Name: 緑膿菌自動の高スループット マイクロ流体システムを使用して上のせん断応力のライブ細胞解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-16T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 学ぶマイクロ流体バイオリアクターを用いた緑膿菌バイオフィルムのせん断応力解析法。蛍光顕微鏡で被覆率や形態特性を測定し、抗菌剤処理やバイオ修復研究への応用が可能です。

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この作業によってできた助成金国立研究所からの一般的な医療科学 (日の出) (5P20GM103427)、健康国立研究所 (NIH) のコンポーネント

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マイクロ流体システムと画像解析の手順は共焦点から通常のフル三次元情報を必要としない形態の特性を決定するためのマイクロ流体バイオ実験の実行に焦点を当ててここで説明顕微鏡的研究。これらには、コロニー下地カバレッジ (パーセント適用範囲)、粗度係数、およびテクスチャ エントロピー表面粗さが含まれています。相ログにどの成長率から計算できる合計相対バイオ フィルム細胞蓄積を推定する方法について述べる。
この方法で強調する必要がありますいくつかの小さいが重要なステップがあります。アルコールとのインタ フェースを拭く行く実験から実験するが、井戸に井戸からも 1 つの実験で他の細菌の汚染を避けるために役立ちます。プライミングとシードは、非常にプライミングが乱れる事なくチャンネルを通過するメディアを許可しているチャネルを決定するユーザーを可能にするため重要なまたは目詰まり。チャンネルはありませんする必要があります空気泡無しで実験が成功の可能性を高めるためにプライミングや目詰まり後邪魔 (すなわち彼らは媒体の常に完全にする必要があります、)。シードのステップは、細菌の種類によると変えることができるし、ので細胞付着のために最適化する必要があります。たとえば、細胞が接続する場合は、表面改質は、播種前にマイクロ プレート上で発生する必要があります。 または長い孵化時間が必要であります。また、顕微鏡焦点でイメージを取得する多くの場所が正しく設定されて、品質の画像が得られることを保証するために実験を通して定期的に監視する必要があることを確認しますが重要です。フォーカスがオフの場合、顕微鏡ができ実験が続くように調整する必要があります。画像の取込時間時に、フィルターと画像関連の買収の間に発生した待機時間中に 1 つだけのチャネルに照明の暴露を避けるためにすべてを閉じるに設定最後の波長。また、モンタージュ ソフトウェア マニュアルはプロシージャを明示的に記述しませんでしたので % 表面被覆率を決定する画像解析を家の中に設計されました。さらに、画像解析を展開し、表面粗さなどの他の特性を決定するために.、オープン ソース Python ベースのコード45は gitHub のレポジトリに家の中で共有を開発しました。また、どのくらいのデータを格納およびサイヴァース46など外付けハード ドライブまたはオンラインでのデータ共有が必要なのでローカルのハード ドライブで管理することができます制限されます。
CDC 原子炉や点滴フロー炉34などの従来型バイオリアクター多くのメディアが必要、少ないサンプル サイズを提供し、機器の殺菌の高い金額を要求します。対照的に、この高いスループット プラットフォームの利点は、流量制御断能力を体外実験密接にことを前提として生体内での条件のようにあります。複数の付属品システムのデメリットし、綿密な設定が必要なソフトウェアは、イベントの正しい順序で行う必要があります。さらに、機器に用意されているマニュアルは完全に実験やソフトウェア コマンドの各ステップを説明し、チャンネル、成長または添付ファイルの欠如の目詰まりを含む、実験中にその結果、多くのミスの発生不足高品質の顕微鏡画像またはムービー。楽器自体、マイクロ プレートなどの消耗品もプレートあたり 200 ドル以上の価格のタグが比較的高価な再利用可能なは。したがって、技術は、強力な結果を貸す、一方その使用に必要な技術的な専門知識が比較的高い、分野の専門家によって繰り返し訓練が必要です。このレポートは、バイオ フィルムの特性を研究するこれらのバイオリアクターの新しいユーザーにガイドを提供することによってこの問題を解決しようとします。
