aldrich</td><td>T0254-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-フェニルアラニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2126-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-イソロイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2752-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-ロイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-システイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-メチオニン</td><td>Σ-Aldrich</td><td>M9625-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-アラニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7627-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-アルギニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8094-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-アスパラギン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0884-25G</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3126-250G</td><td></td></tr><tr><td>L-ヒスタジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8000-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-リジン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>L5501-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-プロリン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P0380-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-セリン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>S4500-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-スレオニン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>T8625-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-チロシン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>T3754-100G</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランドプレミアムマイクロ遠心チューブ:2.0 mL</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>05-408-138</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド・プレミアム・マイクロ遠心チューブ:1.5 mL</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド・プレミアム・マイクロ遠心チューブ:0.6 mL</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>ピュアリンク・ハイピュア・プラスミド調製キット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>K210007</td><td></td></tr><tr><td>超音波プロセッサー</td><td>QSonica</td><td>Q125-230V/50Hz</td><td>直径3.175 mmプローブ</td></tr><tr><td>Avanti J-E 遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>369001</td><td></td></tr><tr><td>JLA-8.1000 ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>366754</td><td></td></tr><tr><td>1L 遠心分離管</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A99028</td><td></td></tr><tr><td>チュネア 2.5L バッフルシェイクフラスコ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z710822</td><td></td></tr><tr><td>マイクロフュージ 20</td><td>ベックマン・コールター</td><td>B30134</td><td></td></tr><tr><td>ニューブランズウィック イノーバ 42/42R インキュベーター</td><td>エッペンドルフ</td><td>M1335-0000</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strep-Tactin XT スターター キット</td><td>IBA</td><td>2-4998-000</td><td></td></tr><tr><td>pJL1-sfGFP</td><td>Addgene</td><td>69496</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3)</td><td>New England BioLabs</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

大腸菌の無細胞タンパク質合成のベース: 堅牢な柔軟性とアクセス可能なプラットフォーム技術のためのプロトコル

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

最後の 50 年にわたって無細胞タンパク質合成 (当たり) は、試験管内のセルの転写と翻訳の能力を活用する強力な技術として浮上しています。迅速なプロトタイプで当たりを伝統的に挑戦的な蛋白質の製造の新興アプリケーションとしてアプリケーションを基礎されているセルの実行可能性を維持する必要があるし、細胞の障壁を排除することによって、代謝工学、ゲノム機能学。私たちの方法、エシェリヒア属大腸菌の実装-ベース CFPS プラットフォームは、これらのアプリケーションの多くにアクセスする新しいユーザーを許可します。ここでは、我々 は豊かなメディア、困惑してフラスコおよび可変超音波ベースのセル換散の再現可能なメソッドを使用して抽出を準備する方法を説明します。この抽出物は適切な試薬株式を事前に準備されていることを考える 900 μ g/mL 以上のデータ分析、実験のセットアップからちょうど 5 時間でスーパー フォルダー緑色蛍光蛋白質 (sfGFP) を作り出すことができる蛋白質の表現を使用できます。試薬を得る推定のスタートアップのコストは $4,500 を何千もの $0.021 産生される蛋白の μ g あたりの $0.019 μ L 反応のあたりの推定コストで反応を維持します。さらに、蛋白質の表現方法は、コストのほんの一部で、試薬中古ミックスの最適化のための市販のシステムに見られる反応セットアップの容易さをミラーします。CFPS 広範なアプリケーション用の柔軟な性質を活用するユーザーを有効にするためにさまざまな調整し、使用可能なリソースおよび蛋白質の表現の結果に応じて最適化できるプラットフォームの側面を位置付けています。望まれています。

超音波処理による大腸菌にエキスを提案した各曜日に手続き型の内訳を示す図 1の 4 日間にわたって、完了できる準備のプロトコル。毎日様々 な一時停止ポイントで完了ことができます手順に展性があるが、このワークフローを実行する最も効果的であることがわかった。さらに、細胞ペレット (ステップ 1.3.18) と完全に準備された抽出 (ステップ 2.10) の両方は、-80 ° C で安定して少なくとも 1 年間、後時17で使用するため保存するそれぞれの大きな株式を作成するユーザーを許可します。長時間にわたり安定した抽出物をただ抽出 (図 4) の生産性が大幅に低下することがなく、少なくとも 5 つの凍結融解を受けることができるも。これは冷凍庫の容量が限られている場合、複数の用途に格納される抽出のより大きい因数にできます。ただし、可能な限り抽出物の複数の小さい因数 ...

