Name: カンジダを使用してリアルタイム細胞フラックス解析のバイオ エネルギー調査 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 学ぼう、Candida albicansを用いたリアルタイム細胞フラックス解析によるバイオエネルギー調査法。ミトコンドリア分離不要で呼吸と糖解系を測定し、遺伝子操作や化学修飾の効果を評価できます。

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NC ラボで研究をサポートするには、国立衛生研究所 (NIH) の助成金 R01AI24499 とニュージャージー州健康財団 (NJHF) の助成金、#PC40 18。

注: は、アッセイの詳細な段階的なプロトコルには、以下、スケマティック プロトコルは図 1に示します。
1 C. albicans菌株と成長条件。
<ol><li>一晩 30 °C インキュベーター シェーカーで液体酵母エキス ペプトン ブドウ糖 (YPD) 媒体のc. アルビカンス菌を育てます。 注: 凍結する在庫としてカンジダ菌を維持し、YPD 寒天 (酵母エキス 1%、2% ペプトン、2% ブドウ糖と 2% 寒天培地) で育ちます。</li>
</ol>2. 試薬の調製
<ol><li>次のとおりアッセイ培地を準備します。<ol>
<li>ミトコンドリア機能の試金のため溶解 1.04 g ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 1640 パウダーと 2 グラムのブドウ糖 (2%)90 mL の滅菌水と暖かい 37 ° c. にメディアで5 M NaOH を使用して 7.4 に pH を調整し、滅菌水で 100 mL にボリュームを構成します。</li>
		<li>解糖系のストレス分析のため 1.04 g RPMI 1640 パウダーだけでは 90 mL の滅菌水に溶解、37 ° C にメディアを暖かく、pH 7.4 に調整。滅菌水で 100 mL にボリュームを構成します。RPMI 1640 粉末は、アッセイの中に解糖作用の指標として pH 変化を監視する重要な炭酸を持ちません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>インジェクションの化合物。<ol>
<li>滅菌水、-20 ° C で店で 1 M グルコース ストックを準備します。</li>
		<li>ジメチルスルホキシド (DMSO)、小さなボリュームで分注のオリゴマイシン株式 100 mM を準備し、-20 ° C で保存</li>
		<li>DMSO、小さなボリュームで割り切れるで 100 mM アンチマイシン A 株式を準備し、-20 ° C で保存</li>
		<li>アッセイの日に 100 mM のエタノールにシャム (サリチルヒドロキサム酸) 株式を準備します。</li>
		<li>アッセイの当日 1 M 滅菌水で KCN を準備します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3 アッセイ プレートのコーティング、ポリ-D-リジン (PDL) と
メモ: 実行すべて、層流フードの手順以下。
<ol><li>50 μ G/ml の最終的な集中させる組織培養グレードの水にポリ D リジンを溶解します。よく、分注 1.5 mL 遠心チューブに混ぜるし、長期的に-20 ° C で保存します。 注: 50 μ L/ウェルが必要であり、24 ウェル ・ 1.2 mL 必要です。したがって、因数少なくとも 1.3 mL 遠心チューブ/。</li>
	<li>ウェルあたり 50 μ L を追加し、1-2 h 対応ふた付け室温で孵化させなさい。</li>
	<li>ソリューションを吸引し、500 μ L 滅菌組織培養グレードの水との 1 時間をすすいでください。</li>
	<li>蓋を開き、乾燥空気に井戸を許可します。2-3 日間の最大値の同じ日または 4 ° C でストアにプレートを使用します。</li>
</ol>4. センサー カートリッジの水和
注: は、1 日、実験の前にこの手順を実行します。
<ol><li>余分なフラックス測定キットを開き、内容を削除します。逆さまユーティリティ プレート (図 2) の横にあるセンサー カートリッジを配置します。</li>
	<li>塗りつぶしの各 1 ml calibrant のユーティリティ板のよく、バック センサー カートリッジを配置します。(酸素と pH を測定) に蛍光物質を含んだセンサーは、calibrant に沈んでいることを確認します。</li>
	<li>37 ° C で非 CO2インキュベーターで一晩センサー カートリッジを孵化させなさい</li>
