Name: 子宮内開発のマウスの脳および脊髄の伝達の後の微細構造神経可塑性パラメーターの評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 学ぶ 子宮内発達段階における神経可塑性の微細構造変化をマウスで評価する方法です。透過型電子顕微鏡と子宮内トランスダクションを組み合わせ、神経系の形態学的変化を高解像度で観察できます。

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動物の主題のすべてのプロシージャは、ハンブルク、ドイツのノルトライン ・ ヴェストファーレン州の州の動物倫理委員会によって承認されています。 滅菌器具、手袋、外科プロシージャ全体で無菌のコートを使用します。
1. 子宮伝達で
<ol><li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ph 7.4 でアデノ随伴ウイルス タイプ 1 (AAV1) (4 x 1011ウイルス粒子/μ AAV1) の目的のターゲットのためのコーディングを準備します。0.1 mg/μ L の高速グリーンを追加し、37 ° C で AAV1 高速グリーン混合物を保持</li>
	<li>目的の形をした薄いキャピラリー先端を準備 (80 μ m と内側の外側の直径、長さ 8 mm 直径 50 μ m)、マイクロ ピペットの引き手を使用して (設定: 圧力 = 500、熱 700、プルを = = 0、速度 = 80、時間 = 200、材料表を参照してください ).それは 4-5 mm、キャピラリーの先端を破る。</li>
	<li>キャピラリーの先端に吸引器チューブ (44 × 0.7 cm) をアセンブルし、毛細血管に AAV1 高速グリーンの混合物の 15 μ L を吸引します。</li>
	<li>プロシージャ全体で 37 ° C の一定の生理的体温で動物の科目を維持します。</li>
	<li>エームスプレインキュベーションの商工会議所に妊娠 c57bl/6 マウス (萌芽期日 14.5) を置き、麻酔ガスの 4% イソフルランとマウス (体積気流率 0.6 0.8 L/分)。</li>
	<li>ブプレノルフィン (体重の 0.1 mg/kg) を皮下注入します。</li>
	<li>Prewarmed 外科プレート (37 ° C) を麻酔下のマウスを置きます。</li>
	<li>潤滑剤で目をカバーします。</li>
	<li>麻酔マスクを持つマウスを合わせて (0.6 から 0.8 の体積風量でガスの 1.5% イソフルラン L/分) 外科プレート、ひげをそる腹部皮膚領域。剃毛地域 3 X 75% エタノールとし、betadine ソリューションを拭いてください。 注:麻酔下のマウスの呼吸動作を継続的に監視します。マウスの吸入吐出パターンに従ってイソフルラン麻酔ガスの濃度を調整します。</li>
	<li>マウスの後肢の指骨を絞ることによって足底反射の有無を確認します。</li>
	<li>曲線鋸歯状アイリス鉗子 (10 cm) で皮膚をつかんで、ストレート超硬はさみ (10 cm)、リネア正中に沿って皮膚を切断し、ストレート ・ デュモン ピンセット (12 cm、0.2 mm と腹膜壁を掴んで腹部キャビティを開く× 0.12 mm) とストレート ヴァンナの白線に沿って壁を切断はさみ (8 cm)。</li>
	<li>腹部の開口部に穴あきパラフィン フィルムの部分を置き、マイクロ モスキート止血鉗子 (12.5 cm の曲線) と両端にフィルムを修正します。</li>
	<li>子宮角内の胚への損傷を避けるためにスプーンのようなデバイスと子宮角を公開します。子宮角に PBS (37 ° C) を数滴を滴下し、損害または奇形子宮嚢内胚を確認します。</li>
	<li>子宮角の胚の位置や順序を文書化します。注入の目的の位置に到達するまで慎重に子宮嚢内胚をオンにします。</li>
	<li>AAV1 高速グリーンの混合物の 1-2 μ L を注入すると、注入部位 (例えば、脳室) および顕微鏡の下で染料の浸透を視覚的に調べることによって。</li>
	<li>注入された胚を文書化し、腹腔内に注入された胚と子宮角を配置します。</li>
	<li>腹腔内に PBS (37 ° C) を数滴を滴下します。腹腔の壁 (使用ポリアミド 6-0 サイズ縫合糸) や皮膚 (使用ポリアミド 3 0 サイズ縫合)、ホルステッドのモスキート止血鉗子 (12.5 cm) 曲線を使用して縫合して空洞を閉じます。また、単純なパターンに中断またはステンレス製縫合/ステープルを使用する腹部キャビティそして皮膚を閉じます。</li>