このプロトコルの詳細手順、コスト、および大腸菌を生成に必要な装置・細胞抽出液をベースし、4 日間以内の in vitroタンパク質合成反応を実装します。広範なアプリケーションは、このプラットフォームの柔軟な性質を活用するには、と最適化することができます反応条件について検討します。

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

このプロトコルは、非専門家による自己再タンパク質合成を実施する方法を簡素化し、明確にします。これらのメソッドへのアクセスを改善すると、プラットフォームと、それが可能になる広範なアプリケーションのセットをデマーケット化するのに役立ちます。この技術の主な利点は、他の自己再タンパク質合成プラットフォームと比較して、速度、費用対効果、および反応の容易さです。当社のプラットフォームは、機能ゲノミクス、ハイトホープ試験、バイオセンサー、教育キット、マイナーな変更、代謝工学、遺伝子コードの拡張など、多くのアプリケーションを可能にします。このテクニックは基本的な実験室でのトレーニングを必要としますが、新しいユーザーはプロトコルの実行を成功させるために超音波処理のような技術に慣れる計画を立てる必要があります。この手順を開始するには、テキスト プロトコルで説明したとおりに、すべてのメディアおよびカルチャの大腸菌セルを準備します。1リットルの遠心分離機ボトルを氷水浴に入れます。培養OD600が3.0に達したら、細胞培養液を冷蔵ボトルに注ぎます。ダブルビームバランスを使用して、2番目の1リットルの遠心分離機ボトルに水を加え、最初と同じ重さを計り、遠心分離機のバランスを作ります。遠心分離機を摂氏4度に予感させた後、ボトルを5,000g、摂氏10度で10分間遠心分離し、細胞をペレット化します。この後、ゆっくりと注ぎ、上清を処分します。細胞ペレットを氷の上に置きます。無菌ヘラを使用して遠心分離器ボトルから細胞ペレットを掻き取り、冷たい50ミリリットルの円錐形チューブに移します。2ミリモルDTTを補った冷たいS30バッファーの30ミリリットルを加え、ペレットがチャンクなしで完全に再懸濁されるまで氷上の休息期間で短いバーストでペレットを再中断します。この後、水で満たされた別の50ミリメートルの円錐管をバランスとして使用し、サンプルを5、000g、摂氏10度で10分間遠心します。上清を注ぎ出して処分します。ペレットを20~25ミリリットルの冷たいS30バッファーで再懸濁します。5,000 gで遠心分離機、摂氏10度で10分間。上清を注ぎ出して処分します。次に、30ミリリットルのS30バッファーを加え、前述のように渦を使用してペレットを再懸濁する。3つの事前計量、冷たい、50ミリリットルの円錐管を設定します。生殖管ピペットを含む血清ピペットフィラーを使用し、各チューブに10ミリリットルのペレット懸濁液をアリコートした。5,000 gおよび10°Cで必要に応じて適切なバランスを使用して、すべてのチューブを10分間遠心分離します。この後、上清を注ぎ出して処分します。各チューブとキャップの内側を清潔なティッシュで慎重に拭き取り、アクセスバッファを取り除き、ペレットに触れないようにします。分析バランスを使用して、チューブを再計量し、各チューブの最終的なペレット重量を報告します。まず、各ペレットに細胞質量1グラムあたり2ミリモルDTTを有する冷たいS30バッファーを1ミリリットル加える。前述のように、渦を使用してペレットを再中断します。次に、各再懸濁されたペレットの1.4ミリリットルを別々の1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移します。ビーカーの氷水浴にチューブを1つ置き、チューブの底部や側面に触れないようにソニケータープローブを配置します。振幅を50%に設定して45秒間、続いて59秒間の休息を取ります。オフ期間中にチューブを閉じて反転することを確認します。超音波処理が完了した直後に、1つのモルDTTの4.5マイクロリットルをlysateに加えます。チューブを数回反転して混ぜ、氷の上に置きます。再懸濁細胞の各チューブのDTTを超音波処理し、追加し、このプロセスを繰り返します。サンプルを18,000g、摂氏4度で10分間遠心分離します。この後、ピペット各上清を新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに入れ、ペレットが乱れないように上澄み物を残します。