</ol>5. 成長と歯根膜被覆板の細胞を播種
<ol><li>C. アルビカンスYPD スープを接種して 200 rpm でシェーカーの 30 ° C で一晩成長します。 注: は、試金のデザインと関心に基づき、YPG または最小媒体で、 c. アルビカンスに育てることができます。</li>
	<li>試験の日、最終濃度 100 μ L あたり 10万個のセルを生成するためのアッセイ培地での細胞の適切な数を希釈します。</li>
	<li>A1、B4、C3、D6、追加のバック グラウンド補正 (図 3) のためのアッセイ媒体のみ 100 μ L の井戸を除くアッセイ プレートの各ウェルに 100 μ L の希薄化後のセルを追加します。</li>
	<li>37 ° C で非 CO2インキュベーターにプレートを転送し、プレート表面に付着細胞をできるようになる 60 分間インキュベートします。</li>
</ol>6. 試金のプロトコル
注: ここで説明したプロトコルは、楽器の 24 ウェル フォーマットです。ボリュームは、別の形式を使用する場合に調整する必要があります。
<ol><li>ミトコンドリア機能試金<ol>
<li>化合物の調製<ol>
<li>ミトコンドリア機能の試金のための 10 倍の濃度で化合物を準備: 20 mM シャム、100 μ M を準備 100 mM KCN、オリゴマイシンおよび対応するアッセイ培地で 20 μ M アンチマイシン A。</li>
			<li>50 μ l 添加 55 μ L ポート A に偽オリゴマイシン ポート B、62 μ C とポートに KCN ポート D に 68 μ L アンチマイシン A (図 4)。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>解糖系の応力測定<ol>
<li>化合物の調製<ol>
<li>解糖系ストレスの試金のための 10 倍の濃度で化合物を準備します。100 mM のグルコース、100 μ M を準備オリゴマイシン、500 mM 2-デオキシ糖 (2 DG) と対応するアッセイ培地で 20 μ M アンチマイシン A。</li>
			<li>ポート A、55 μ L に 50 μ L のブドウ糖を追加 C とポート d. に 68 μ L アンチマイシン A ポートにポート B、62 μ L 2 DG にオリゴマイシン</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>余分なフラックス測定をできる酸素消費量 (OCR) および 24 ウェル プレート形式で生きた細胞の細胞の酸性化率 (ecar と) を採用してください。事前に試金のプロトコルを設定します。</li>
	<li>余分なフラックス アナライザーを開くし、分析] タブを使用して試金テンプレートを設定セットアップ中に飛び出すすべての情報を記入するステップバイ ステップの指示に従ってください。図5 と同様にグループのレイアウトを生成します。表 1に示すように、プロトコルを設定します。アッセイの前に前もってこれらのレイアウトを設定し、コンピューターに保存します。試金の時に、[分析] タブ (図 5) にファイルを開くのオプションで対応するファイルを開き、保存されたプロトコルを復元します。</li>
	<li>10 x 化合物、calibrant を含む水分センサー カートリッジのそれぞれのポートにし余分なフラックス アナライザーのキャリア トレイにします。画面のスタートボタンを押すことによって、校正を開始します。</li>
	<li>450 μ L の最終巻をさせる細胞障害を最小限に抑えるために井戸の側面に沿って細胞板に優しくアッセイ中の 350 μ L を追加します。</li>
	<li>アッセイ プレートと calibrant を含むユーティリティ プレートを交換し、続けます。</li>
	<li>分析が完了したら、センサー カートリッジとプレートを削除します。適切な保存先フォルダーにファイルを保存します。</li>
</ol>7. データ解析
<ol><li>図 6に示すように、各パラメーター (OCR または ecar と) を選択してグループ間の差を計算するのにソフトウェアのカーブ-分散分析 (AUC ANOVA) 解析タブの下の領域を使用します。</li>
	<li>比較する必要があるグループを選択します。</li>
	<li>分散分析の分析グループに追加し、 [ok]をクリックします。 注: この AUC ANOVA 分析は、AUC はグループごとに計算し、分散分析により両者比較ファイルに新しいシートが追加されます。これは、意義を示す p 値のテーブルを与えます。</li>
</ol>