細胞解析を実行することであるマイクロ流体システムの微生物学、免疫学、血液学、腫瘍学、幹細胞研究など様々 な科学的なモダリティの脚光を浴びてきてください。具体的には、技術の医療応用37,47, 口腔微生物の付着は48の決定の影響に関連性の高いトピックを記述する多くの出版物になりました緑膿菌、黄色ブドウ球菌49,50, のバイオサーファクタント ホスト病原体相互作用大腸菌51、連鎖球菌の付着52、および治療嚢胞性線維症53.のこのマイクロ システムは非常に汎用性の高い事実を考えると、ますますシステム世界全体に分散されることも予想されます。
いくつかの特定のプロトコルの手順は慎重に考慮する必要があります。メディアは dH2O 泡、目詰まりを防ぐために 50% に希釈することができますが、この場合は不要であった。外径600シードに使用の特定の値は、成長実験の試験実行を使用して特定の一連の使用条件に最適なものを参照してください決定する必要があります。シーリング前に井戸に泡マイクロ流路における気泡につながることができます、ポップまたはピペットの先端を吸い出さどちらかによって削除する必要があります。小さな蛇紋岩チャネルから細菌を保つために重要です。シード処理中に入力と出力メディアの平等なボリュームを持っていること、によってフローがシステムから圧力のためにだけ、液量からの圧力によりフローが制御されます。校正間隔は、会社代表者がインストール時にセットアップする必要があります。これらの設定は、カメラごとに固有です。
イメージの最も代表的なしきい値を見つけるときに発生するいくつかの課題があります。最大閾値の設定は背景の地域間で平均輝度、一致しないチャネルまたはプレート上の破片からセンターではないステージ位置を選択するかによって引き起こされる場合は難しいでしょう。MM 標準、プロセスをクリックし、これらの不整合を補正する背景とシェーディング補正ツールを選択します。ただし、このツールは役に立つユーザーが播種する前にチャネルの参照画像として使用できる画像を撮影している場合一般的にのみ。または、もし参照/網かけの背景画像はありません、ユーザーは、全体のイメージの背景を含むことがなく、ほとんどセル領域をカバーするしきい値を設定するのには彼らの判断を使用する必要があります。また、矩形領域のクリックによって矛盾、楕円領域、または領域を選択し、全体ではなく、アクティブな領域を選択するトレース領域の領域を除外するを測定する代表的なエリアを選択します。画像地域統計を表示ウィンドウ (分析ツール) の下で。代表的な地域が活用された場合しきい値明視野イメージ、同じ地域は対応する FITC イメージの測定の使用必要があります。特定空間統計 (左、上、幅、高さ、エリア、境界) 同じ地域が発見されるので、その代表的な地域に関連付けられていると便利だし、対応する FITC イメージで測定されます。
遅くコンピューターは、ハード ドライブ上のデータの蓄積を防ぐためには、外付けハード ドライブは、データ ストレージの購入できます。データ ストレージとデータ共有促進のための別のオプションは、サイヴァース バイオインフォマティクス プラットフォームです。サイヴァース システムにアカウントを作成するには、http://www.cyverse.org/ に行きます。ログインすると、探索環境を起動し、「サイヴァースのログ」を選択します。「データ」を選択しフォルダーをしています。画像のスタックがローカル コンピューターにある場合は、「アップロード」し、「デスクトップからシンプルなアップロード」を選択します。画像のスタック ファイルを検索し、アップロードを選択します。もし彼らがサイヴァース アカウントとアクセス許可が付与されます、ファイルまたはフォルダーを共同編集者と共有できます。一般にデータのフォルダーの共有には、メタデータを使用して各ファイルのサイヴァース承認された規格追加する必要があります。この仕事の範囲内ではありませんのでこの手順はここで説明しません。