</ol>2. 隔離されたティッシュの Telemacrophotography
<ol><li>
バッファーの準備
	<ol>
<li>Na2HPO4と 1 l 蒸留水 200 rpm で攪拌下の瀬2PO4 2.18 g 溶解の 14.95 gデニスソレンセンのバッファー (1 L) を準備します。灌流末の胎仔および/または出生後の子犬期間、腹部や胃内注入用針の適切なサイズを使用して、ターミナル ナトリウム ペントバルビ タール麻酔濃度が 180 mg を超えないことを確認してください/体の kg の重量を量る。</li>
		<li>75 ° C に蒸留水 500 mL を加熱することによってMugnainiの固定の解決 (5 L) を準備し、5 の 200 μ L を追加する、200 rpm で攪拌下パラホルムアルデヒド粉末 50 g を追加する N 水酸化ナトリウム、デニスソレンセンのバッファーの追加 1,500 mL、1,750 mL の蒸留水、と 25% グルタルアルデヒドの 500 mL。5,000 mL を蒸留水に詰めます。灌流のこの最後のバッファーを使用します。 注: ボンネットの下の Mugnaini の固定の解決を準備、保護メガネを着用し、煙を避けるため。灌流のより良い視覚化のメチレン ブルー (0.05 g/L) を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
マウスの血流と組織の分離
	<ol>
<li>Transcardially が導入された胚 (胚研究) の場合、または標準手順6,7によると希望年齢 (例えば、生後 24 日目) で生まれた導入されたパブを運ぶ妊娠マウスを灌流します。 11,12,13,14,15,16,17, 腹腔内ターミナル ナトリウム ペントバルビ タールを使用して麻酔 (体重の 200 mg/kg)。</li>
		<li>マウス transcardially を注入マウスを吹き込む 26 G、針と、固定の前に 1 を使用して (500 U)、ヘパリン溶液を 10 ml、体内から血液を洗い流すし、30 ml 40 ° C prewarmed Mugnaini の transcardially を灌流する PBS の transcardially固定の解決。 注:成体マウスの腹部大動脈14経由で代替の逆行性血流を実行します。</li>
		<li>興味 (全脳や脊髄など) の灌流の組織を分離し、4 ° C で 24 時間の別の Mugnaini の固定の解決の少なくとも 10 mL で組織を置</li>
		<li>室温で 3 h の 10 mL の PBS で組織を洗浄します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
アガロース、およびドキュメントに埋め込み、セクショニング
	<ol>
<li>再現性のある断面角度8,9,10特別なフレームの分離組織 (例えば、全脳) を調整します。また、調節可能な切削厚、vibratome を使用します。</li>
		<li>フレームに神経組織を配置、telemacrography のための組織を調整し、座標を文書化します。</li>
		<li>3% 低融点アガロース埋め込みメディアの準備: agarose の 3 g を 100 mL のデニスソレンセンのバッファーの追加し、90 ° C の水浴中で混合物を熱</li>
		<li>組織を含む枠の 3% の agarose (30 ° C) を注ぐ。暖かい金属ブロックとフレームをカバーし、それが硬化するまで待ちます。硬化中に埋め込まれた組織とその座標フレーム内のイメージを telemacrographic デバイスを使用します。</li>
		<li>最初のフレームの座標に対応する切削ギャップのあるフレームに agarose 埋め込まれたティッシュを転送します。</li>
		<li>薄いと振動のかみそりの刃を備えたデバイスで所望の厚さ (例えば、1.5 mm) のセクションに埋め込まれた組織を削減 (材料の表を参照してください)。 注:かみそりの刃の滑走を改善するために埋め込まれた組織にグリセリン数滴を滴下します。</li>
		<li>PBS で各切片を画像フォルダーに画像を収集しています。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 分離組織の透過電子顕微鏡用の準備