<ol><li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+killers%3A+human+fungal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).</li>
<li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+bloodstream+infections+in+US+hospitals%3A+analysis+of+24%2C179+cases+from+a+prospective+nationwide+surveillance+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study.</a> Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).</li>
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<li>Stover, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+infection+rates+in+US+children%27s+hospitals%27+neonatal+and+pediatric+intensive+care+units%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Infection+Control%22%5BJournal%5D)">Nosocomial infection rates in US children's hospitals' neonatal and pediatric intensive care units.</a> American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).</li>
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<li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+bloodstream+infections+in+pediatric+patients+in+United+States+hospitals%3A+epidemiology%2C+clinical+features+and+susceptibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Infectious+Disease+Journal%22%5BJournal%5D)">Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities.</a> Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).</li>
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<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+dysfunction+of+mitochondrial+complex+I+of+the+Candida+albicans+goa1+mutant+is+associated+with+increased+reactive+oxidants+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death.</a> Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).</li>
<li>Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+SRR1%2C+a+putative+two-component+response+regulator+gene%2C+is+required+for+stress+adaptation%2C+morphogenesis%2C+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).</li>
<li>Mavrianos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+two-component+signaling+systems+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).</li>
<li>Koch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mitochondrial+GTPase+Gem1+Contributes+to+the+Cell+Wall+Stress+Response+and+Invasive+Growth+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2555(2017).</li>
<li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+sorting+and+assembly+machinery+subunit+Sam37+in+Candida+albicans%3A+insight+into+the+roles+of+mitochondria+in+fitness%2C+cell+wall+integrity%2C+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).</li>
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<li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alternative+oxidase+of+Candida+albicans+causes+reduced+fluconazole+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).</li>
<li>de Moura, M. B., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+analysis+of+intact+mammalian+cells+using+the+Seahorse+XF24+Extracellular+Flux+analyzer+and+a+luciferase+ATP+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).</li>
</ol>

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生体エネルギー酸化的リン酸化 (OXPHOS) を測定することによってミトコンドリアの機能を読み出すための優れたツールとして余分なフラックスの試金-リアルタイム依存酸素消費量。また、リアルタイム解析で同時に細胞の酸性化率 (細胞外 pH の変更) として測定される解糖系関数を調べることがもできます。
アッセイ プレートでC. albicansの成功したメッキは、ため、培養歯根膜コーティング プレートで細胞アッセイ プレートに付着する細胞アッセイで重要な手順の 1 つは。C. albicansの付着細胞の可視化は光学顕微鏡検査によって行われます。不適切な細胞接着細胞複製間の一貫性のない測定値と測定結果に影響を与えるが、井戸に浮いている可能性があります。同様に、この分析では 100-300 pmol/分、これは最適な範囲の OCR を取得する最初のステップとしてセル数滴定を行うことが重要です。また、最適な濃度を取得する化合物の滴定は最適な応答を達成するために重要なも。これは基底の培地組成の変化があるたびに実行する可能性があります。
<p cl...