ここでは、デモンストレーションを蛍光の形成に及ぼすせん断応力の測定方法マイクロ流体高スループット自動化されたシステムを使用して緑膿菌(P. aeruginosa) PA01 バイオ フィルム。
バイオ フィルム主催、サポートにアタッチされており、液体と固体の表面1間のインターフェイスでは、通常発見する細胞外高分子物質、細菌などの微生物のコミュニティであります。これらのバイオ フィルムのコミュニティは、水質改善水の供給ラインおよびバイオレメディエーション難分解性化合物2,3など、環境に有益なことができます。ただし、バイオ フィルムは、高い望ましくない結果と人間の健康に有害なことができます。たとえば、股関節および膝関節インプラントなどの医療機器、バイオ フィルム蓄積の挑戦されている重度医療の合併症4,5を引き起こす表面の一種です。バイオ フィルムは川や湖などの自然の水システムを入力し、感染6,7,8で飲料水の細菌汚染につながる水道管に侵入できます。海洋環境で形成されたバイオ フィルムは船や他の人工基質に付着し、高められた摩擦増加燃料消費9,10につながる主要な経済と環境の問題を提示します。抗菌コーティング、トリブチルスズなどこれらの問題を防ぐために開発されているが、海洋生物11に有毒であります。
膿は、さまざまな環境および nutrimental 条件12の高の盛んな機能を持つグラム陰性菌です。膿はコミュニティと院内感染の一般的な原因し、密接にするに関連付けられている重度のやけどや易感染宿主などの怪我など、嚢胞性線維症 (CF)5,12、発見 13、エイズおよび癌患者5,13。P. 緑膿菌バイオ フィルムの形成は、最も深刻な慢性肺感染症がこの病気の5のための死の主要な原因を CF に接続されています。
膿PA01、参照株はこのレポートで使用され、強化された緑色蛍光タンパク質 (PA EGFP) を表現する遺伝子組み換えです。EGFP は蛍光顕微鏡14,15,16を用いたバイオ フィルム解析その場を可能にする大きい蛍光特性と GFP の変異フォームを表します。このタイプの蛍光分析は、細胞の成長と機能17GFP が大幅に干渉しないためにバイオ フィルムの調査のため便利です。たとえば、GFP をタグ付けされたエシェリヒア属大腸菌細胞制御細菌17と比較して任意の毒性の影響を被ったなしも継続的で成長。他のレポートは、この請求項18,19,20を立証します。なお、EGFP など蛍光レポーターの使用は迅速かつ簡単なしかし、死んだ細胞はすぐに21の蛍光を発するすることをやめるためにのみ生きているセルが測定されます。
バイオ フィルムは、流量が異なるとのそれらを含む様々 な環境条件下で育てることができます。たとえば、映画は河川、高水分の流れが大きい微生物多様性22につながるよう高剪断応力で育てることが。これに反して、池や口腔バイオ フィルムの淀んだ水は、大いに低いせん断力23を経験します。流量、に加えてバイオ フィルム接着、表面粗さ、疎水性、メディアの構成などに影響を与えるその他の要因があるし、細菌も細胞表面1,4,7, 24. 条件空間構造やバイオ フィルムの形態の変化を引き起こす可能性がも。これは流体によって加えられるせん断応力などの環境条件が含まれていますまたはシステム、細胞の運動性と特定の蛋白質が、細胞外に存在に存在する栄養アベイラビリティと種など生物学的要因でグラデーション高分子物質25,26,27。いくつかの条件の下で、バイオ フィルムになる芝生のようなバイオ フィルムが大まかな、ふわふわ、あるいはキノコのような28の他の条件の下で (滑らかでフラット), しばらくの間。体系的かつ定量的な顕微鏡画像でバイオ フィルムの芝生とマッシュルーム構造の質的な違いが明確に見られる、膜構造と映画内で生物学的過程との関係を理解することが必要です。形態を記述するための方法。気孔率、フラクタル次元、拡散長下地、コロニーのボリューム、粗度係数、およびテクスチャ エントロピー29,30 のコロニー領域などの研究のための研究者によって提案された形態の特性.