注:フードの下で動揺のプラットホームのしっかりと開閉蓋とガラス皿で培養の以降のすべての手順を実行します。
<ol><li>PBS で 2 x 30 分間ティッシュ セクションを洗います。室温で 2 時間 2% 水溶液四酸化オスミウム ソリューション (OsO4) のセクションを孵化させなさい。 注意:四酸化オスミウムは有毒、皮膚接触すると有害のおそれ。</li>
	<li>PBS で 2 × 30 分の osmicated セクションを洗います。</li>
	<li>10-15 分の室温で 30%、50%、70% エタノールでセクションを孵化させなさい (オプション: 4 ° C で 70% エタノールで一晩インキュベート)。</li>
	<li>LED RGB 光8,9,10 (2 x 15 W) 70% エタノールで osmicated の標本は、45 ° の角度で左右からサンプルに適用するイメージ。散乱とイルミネーションの中に、光の反射を最小限に抑えるため黒い皿および鈍い黒の背景を使用します。 注意:イメージ投射の間を乾燥させるセクションを許さない。</li>
	<li>シリーズ フォルダー内の画像を収集することにより、座標を持つセクション画像のアトラスを作成します。</li>
	<li>100% エタノール (30 分の 2 倍)、室温で 100% のプロピレンの酸化物 (30 分の 2 倍) に標本を孵化させなさい。 注意:セクションにソリューションを変えながら乾くようにしてください。</li>
	<li>ドデセニルこはく酸ガラス容器内の 240 mL と優しくガラス棒で攪拌しながら 260 mL の樹脂を混ぜます。不均質性、泡と汚れを定期的にチェックします。非常に優しく、少なくとも 45 分手でかき混ぜます。</li>
	<li>1:2 と 1:1 の比率で樹脂/プロピレンの酸化物を準備し、3% アクセラレータ (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol) を追加.</li>
	<li>1:2 のステップ 3.8 2 h し 1:1 の埋め込みソリューションのステップ 3.8 から 2 時間室温で回転ホイール上からソリューションを埋め込み組織を孵化させなさい。</li>
	<li>フラット ポリプロピレン皿にティッシュを置き、ティッシュをかぶせて 3% アクセラレータを含む新鮮な樹脂と 12-24 時間の 65-85 ° C で埋め込まれた組織を治します。</li>
	<li>埋め込まれた組織を室温に冷却し、ポリプロピレンの料理から樹脂包埋標本を削除します。</li>
</ol>4. 定量分析のための超微細構造の神経可塑性パラメーターの選択
<ol><li>
関心のある領域のマッピング
	<ol>
<li>(例えば、海馬や小脳) 関心の領域を選択し、このエリアを含むアトラス (ステップ 3.5) からイメージを選択してセクション アトラス地区をローカライズします。</li>
		<li>断面画像に関心のある領域の境界線をスケッチし、樹脂試料の上にこれらの地域のボーダーを見つける/スーパーイン ポーズします。</li>
		<li>スクラッチ マーク (26 G、1 で) 細針ゲージを使用して、樹脂試料 (例えば、海馬や小脳) 関心のある領域の国境。</li>
		<li>トリミング用樹脂を柔らかくしたり、また、トリミング装置、薄い刃またはサンドペーパーを使用するオーブンで 85 ° C に樹脂試験片を加熱します。</li>
		<li>かみそりの刃をもつ樹脂試料から関心のある分野を消費税 (材料の表を参照してください)。試料をマウント接着剤など (直径 8 mm) と長さ 1 cm 必要な口径のアクリル ガラスのバーを保持しています。準超薄切片とマウントされた試料をトリミングします。</li>
		<li>グリコールメタクリル (0.75 μ m) を準備し、極薄 (70 nm)、ウルトラミクロトームを使用してトリミング領域のセクション: 0.75 μ m 厚 1.5 mm/s と 70 nm 厚さ 0.7 mm/s でそれを設定。</li>
		<li>ガラス担体にグリコールメタクリル セクションを収集し、(4 分) 用 PBS で青 1% トルイジンのセクションを染色します。</li>
		<li>何度か脱イオン水内のセクションを洗います。4 x を使用して光学顕微鏡の下でステンド グラスのセクションを調べる (0.1 ∞ の NA/-), 10 (0.22 ∞/0.17 の NA)、x 40 x (0.65 ∞/0.17 の NA)、(1.25 ∞/0.17 の NA) 目標 × 100。</li>