侵襲性真菌感染症は、世界中で毎年以上 150 万人を殺します。この番号は、侵害された免疫は、高齢者、未熟児、移植、癌患者1などとともに生きる人々 の数の増加による上昇には。C. アルビカンスは人間の細菌叢の一部である日和見人間真菌の菌です。また、粘膜の表面や消化管が共生生物として生息します。C. アルビカンスは、免疫不全症、手術を受けている人や長期の抗生物質のコースと扱われている人を持っている人に深刻な全身疾患を生成します。院内感染症 (NID) 人間2,3,4,5,6、7のトップ 3 〜 4 原因のうちカンジダ種のランク。カンジダ血流感染症の年間の世界的な数は、~ 400,000 症例 46 751の関連付けられている死亡すると推定されます。カンジダ症のための年間死亡率はほぼ単独で米国で 10,000 です。菌類が原因で NID の程度も、天文学的な患者費用5に反映されます。アメリカ合衆国では、侵襲性真菌感染症の治療のための年次費用は $ 20 億、すでに負担医療システムに大きな負担を追加するを上回っています。現在、利用可能な標準的抗真菌治療は毒性、ますます普及している薬剤耐性、および薬物-薬物相互作用により制限されています。したがって、ハイリスク患者に対するより良い治療の選択肢になります新しい抗真菌薬のターゲットを識別するために緊急の必要性があります。しかし、菌は真核生物であるために、真菌ターゲットに作用する新薬の発見は複雑です。これは大きく真菌特定薬剤ターゲットの数を制限します。
最近の研究は、ミトコンドリア細胞呼吸、酸素代謝、シグナル伝達、アポトーシス8 の重要なので、ミトコンドリアが耐性抗真菌薬と真菌の病原性に重要な貢献こと示されています。 ,9,10,11。解糖系と非解糖系代謝は、哺乳類のホスト12,13,14,,1516 C. albicansの生存に不可欠です。さらに、Goa1 などのミトコンドリア蛋白質に欠けているいくつかのc. アルビカンス変異 Srr1 Gem1 Sam37 等が示されている粘い、 C. albicans17,の重要な病原因子の欠陥18,19,20,21,22しますさらに、これらの変異体も示したマウス モデルにおける病原性播種性カンジダ症17,18,19,20,21 の減衰させる。 ,22。つまり、菌のミトコンドリアは、創薬のための魅力的なターゲットを表します。ただし、 C. albicansは小柄な負23、それがミトコンドリアのゲノムことがなく生き残ることはできませんを意味するためにC. albicansのミトコンドリア機能に関する研究が困難します。
ここでは、ミトコンドリアを浄化するために必要とせずC. albicansのミトコンドリアと解糖系の機能を調査するために使用することができますプロトコルについて述べる。このメソッドは、 C. albicansのミトコンドリアと解糖系の経路の遺伝的操作や化学物質の変調器の効果を調べるためも最適化することができます。

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>コーニング</td><td>MT50020PB</td><td></td></tr><tr><td>アンチマイシン A</td><td>シグマ</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>KCN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水戸ストレス キット</td><td>アジレント</td><td>103015-100</td><td></td></tr><tr><td>オリゴマイシン</td><td>カルバイオケム</td><td>495455</td><td></td></tr><tr><td>pH メーター</td><td>アキュメット</td><td>AR20</td><td></td></tr><tr><td>フェノール レッド</td><td>シグマ</td><td>P5530</td><td></td></tr><tr><td>ポリDリジン</td><td>シグマ</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>ロテノン</td><td>サンタクルス</td><td>203242</td><td></td></tr><tr><td>タツノオトシゴXF24フラックスパック</td><td>アジレント</td><td>100850-001</td><td></td></tr><tr><td>シャム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>アムレスコ&nbsp;</td><td>241</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロキシ ナトリウム ペレット</td><td>J.T Baker</td><td>3722</td><td></td></tr><tr><td>組織培養グレード水</td><td>Gibco</td><td>1523-0147</td><td></td></tr><tr><td>XF アッセイ キャリブラント ソリューション</td><td>Agilent</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物 ペプトン デキストロース</td><td>フィッシャー scientific,BP2469</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>酵母抽出物 ペプトン デキストロース 寒天</td><td>Σ</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>酵母エキスペプトングリセロール</td><td>シグマ</td><td>G2025</td><td></td></tr></tbody></table>