上清のチューブをインキュベーターの揺れプラットフォームに持ち込み、250 RPMで60分間振ると摂氏37度でインキュベートします。これは流出反応です。その後、サンプルを10,000gで、摂氏4度で10分間遠心します。ペレットを邪魔することなく、新しいチューブに移す各上清を除去します。貯蔵のための抽出物の多くの100マイクロリットルのアリコートを作成する。まず、融解液A、溶液B、DNAテンプレート、BL21DE3抽出物、T7 RNAポリメラーゼ、および氷上の分子グレード水のアリコートを含む。次に、CFPS反応に必要なマイクロ遠心チューブの必要量をラベル付けします。各試薬をピペッティングまたはボルテックスで混合し、その後、標識された反応管に溶液を加え、細胞抽出物をボルテックスせず、代わりにチューブを反転して混合するようにします。最終的な反応が十分に混合されていることを確認し、各チューブの底部に15マイクロリットルビーズに組み合わせます。摂氏37度で4時間、または一晩で摂氏30度で振ることなく、各反応をインキュベートします。まず、96ウェルプレートを取得し、定量に必要な各ウェルにpH 8で0.05モルHEPESの48マイクロリットルをロードします。次に、インキュベーターから反応管を取り除きます。各反応を上下にピペットして混合し、各反応の2マイクロリットルをHEPESを含むウェルに移します。上下にピペットを入れ、それぞれをよく混ぜます。すべての反応をロードして混合した後、プレートをフルオロメーターにロードし、励起波長485ナノメートルと発光波長510ナノメートルを使用してSFGFPエンドポイント蛍光を測定します。以前に生成された標準曲線を使用して、得られた蛍光読み取りからスーパーフォルダ化されたGFPの濃度を決定します。本研究では、超音波処理ベースの大腸菌抽出物調製物を調査する。細胞ペレットおよび細胞抽出物は、少なくとも1年間は80°Cの負の摂氏で安定している。さらに、細胞抽出物は、生産性を著しく損なうことなく、少なくとも5回の凍結融解サイクルを経ることができる。このプロトコル内の一部のステップは、システムの全体的な生産性に悪影響を及ばすことなく変更できます。最も顕著なのは、細胞抽出物生産性に大きな影響を与えることなく、600ナノメートルで2.7〜4.0光密度の範囲内で細胞を収穫することができる。しかし、テンプレートDNAの品質は、CFPS反応の体積収量に影響を与えるバッチ間変動の源です。これは、ミディまたはマキシププレップを介してDNAを精製し、続いて追加のDNAクリーンアップステップを行うことによって解決されます。反応容器はまたCFPSの反作用の容積物の収量に影響を与える。表面積対体積比の増加は、より高い体積収率をもたらします。CFPS反応の体積量を最適化し、バッチからバッチへの細胞抽出量を低減するために、新しい抽出物の調製ごとにマグネシウム滴定を行う必要があります。1ミリリットルの総タンパク質当たり30ミリグラムからなる細胞抽出物の場合、試薬の使用量を最小限に抑え、体積収率を最大化するための最適なマグネシウム濃度と抽出量はそれぞれ10ミリモルおよび5マイクロリットルです。反応スケールを変えることで、ハイスループットスクリーニングから標的タンパク質の大規模な表現まで幅広い方法を追求できます。この技術は2つの重要な利点を提供し、まずタンパク質産物をより迅速にスクリーンし、第2に、タンパク質を発現することが困難な合成を提供する。例としては、細胞毒性を持つタンパク質、またはそれらの機能に対する酸化条件を必要とするタンパク質が含まれます。他の実験室の手順と同様に、すべての試薬は慎重に扱われるべきです。さらに、遠心分離機は常にバランスをとり、耳の保護は超音波処理中に使用する必要があります。

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Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

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合成細胞を構築するための無細胞タンパク質合成システム

学ぶ大腸菌由来無細胞タンパク質合成の簡便なプロトコル。初心者でも迅速かつ低コストで実施でき、機能ゲノミクスやバイオセンサー、教育用途など幅広い応用が可能です。

大腸菌の無細胞タンパク質合成のベース: 堅牢な柔軟性とアクセス可能なプラットフォーム技術のためのプロトコル

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