バイオリアクターは、現実の生活条件31を模倣するバイオ フィルムの研究に使用されます。点滴流反応器 (DFR) は、メディアの栄養素が高い細胞密度32バイオ フィルムを形成するため時間の経過とともに表面に添付のセルにゆっくり流れる低剪断環境を表します。CDC 原子炉、バイオリアクター メディア内で回転が継続的に攪拌棒の制御による高せん断応力流体環境を作成する満ちているタンク33。バイオリアクターのこれらのタイプは、設定が簡単ですが比較的低いサンプル サイズ、メディア、メディア滴り流れ 125 μ L/分ドリップ フロー炉に至るからバイオハザード廃棄物の大量の高消費電力のためスコープ内に制限されます。以上 1 mL/分 CDC 原子炉のガラス製品や廃棄物のメディアのための34のオートクレーブ大量に必要。バイオ フィルムは点滴フロー炉の表面を横切ってメディアの低剪断を引き起こすため緑膿菌大型コングロマリットを引きずって、バイオ フィルムの成長は非常に滑らかではありません、不均一なサンプルをすることはできませんので均等に成長しません。蛍光顕微鏡35,36を使用して分析します。
いくつかの一般的なバイオリアクターの制限事項は、マイクロ流体媒体スループット バイオリアクター、メディアのミリリットルのみは必須で、オートクレーブ37後リアクション プレートが小さく、容易に使い捨てを使用によって克服します。さらに、実行すると、意味のある統計解析を行うデータの十分な量を提供するちょうど 1 つの原子炉で、井戸の数、に応じて多くのレプリケーションを実行できます。図 1に温度を含む制御の条件およびフロー率3839,40,,マイクロ顕微鏡システムのさまざまなコンポーネントが表示されます。バイオリアクター下 PA01 に EGFP タグの蛍光性を可視化する蛍光顕微鏡低環境または生物医学分野が発生したより現実的なシナリオを模した高剪断条件によって適用された結合されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig1.jpg"> 図 1: マイクロ流体システムの個々 のコンポーネントです。個々 のコンポーネントが左から右に表示されます: 1 CCD カメラ 2。 自動ステージ、自動蛍光モジュール、およびオート フォーカス モジュール、3 と高解像度倒立顕微鏡。 プレート ステージ、4: イメージング システム インターフェイス、5: マニュアル顕微鏡ステージ。コントロール、6: 蒸気トラップ、7: イメージング システム コント ローラー (含む温度コント ローラー)、8: ハードウェア コント ローラー、9: 蛍光コント ローラー、10: 無停電電源装置、11: 12 画像ストレージ外付けハード ドライブ: PC ワークステーション。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
マイクロ プレートの抜粋を図 2に示します。最も一般的に使用される板は 48 井戸から成っています。1 つの実験では、1 つの入口と一つの出口の井戸、2 井戸の合計を必要があります。これにより細菌の緊張など、さまざまな実験条件で実行できる 24 の同時の実験抗菌処理とメディア様々 なチャンネルからチャンネルへと六つのチャネルの各列のせん断流れを制御できます。実験の温度も、プレート全体で 1 つの温度設定で制御されます。マイクロ流路は、各チャンネルが十分な背圧と制御を提供する蛇紋岩地域であることを示します。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig2.jpg"> 図 2:マイクロ チャンネルと表示ウィンドウの可視化します。それらを接続するマイクロ チャンネルの 2 つの入口と出口の井戸は、赤と緑の染料で強調表示されます。染料は、流体の流れの中に十分な背圧制御を作成する各チャンネルでの蛇紋岩地域を表示にします。(赤円内) 各表示チャンネルご希望の波長とイメージを作成することができます。例は、明るいフィールド (上) と (下) 蛍光顕微鏡 20 × 対物を用いた PA01 EGFP バイオ フィルムの単一チャネルの画像。スケール バー = 80 μ m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
ステップバイ ステップ ガイドは、異なるせん断環境を使用して新規バイオ実験を行うための蛍光顕微鏡と結合されているマイクロ バイオリアクターのユーザーを許可するように提供しています。このメソッドは、細菌、菌類、藻類、医療と環境のアプリケーション41,42,43などのほかに他の微生物を含む実験の拡大のためになります。詳細なアプローチは PA01 EGFP を文化し 48 ウェル プレートに接種、マイクロ流体デバイスとソフトウェアを設定、蛍光顕微鏡を設定し、バイオ フィルムのカバレッジ、成長率を取得するソフトウェアの分析を示す方法を説明しますと表面粗さなどの形態学的プロパティ。