カンジダを使用してリアルタイム細胞フラックス解析のバイオ エネルギー調査

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

ミトコンドリアは、細胞の代謝と生存の重要な細胞内小器官です。ミトコンドリア細胞呼吸、酸素代謝、シグナル伝達、アポトーシスなどのさまざまな主要なイベントが起こる。その結果、ミトコンドリア機能障害とされる抗真菌薬耐性と病原菌の病原性に重要な役割を果たします。最近のデータは真菌の病原性に重要な貢献としてミトコンドリアの重要性の認識にもつながっています。真菌の生物学におけるミトコンドリアの重要性にもかかわらずその機能を理解する標準化された方法の発達は悪い。基底酸素消費量 (OCR) ミトコンドリア呼吸の測定と細胞の酸性化率 (ecar と)、 C. albicans系統における解糖系機能の測定を研究するための手順を紹介します。記載方法は、そのまま真菌細胞からミトコンドリアを浄化することがなく任意のサーベイランス。系統に適用できます。さらに、このプロトコルをカスタマイズすることができますc. アルビカンス菌のミトコンドリア機能阻害剤の画面に。

このプロトコルの焦点c. アルビカンス余分なフラックス アナライザーによって評価の生物エネルギー関数を決定することです。ミトコンドリア蛋白質 Mam33 に欠けているC. albicansの変異体は、その補数のひずみ、 mam33Δ/Δ::MAM33 OCR と ecar とミトコンドリア蛋白質の削除の影響を研究すると共に含まれています。推定酸性ミトコンドリア蛋白質のMAM33をエンコードし、カンジダの機能は知られていません。
余分なフラックスの試金のための携帯番号 145 pmol/分 (図 7)、100-300 pmol/分任意細胞フラックスの試金のための最適な範囲内にある OCR を示した余分なフラックスのアッセイでウェルあたり 1 x 105</s...