		<li>ニッケル グリッドの超薄切片を収集します。180 で TEM グリッドの対象 kV、3、200 x、6, 000 x および/または 8,000 倍の倍率。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
TEM 分析
	<ol>
<li>定量的な TEM 分析 (例えば、小胞とミトコンドリアや有髄と無髄の軸索の研究) のための興味の微細構造パラメーターの選択し、これらのパラメーター未満 3 8,000 倍の倍率や 6,000 x 500 x の TEM 画像を取る。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Special+axo-dendritic+synapses+in+the+hippocampal+cortex%3A+electron+and+light+microscopic+studies+on+the+layer+of+mossy+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative.+Neurology%22%5BJournal%5D)">Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers.</a> Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159(1961).</li>
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</ol>

著者が明らかに何もありません。

子宮内での情報伝達の重要なステップは、注入の手順です。脳室または興味の別の領域に精密成形には、経験と実践的なスキルが必要です。シンナーのマイクロキャピ ラリー チップ以下の組織の損傷が発生します。しかし、これは射出圧力の増加を犠牲にしては。子宮内でエレクトロポレーション19,20,21,22と対照をなして子宮内で伝達後注入された胚の生存率は非常に高い。子宮角のすべての胚は、胚は子宮角の根元に位置し、子宮嚢内に再調整される必要がある場合でも注入することができます。インジェクションや分析の発達段階は、科学的な質問に合わせることができます。
脳室に注入、AAV1 粒子が全体の心室システムを介して脳脊髄液を介して配布されます。開発は、表面構造海馬と小脳を適用されたウイルス粒子5,...

光子は、電子の深さのグレードで極薄の組織標本を貫通できます。これはナノメートル微細構造の光学顕微鏡技術と比較した場合の解像度の画像をキャプチャで TEM に貴重な利点を属性します。たとえば、TEM は、分泌顆粒、微小管、フィラメント、繊毛、絨毛上皮 (細胞表面の様々 なタイプ、メラノソーム、ミトコンドリアなどの細胞内オルガネラの可視化特殊化)、特に神経系1,2,3,4シナプスします。本方法論研究の全体的な目標です神経可塑性変化の微細構造認識出生前干渉時に開発時に子宮内での伝達と TEM の最新の技術を組み合わせることによって興味のバイラル符号化された蛋白質は、中枢神経系5,6、7、6脊髄などに子宮内で導入されています。例えば、子宮内で伝達電子顕微鏡との組み合わせでは細胞接着分子 L1 の運動 L1 と核内受容体タンパク質間の相互作用に関して、特に L1 欠損マウスにおける可塑性を学習に及ぼす影響を研究するため使用されています小脳ニューロン7。
神経可塑性パラメーターの解析には、中枢神経系内の最小領域の局在に関する正確な情報が必要です。したがって、微細構造の詳細とその他の構造についての正確な地形向きについて説明するのには十分です。本研究では光と電子顕微鏡観察に基づく明瞭な形態の区域の詳しい調査を目指して特定の準備メソッドが表示されます。このアプローチは、組織操作、マウスの脳および脊髄の子宮内での伝達から始まる、および灌流固定後のいくつかのテクニックを組み合わせた金型埋め込むと TEM の組織を処理します。埋め込みと TEM のティッシュの処理の間に含まれている重要なステップはの microphotographic と低倍率の正確なドキュメントは、干渉光の反射法による組織のドキュメント組織標本8,9,10。本手法により、神経組織表面と TEM の準備の前に供試体スライス プロファイルの地形と構造の詳細を検討する研究手法に組み込まれ、.