<table><tbody><tr><td>塩化アンモニウム、ACS</td><td>VWR</td><td>BDH9208-500G</td><td>最小媒体組成の一部</td></tr><tr><td>BioFlux 1000 48 ウェル低せん断板</td><td>Fluxion Biosciences</td><td>910-0047</td><td></td></tr><tr><td>BioFlux 1000Z マイクロ流体イメージングシステム</td><td>Fluxion Biosciences</td><td>BF 1000Z</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水素化物、ACD グレード</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td>最小媒体組成の一部</td></tr><tr><td>デキストロース、無水、ACS</td><td>VWR</td><td>BDH9230-500G</td><td>最小培地組成の一部</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム ACSグレード</td><td>VWR</td><td>EM-MX0070-1</td><td>最小培地組成の一部</td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性、ACSグレード</td><td>VWR</td><td>BDH9268-500G</td><td>最小培地組成の一部</td></tr><tr><td>Pseudomonas Aeurginosa GFP</td><td>ATCC</td><td>15692GFP</td><td>この研究に使用したGFP修飾を施したPseudomonas aeurinosa細菌株PA01。</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム、ACS</td><td>VWR</td><td>BDH9286-500G</td><td>最小限の培地組成の一部</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム、一塩基性、無水、試薬グレード</td><td>VWR</td><td>97061-942</td><td>最小限の培地組成の一部</td></tr></tbody></table>

緑膿菌自動の高スループット マイクロ流体システムを使用して上のせん断応力のライブ細胞解析

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

蛍光顕微鏡と相まってバイオリアクター体外より高いスループット マイクロは細菌のバイオ フィルムの成長と形態、緑膿菌(P. aeruginosa) などを研究に使用されています。ここでは、システムを使用して成長カイネティクスと表面粗さと膿ひずみ強化された緑色蛍光タンパク質 (PA01 EGFP を表す PA01 のテクスチャ エントロピーなど形態学的性質を検討する方法について述べます).詳しいプロトコルは成長し、PA01 EGFP 文化をシードする方法を記述する、設定する方法顕微鏡と自動実行と成長率とせん断力によって制御されるさまざまな使用形態の特性を決定する画像解析を行う、マイクロ流体デバイス。この記事では、最終的に、マイクロ流体プラットフォームを使用して細菌、菌類や藻類のバイオ フィルムの他の系統へ適用できる PA01 EGFP バイオ フィルムの研究を改善する技術の詳細な説明を与えます。

図 4示しますパーセントどちらられるエリア時間をかけて 0.2、0.5、および 1.0 のダイン/cm2のせん断流れで実行 24 h から。バイオ フィルム カバレッジまたはパーセントしきい値表面積 (C [%]) はすべての 3 つの耐震設定違っていた。バイオ フィルム報道だった 1.0 ダイン/cm2せん断で最速 100 2-5% から増加したしきい値] 領域の成長の 200 分後 @0 分後静止した段階に達したと。0.5 ダイン/cm2、バイオ フィルム取材が遅れたし、400 分の 800 分後 100% の範囲に達し増加し始めた。0.2 ダイン/cm2で最も低いせん断パーセント適用範囲が 500 分増加し始め、65% のしきい値領域を越えて達したことはなかったバイオ フィルム取材で最も遅い増加が明らかになった。せん断は、バイオ フィルム表面被覆率に直接影響を与えたと推察されました。