ここでは、余分なフラックス アナライザーを使用してミトコンドリア呼吸とカンジダで解糖系の機能を調査するための段階的なプロトコルを提示します。

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

このプロトコルは、カンジダ・アルビカンスにおける解糖機能およびミトコンドリア呼吸を決定する上で重要である。この技術の主な利点は、それがカンジダアルビカンからミトコンドリアを浄化する必要なしにミトコンドリア機能を測定することを可能にすることです.この方法は、カンジダアルビカンスまたは他の真菌病原体におけるミトコンドリアおよび解糖経路に対する遺伝子操作または化学変調剤の影響を調べるように最適化することができる。この手法は比較的簡単です。または、生物に応じて、その使用は、細胞数およびそれらのアッセイ中のミトコンドリア阻害剤の濃度を最適化するのに役立つ可能性があります。層流フードで、ポリD-リジンを組織グリッド水に溶解し、1ミリリットル当たり50マイクログラムの最終濃度にします。溶液をよく混ぜて1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブにアリコートし、チューブあたり少なくとも1.3ミリリットルをアリクォートします。アッセイプレートの各ウェルにこの混合物の50マイクロリットルを追加し、蓋をカバーし、1〜2時間室温でインキュベートします。その後、溶液を吸引します。500マイクロリットルの無菌組織培養グレードの水でアッセイプレートのウェルを一度すすい、蓋を開けて井戸を空気乾燥させます。準備した日にプレートを使用しない場合は、最大2〜3日間摂氏4度で保管してください。実験の前日に、余分なフラックスアッセイキットを開き、内容物を取り除きます。ユーティリティプレートの横にセンサーカートリッジを上下逆さまに置きます。ユーティリティプレートの各ウェルに1ミリリットルの校正剤を充填し、センサーカートリッジを元に戻します。蛍光体を含むセンサーがキャリバーに沈んでいるか確認してください。一晩、非二酸化炭素インキュベーターで37°Cでセンサーカートリッジをインキュベートします。アッセイの前日、YPDスープで調製したCアルビカンを接種し、200rpmのシェーカーで摂氏30度で一晩成長させる。アッセイの日に、アッセイ培地中の適切な数の細胞を希釈し、100マイクロリットル当たり100,000個の細胞の最終濃度を得る。希釈した細胞の100マイクロリットルを、ウェルA1、B4、C3、およびD6を除くアッセイプレートの各ウェルに加えます。これらの井戸には、バックグラウンド補正用のアッセイ媒体を100マイクロリットルだけ添加します。非二酸化炭素インキュベーターで37°Cでプレートを60分間インキュベートし、細胞をプレート表面に付着させます。テキストプロトコルに概説されているように、対応するアッセイ媒体中の10倍濃度でミトコンドリア関数アッセイ用の化合物を調製する。ポートAに50マイクロリットルのSHAM、ポートBにオリゴマイシンの50マイクロリットル、ポートCにシアン化カリウム62マイクロリットル、およびアンティマイシンAの68マイクロリットルをポートD.Nextに加え、テキストプロトコルで概説されているように、対応するアッセイ培地で10X濃度で解糖分解性ストレスアッセイの化合物を調製します。ポートAに50マイクロリットルのグルコース、ポートBにオリゴマイシンの55マイクロリットル、ポートCに2-DGの62マイクロリットル、および68マイクロリットルのAntimycin AをポートD.アッセイの前に、追加のフラックス分析装置を開き、アッセイウィザードタブを使用してアッセイテンプレートを設定します。手順に従って、セットアップ中にポップアウトしたすべての情報を入力します。グループレイアウトを生成し、テキストプロトコルで概説されているようにプロトコルを設定します。アッセイの前にこれらのレイアウトを保存します。アッセイ時に、アッセイウィザードタブのオープンファイルオプションで対応するファイルを開いて、保存されたプロトコルを復元します。次に、10X化合物を、キャリブラントを含む水和センサーカートリッジのそれぞれのポートに積み込みます。センサーカートリッジを追加フラックスアナライザのキャリアトレイに取り付けます。画面の開始ボタンをクリックして、調整を開始します。次に、壁の側面に沿ってセルプレートにアッセイ媒体の350マイクロリットルを静かに加え、最終的な体積を450マイクロリットルにする細胞の乱れを最小限に抑えます。キャリブラントを含むユーティリティプレートをアッセイプレートに交換し、アッセイを続けます。アッセイが完了したら、センサーカートリッジとプレートを取り外します。ファイルを適切な保存先フォルダに保存します。本研究では、Cアルビカンの生体エネルギー機能を、余計なフラックス分析装置によって評価する。ミトコンドリアタンパク質mam33を欠く変異体も、その補体株と共に含まれており、ミトコンドリアタンパク質の欠失が酸素消費率および細胞外酸性化速度に及ぼす影響を研究する。Cアルビカンス野生型は、細胞外フラックスアッセイに最適な範囲内にある1分間あたり145ピコモールの酸素消費率を示しています。野生型の基底酸素消費率は、mam33変異体およびmam33相補菌株は違いを示さない。同様に、株間の基底細胞外酸性化率には有意な差は見られない。しかしながら、シアン化カリウムを用いた複合体-IVを阻害することにより、野生型およびmam33変異体を、mam33相補菌株は、解糖に向かって有意なシフトを示す。mam33変異株は、しかし、化合物-IV依存経路がこの株で損なわれることを示唆する代償解糖シフトを示すことができなかった。解糖解析試験では、細胞は1時間のグルコースを使い果たし、基底酸素消費率と細胞外酸性化率を測定します。飢餓時に、mam33変異株は、他の株と比較して酸素消費量および細胞外酸性化率を有意に低く示す。これは、細胞が飢餓状態に強制されるとき、呼吸と解糖の両方のためのグルコースの利用障害を示唆しています。グルコースを注入した後、すべての株は、それらの酸素消費率と細胞外酸性化率の両方の刺激を示す。アッセイプレートのコーティングにより、カンディダ・アルビカンス細胞がプレートに付着します。カンディダ・アルビカンス細胞の不適切な付着は、アッセイ結果に影響を与える。この技術の開発後、生理学的および病理学的状態の間にミトコンドリアがどのように機能するかを扱う幅広い細胞型および疾患に採用されている。例えば、このアッセイにおいて患者由来および対照細胞を採用し、ミトコンドリア機能がどのように変化するのかの具体的な問題に対処することができる。これらの化合物は非常に有毒であるため、シアン化カリウムや抗ミシンAなどのミトコンドリア阻害剤を調製しながら注意する必要があります。