頭脳全体の区分のための特別なフレームは、定位座標に対応します。このフレームは神経組織の区域の形態の三次元 (3 D) 再構成を利点し、形態分析に使用することができます。可視化のセクションの macrographs が地形座標を割り当てられ、連番付きのセクション組織アトラスのマップを構築します。
樹脂加工後で超薄切片に埋め込まれた組織の断面 (< 70 nm) 上記組織アトラスの地図によると、選択したエリアを含んでいます。その内容と連絡先団地内近隣構造物への塑性パラメーター (例えば、シナプス ボタンまたは軸索線維のプロファイル領域を断面するなど) の高解像度の画像を取得する TEM を超薄切片を受けます神経網。
記載の方法で可視化破面観察からマイクロ構造およびナノ構造への滑らかな移行は以後の子宮内開発の神経形態学的神経可塑性の詳細な比較を許可します。システム。

<table><tbody><tr><td>2,4,6-トリス(ジメチル-アミノメチル)フェノール</td><td>Serva</td><td>36975</td><td></td></tr><tr><td>26 G x 1'' 針</td><td>Henke-Sass, Wolf GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>410 エアポンプ用麻酔ユニット</td><td>Biomedical Instruments (Univentor)</td><td>8323102</td><td></td></tr><tr><td>アデノ随伴ウイルス血清型 1 (AAV1)</td><td>UKE (Viral Core Facility)</td><td>-</td><td>AAV1の参考文献および標的領域については、https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ および以下も参照してください:Designer gene delivery vectors:分子工学および遺伝子導入強化のためのアデノ関連ウイルスベクターの進化。クォンI、シェーファーDV。Pharm Res. 2008年3月;25(3):489-99.血清型1、2、および5のウイルスカプシドでシュードタイプされた組換えAAVウイルスベクターは、中枢神経系の異なる領域に送達した後、異なる効率と細胞親和性を示します。バーガーC、Gorbatyuk OS、ベラルドMJ、Peden CS、Williams P、Zolotukhin S、Reier PJ、Mandel RJ、Muzyczka N. Mol。2004年8月;10(2):302-17.自己相補型組換えアデノ随伴ウイルス(scAAV)ベクターは、DNA合成とは無関係に効率的な形質導入を促進します。マッカーティDM、モナハンPE、サムルスキーRJ。ジーン・サー。2001年8月;8(16):1248-54。</td></tr><tr><td>アガロー</td>ス <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>低ゲル化アガロー</td></tr>ス <tr><td>エアポンプ</td><td>バイオメディカル機器 (Univentor)</td><td>Eheim 100</td><td></td></tr><tr><td>Araldite</td><td>CIBA-GEIGY</td><td>23857.9</td> 組織吸引器<td>の埋め込み用</td></tr><tr><td>樹脂 チューンアセンブリ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>呼吸マスク マウス陽極酸化アルミニウム</td><td>バイオメディカル機器 (Univentor)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>ブプレノルフィン</td><td>テムゲシック</td><td>アンプル</td><td>鎮痛剤</td></tr><tr><td>毛細血管</td><td>科学-製品</td><td>GB100TF-10</td><td>、フィラメントド</td></tr><tr><td>デセニルコハク酸無水物</td><td>フルーカ</td><td>44160</td><td></td></tr><tr><td>デュモンピンセット(#3、12 cm、ストレート、0.2 x 0.12 mm)</td><td>FST</td><td>11203-23</td><td></td></tr><tr><td>電気シェーバー</td><td>フィリップス</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>エチコン縫合糸(エチロン、6-0および3-0)</td><td>エチコン</td><td>ポリ</td><td>アミド</td></tr><tr><td>眼潤滑剤</td><td>Bepanthene-Fast</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td>注入された液体の視覚化用</td></tr><tr><td>ガスルーティングスイッチ 4/2コネクタ</td><td>バイオメディカルインスツルメンツ(Univentor)</td><td>8433020</td><td></td></tr><tr><td>ハルステッドモスキート止血鉗子(12.5cm、ストレート)</td><td>FST</td><td>13011-12</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン-ナトリウム</td><td>比薬</td><td></td><td>25 000 I.E./5 mL</td></tr><tr><td>マウス用誘導ボックス 水平移動蓋付き. 