高いせん断メディアが提供したより多くの栄養素を持つ細菌バイオ フィルムより速く増殖できるという事実のために、バイオ フィルムの成長のより最適な状態となるように見えた。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig4.jpg"> 図 4: 期間 24 h 以上 0.2、0.5、および 1.0 のダイン/cm の2を使用して時間をかけて) パーセントしきい値領域 (C [%]) をパーセントしきい値] 領域、合計バイオ蓄積、粗度係数、およびテクスチャ エントロピー。 。せん断条件ごとに 1 つのチャネルから取得したデータ。b) 期間 24 h 以上 0.2、0.5、および 1.0 のダイン/cm の2を使用して時間の関数としてバイオ フィルム蓄積 (相対値) の合計します。黒い線は指数関数モデルに最小二乗フィットです。せん断条件ごとに 1 つのチャネルから取得したデータ。PA01 EGFP の c) 粗度係数 0.2、0.5、および 1.0 のダイン/cm のせん断応力値を使用して2以上 24 時間データを監視は、せん断条件ごとに 1 つのチャネルから得られました。PA01 EGFP の d) テクスチャ エントロピー 0.2、0.5、および 1.0 のダイン/cm2.のせん断応力値を使用してせん断条件ごとに 1 つのチャネルから取得したデータ (Valquier ・ フリン、h.、Sutlief、アダムローリー、ウェントワース、C.D.、2018)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
図 4b 図 4で示されている結果と一致。バイオ フィルムの蓄積 (N[rel]) は、イメージの時点で GFP シグナルはその位置にある生細胞密度に比例したという前提に基づいて測定しました。合計相対測定バイオ フィルム蓄積増加期間、24 h 以上 0.2、0.5、および 1.0 のダイン/cm2の使用時間の関数として、最低のせん断応力をせん断応力の最大値から減少した成長率を示します。量的成長率を計算できる指数関数的成長を与える明確な期間があります。
図 4cは、0.2、0.5、および 1.0 のダイン/cm2のせん断流れの粗度係数 (Rを) を示します。粗、粗度係数によって量を示されるフィルムの厚さプロファイルの差異を計測します。正式な定義は、します。
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58926/58926eq1.jpg">
平均厚さは、 Tは私がある私-th 厚さ測定、 T、 N厚み測定30数。この調査で説明されている手順は、生きている細胞に関連した厚みを測定します。セルのフラット配置の厚さは平均値からの変動が大きいが 1 より大きい粗度係数をもたらすながらゼロの粗度係数が得られます。成長率とフィルムのパーセントしきい値カバレッジのせん断の影響と同様に、バイオ フィルムは、時間の経過とともに異なる地形を展示しました。全体的にみて、R、減少したすべてのサーフェスが滑らかになってきたことを示すすべての剪断条件の期間。ただし、0.2 ダイン/cm の低い剪断と比較して 0.5 と 1.0 ダイン/cm2の高耐震設定の高速剪断流れがスムーズかつよりも表面との最も高いせん断力を寄与していることを示す時間の経過とともに表面がなめらかで結果1.0 ダイン/cm2 0.2 Rを下に達する。
滑らかさ、規則性、または表面の粗さは、テクスチャのエントロピー (TE) で表すこともできます。TE は、2次元画像のランダム性の度合いを測定する画像解析で使用されるプロパティです。その計算が Haralickらによって定義された灰色レベル共起行列に基づきます。、別場所44ピクセル値を持つ 1 つの場所でピクセル値を相関するかどうかを見ています。相関関係の高度は、低エントロピーに します。図 4dは、0.2、0.5、および 1.0 のダイン/cm2のせん断流れで TE を示しています。TE は、すべて耐震条件が 1.0 ダイン/cm 最大テ (1.0) 900 分で低いせん断応力よりも以前に達した最高の剪断応力のための時間で増加。0.2 ダイン/cm2の最低のせん断強度は、1,000 分後に最大値に達し低 TE (0.8) を持っていた。ただし、0.5 ダイン/cm2の中間のせん断応力高または低擅断応力状態よりもずっと後の最大のテ (1.2) に達した。
粗度係数と TE は、さまざまな機能を測定します。フラット フィルム低粗度係数と低エントロピーを持っているだろう、厚さの大幅な変化とフィルム高粗度係数を持っていると思いますが低エントロピー変化は正弦波ではなく、ランダムな場合。この場合、R、減少増加剪断応力および時間と剪断応力が時間の経過とともにバイオ フィルム形成に適用される直接テ傾向を関連付けることができません。