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JoVE Journal

Medicine

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このプロトコルは、細胞外フラックスアッセイを使用して初代白血病細胞の細胞外酸性化率(ECAR)と酸素消費率(OCR)を測定するための生化学的アプローチを提供します。これらの細胞の代謝プロファイルの評価は、それらの要求を特徴付けるのに役立ち、個別化治療につながります。...

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この動画では、細胞外フラックスアナライザーを使用して、活性化したヒトNK細胞のエネルギー代謝を解析する方法を実演しています。電子伝達鎖複合体のさまざまな阻害剤は、酸素消費率またはOCRを通じて測定されるATP合成に影響を与え、細胞代謝と生体エネルギー学に関する洞察を提供します。...

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細胞外フラックス分析装置を用いたマウス造血幹および原始前駆細胞における細胞生体エネルギーの評価

リアルタイム細胞代謝フラックスアッセイは、pHおよび酸素センサを使用して、ミトコンドリアおよび解糖系アデノシン三リン酸産生に対応する酸素消費速度および細胞外酸性化速度を測定する。原稿では、骨芽細胞のエネルギー状態と細胞の生体エネルギー状態の特徴付けと解釈を理解するための方法を説明しています。...

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細胞外フラックス解析を用いた単一3D微細組織スフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝の探索

代謝細胞外フラックス分析装置を用いてマウスおよびヒト好中球およびHL60細胞のミトコンドリア呼吸を測定する段階的プロトコルについて説明する。...

好中球のミトコンドリア生体エネルギープロファイルのリアルタイム測定

アルコールの誤用は、ミトコンドリア呼吸の抑制と生体エネルギー学により、肺胞マクロファージ(AM)免疫を損ないます。私たちは最近、エタノール(EtOH)への曝露がAMのミトコンドリア呼吸に対するグルタミン依存性を増加させることを示しました。本明細書では、細胞外フラックスバイオアナライザーを用いて、EtOH処理AMにおけるミトコンドリア呼吸に対するグルタミンの使用を決定する方法が提供される。...

細胞外フラックスバイオアナライザーを用いた慢性エタノール曝露による肺胞マクロファージの燃料源としてのグルタミンの評価

ここでは、骨髄、脾臓、梗塞性心筋からマクロファージを抽出し、その後、生細胞の代謝フラックスを評価する方法を詳しく紹介します。...

脾臓および心臓マクロファージおよび骨髄単球における ex vivo 代謝フラックスの解析

このプロトコルは生物発光レポーターを採用しており、 Saccharomyces eubayanus...

インビボ 酵母中の生物発光レポーターを用いた代謝移行期の転写活性のモニタリング

このプロトコルは、一次マウスのマイクログリアにおける代謝再プログラミングを定量化するために解糖系ストレステストを費用対効果の高い方法で行います。分離および炎症刺激後、新たに調製されたpH調整試薬を用いて細胞外酸性化速度(ECAR)を測定し、その後タンパク質正規化を施して解糖分解シフトの正確かつ再現性のある評価を可能にします。...

細胞外フラックスアッセイを用いた一次ミクログリアにおける解糖系の研究

学ぼう、Candida albicansを用いたリアルタイム細胞フラックス解析によるバイオエネルギー調査法。ミトコンドリア分離不要で呼吸と糖解系を測定し、遺伝子操作や化学修飾の効果を評価できます。

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