内寸LxBxH:155 mm x 115 mm x 130 mm. 壁の厚さ:6 mm</td><td>生物医学器具(ユニベントール)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>虹彩鉗子(10 cm、湾曲、鋸歯状)</td><td>FST</td><td>14007-14</td><td></td></tr><tr><td>虹彩はさみ(11 cm、ストレート、炭化タングステン)</td><td>FST</td><td>14501-14</td><td></td></tr><tr><td>イソフルランOP Tisch、電気加熱、sm 外形寸法:257mm x 110 mm x 18 mm. 加熱エリア:190 mm x 90 mm 呼吸マスクが<下向きに逃げる除去 ></td> バイオ<td>メディカル機器(ユニベントール)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン(アタネ)</td><td>JDメディカル</td><td></td><td>吸入麻酔</td></tr><tr><td>LED RGBライト</td><td>カメオ</td><td>CLQS15RGBW</td><td>LED 2 x 15 W</td></tr><tr><td>光学顕微鏡 ベーシックDM E</td><td>ライカ</td><td>-</td><td>4x (N.A. 0.1 &infin;/-), 10x (N.A. 0.22 &infin;/0.17), 40x (N.A. 0.65 &infin;/0.17), 100x (N.A. 1.25 &infin;/0.17) 対物レンズ</td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>Science-Products</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>モスキート止血鉗子 (12.5cm、湾曲)</td><td>FST</td><td>13010-12</td><td></td></tr><tr><td>ニッケルグリッド、200メッシュ</td><td>テッドペラ</td><td>1GC200</td><td></td></tr><tr><td>オスミウム(VIII)-オキシド</td><td>デグサ</td><td>73219</td><td></td></tr><tr><td>プロピレンオキシド</td><td>フルーカ</td><td>82320</td><td></td></tr><tr><td>カミソリの刃シック</td><td></td><td>87-10489</td><td></td></tr>ペン<tr><td>トバルビタールナトリウム(ナーコレン)</td><td>メリアルGmbH</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>TC01mR 1-Channal温度調節器フィードバック付き</td><td>Biomedical Instruments (Univentor)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Technovit 4004 2 成分接着剤</td><td>Kulzer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Telemacrodevice</td><td>キヤノン</td><td>-</td><td>キヤノン Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM 対物レンズ, 延長 150 mm, 手動延長チューブ 7 mm リング, 14 mm リング, 28 mm リング, マクロリバース リング (58 mm), キヤノン コピー スタンド.