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/58926/58926figS1.jpg"> 図 S1: イメージ コントロール ソフトウェア windows のキャプチャします。マルチ次元取得メニューのソフトウェアには、(上) が開きます。制御モジュールは、自動実行 (下) に設定します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/58926/58926figS2.jpg"> 図 S2画像データを確認するためのソフトウェアのキャプチャします。分析ツールメニューからレビュー多次元データツールを使用して目的のデータ セットを選択した後アプリケーション ウィンドウ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

ここでは、楽器を含め、緑の蛍光蛋白質を表現する緑膿菌バイオ フィルムに対するせん断応力効果の分析のための蛍光顕微鏡と相まって高いスループット マイクロ バイオリアクターの使用について述べるバイオ フィルムのカバレッジ、成長率および形態的特性の測定を設定します。

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

この方法は、バイオフィルムの成長や開発中の行動特性に影響を与える主要な環境条件の特定方法など、バイオフィルム開発に関する重要な質問に答える上で役立ちます。この技術の主な利点は、多チャネルのマイクロ流体プレートが、統計的に有意な結果の迅速な取得を可能にすることです。この方法は、バイオフィルム構造に関する洞察を提供することができますが、抗生物質治療、およびバイオレメディエーションの研究にも適用できます。一般的に、この方法に新しい個人は、プロトコルの詳細と細心のスキルに注意が必要であるため、苦労します。ソフトウェアへの機器の接続エラーを回避するには、まずPCワークステーションをオンにし、次に蛍光モジュールをオンにします。蛍光シャッターがオンになっていることを確認し、ハードウェアコントローラの電源を入れます。次に、撮像システムコントローラとCCDカメラの電源を入れます。次に、イメージングステーションの電源を入れます。すべての機器の準備ができたら、制御アプリケーションを起動し、プレートの側面のラベルにあるプレート番号を入力します。プライミングの場合は、まず、プレートの底部にあるガラス表面に触れることなく、パッケージから48ウェルマイクロ流体プレートを取り出し、プレート下部のガラススライドをレンズティッシュで洗浄します。マイクロ流体チャネルをプライミングするには、37°Cのピペット200マイクロリットルの最小限の媒体を出力ウェルに入れ、気泡を避けるように注意してください。その後、プレートをプレートステージに置きます。インターフェースをエタノールで拭き取り、エタノールが乾燥したらプレートステージにシールします。コントロールモジュールの手動モードでは、流体をルリア・ベルタニブロスを摂氏37度、最大シウ素を1平方センチメートルあたり5回のdymとして設定します。出力ウェルをクリックして出力から入力ウェルへのフローをアクティブにし、チャンネルをプライミングします。5分後、フローを一時停止して播種の準備をし、プレートをステージから慎重に取り除きます。次に、マイクロ流体チャネルにつながる内円から任意の媒体を除去することなく、出力ウェルから任意の残留媒体を吸引する。実験チャネルをシードするには、最小限の培地を300マイクロリットルずつ入力ウェルに加え、その後300マイクロリットルの細菌培養液を出力ウェルに添加します。プレートをイメージングステージに戻し、プレートに置く前にエタノールでインターフェースを拭き取り、ライブカメラフィードを使用して単一のチャンネルに焦点を当てます。ライブフィードを目視でモニタリングしながら、約2〜4秒間1〜2日数センチメートルで流れを再開し、細胞がサーペンタインチャネルではなく実験チャネルに入ることを可能にし、温度制御されたステージにプレートを1時間放置して、細胞が付着するようにします。取り付け期間の終わりに、慎重にステージからプレートを取り出し、チャネルを乱すことなく、出力ウェルから細菌を吸引します。次に、新しいピペットチップを使用して、入力ウェルから媒体を取り除きます。ソフトウェアでは、多次元取得を開いて顕微鏡画像取得を制御し、タイムラプス、多段位置、および複数波長を選択する。保存タブで、単純なベース名を作成し、ファイルが存在する場合は、ベース名がチェックされていることを確認します。実験の基本的な詳細を説明に含めます。[ディレクトリの選択] をクリックして、すべてのファイルが保存されるフォルダを選択して[時間経過]タブで、実験時間の期間を24時間に調整し、実験全体を通して5分ごとに画像を取得する時間間隔を設定します。ライブカメラフィードと10xの目標を使用して、プレートに刻まれたチャンネル番号の上または下に位置するチャンネルの中心に焦点を合わせ、ステージ位置を設定します。20xの目標に切り替え、チャネル内の最適な表示領域と焦点面を見つけます。次に、新しい設定でステージの位置をリストに追加します。波長メニューの下で、波長の数を3に設定し、最初の波長をFITC 100%カメラに設定し、10ミリ秒の露光時間、2番目の波長を明視野50%カメラ50%可視に設定し、3ミリ秒の露出時間を最小限に抑え、3番目の波長を閉じたままにします。[AutoRun の編集] メニューで、[プロトコル設定] タブを開き、適切な実験せん断速度でフローを順方向に設定した 24 時間の期間で新しいプロトコルを設定します。[追加] をクリックして名前を付けて保存し、プロトコルを保存し、[シーケンス設定] タブを開きます。新しいシーケンスを設定するには、すべてのチャネルのデフォルトの流体として、37 度のルリア-ベルタニブロスを選択します。チャンネル 1 ~ 12 のステップ反復 1 で、最初の実験せん断速度でプロトコルを選択し、すべてのチャネルを有効にします。チャンネル 13 ~ 24 では、第 2 実験せん断速度でプロトコルを選択し、すべてのチャネルを有効にします。次に、[適用] と [名前を付けて保存] を選択してシーケンスを保存し、[自動実行] メニューを開いて、自動実行に使用する保存済みのシーケンスを選択します。時取り成長バイオフィルム実験をセットアップするには、最大1300マイクロ流体プレートの入力ウェルに無菌最小培地を加え、そのプレートをイメージングステージに戻します。その後、インターフェースをエタノールで拭き取り、プレートを密封します。プロトコルとシーケンスが正しく設定されていることを確認します。[開始]を選択して自動実行を開始し、すぐに[取得]をクリックして顕微鏡画像コレクションを開始します。最初の画像取得の最後に、一時停止をクリックし、明視野の波長でライブ画像モードを選択します。[移動] を選択して各ステージ位置を表示し、[現在に設定] を選択して新しい設定を設定します。次に、次の予定取得を開始する前に、[再開] をクリックします。この代表的なタイミング付きバイオフィルム成長実験において、バイオフィルムカバレッジ、または閾値表面積パーセントは、3つのせん断設定すべてで異なっていたが、せん断がバイオフィルム表面カバレッジに直接影響を与えたことを示す。バイオフィルム蓄積の総相対測定は、時間の関数として増加し、成長速度は最も高いせん断応力から最も低いせん断応力まで減少した。それぞれの条件の下で、定量的な成長率を計算できる指数関数的成長の明確な期間もあった。全体として、すべてのせん断条件下で時間の経過とともに粗さ係数が低下し、バイオフィルム表面のすべてが滑らかになったことを示しています。ただし、最も低いせん断に比べて、せん断設定が高いほど、時間の経過とともにサーフェスが滑らかになっており、より速いせん断流がより滑らかで均一なサーフェスに寄与することを示しています。また、このテクスチャエントロピー、または形態におけるランダム性は、すべてのせん断条件に対して時間の経過とともに増加した。この手順を実行する場合は、指定されたシーケンスに従い、各手順を正確に実行する時間を取ることを忘れないでください。必要なスキルは、マスターにいくつかの実行を取ることができます。この手順に従って、HBLCまたはGCMSのような他の方法は、グルコースなどのサブストレートの濃度に関する追加の質問に答えるために、消費される。開発後、この技術は、バイオフィルム分野の研究者が制御された実験条件とハイドロセラピーサンプリングで一般的なフロー環境をリアルタイムで探索する道を開きました。BSL2細菌株での作業は非常に危険であり、適切な保護具の着用や適切な廃棄物プロトコルの使用などの予防措置は、この手順を実行する間は常に行われるべきであることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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学ぶマイクロ流体バイオリアクターを用いた緑膿菌バイオフィルムのせん断応力解析法。蛍光顕微鏡で被覆率や形態特性を測定し、抗菌剤処理やバイオ修復研究への応用が可能です。

緑膿菌自動の高スループットマイクロ流体システムを使用して上のせん断応力のライブ細胞解析

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緑膿菌自動の高スループット マイクロ流体システムを使用して上のせん断応力のライブ細胞解析

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