</td></tr><tr><td>サーモプーラーP-97</td>サ<td>ッターインスツルメンツ</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>薄い振動カミソリブレードデバイス</td><td>Krup-Szabo</td><td></td><td>薄いブレードトル</td></tr><tr><td>イジンブルー</td><td>シグマ-Aldrich</td><td>89640</td><td></td></tr>透過<tr><td>型電子顕微鏡C20</td><td>フィリップス</td><td>-</td><td>最大200kV</td></tr><tr><td>Tygon 6/4 すべての部品を接続するためのチューブ材料 外径:6 mm 内径:4 mm Wa ll 厚さ:1 mm</td><td>Biomedical Instruments (Univentor)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Ultracut E</td><td>Reichert-Jung-ultramicrotome</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Univentor Scavenger</td><td>Biomedical Instruments (Univentor)</td><td>8338001</td><td></td></tr><tr><td>Vannas はさみ (8 cm、ストレート)</td><td>FST</td><td>15009-08</td><td></td></tr></tbody></table>

子宮内開発のマウスの脳および脊髄の伝達の後の微細構造神経可塑性パラメーターの評価

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

本研究は興味の蛋白質によって影響される、明確に識別された地形構造の微細構造パラメーターの正確な寡を目指して透過型電子顕微鏡 (TEM) で子宮内で伝達を組み合わせたウイルスの転送を介して生物に導入されます。この手法により、細孔から微細構造同定へのスムーズな移行のため組織アトラスの次の地形のナビゲーション マップ。子宮導入組織の高分解能電子顕微鏡、神経とその可塑性パラメーター、断面のシナプスブートン エリア、シナプス小胞内のミトコンドリア数などの細かい微細構造を明らかにする、ブートン プロファイル、シナプス、断面の軸索地域、ミエリン鞘の太さ、髄鞘層板の数とミトコンドリア プロファイルの断面領域の長さ。これらのパラメーターの解析では、神経系の遺伝的構造のウイルスの伝達によって影響を受けるエリアの微細構造可塑性の変化に重要な洞察力を明らかにします。これらの併用のみ神経可塑性に遺伝子組み換えの生体分子や薬剤の直接影響を研究するため使用しないことができますが、また (のコンテキストでは例えば、神経可塑性の子宮内で救助を勉強する可能性を開きます神経変性疾患)。

マウスの信頼性と高速麻酔の安全な多数のパラメーターが考慮されたと麻酔ユニットの最適化されたワークスペースが十分な (図 1A) をあることを証明しました。単位は、マウスやラットなどの小動物の手術の成功に必要な精度で液体イソフルランと周囲の空気の混合を制御するために設計されています。空気とイソフルランは目的の設定によると気化器の混合し、動物 (図 1A) ボックスに、マスクを配信しました。スカベン ジャーは、収集し、安全な作業環境を提供するため、生成される任意のイソフルラン麻酔余剰ガスを不活性化します。ガスの収集し、カートリッジ (図 1A) でアクティブな石炭を通過しました。
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透過型電子顕微鏡と子宮内で伝達の組み合わせは、開発中に神経系の細かい微細構造の形態学的変化を研究するための強力なアプローチです。これらの併用は、神経可塑性の地形表現に関しての基になる構造の詳細の変更への深い洞察をことができます。

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

我々の組み合わせアプローチは、子宮内の新生神経系への早期発達介入後に超構造的神経可塑性パラメータがどのように変化するかを答えるのに役立つ。我々の方法の主な利点は、組織アトラス内の定義済み座標系におけるマクロメソマイクロおよびナノ構造体の高解像度画像の取得である。我々の方法の意味は、先天性神経変性疾患の翻訳治療の可能性である。例えば、子宮導入技術でこれを用いた胚期における治療および救助。この方法は他のモデルに適用できます。例えば、マウスの種は、同様に、関心のある領域を変更することができます。私たちの方法を初めて試す研究者は、深遠な外科訓練だけでなく、電子顕微鏡イメージングのための組織を準備する方法の知識が必要です。目的の標的に対してアデノ関連ウイルス1型1コーティングの11個のウイルス粒子に4回10を含むカスタマイズされた毛細管先端をロードし、吸引管に高速グリーン染料で標識することから始めます。標識されたアデノ関連ウイルス粒子の15マイクロリットルを毛細血管に加える。次に、麻酔下の胚性マウス14.5日目のつまみつまみへの応答の欠如を確認し、皮膚を消毒する。湾曲した鋸歯状の虹彩鉗子とまっすぐな炭化物はさみを使用して、リアナ・メナーマに沿って皮膚切開を行います。まっすぐなデュモンピンセットを使用して腹壁をつかみ、まっすぐなヴァンナハサミでリニアアルバに沿って続け、腹部の開口部の上にフェネレートされたパラフィンフィルムの一部を置き、角の中の胚を損傷することなく、子宮ホーンを露出させるためにスプーンのような装置を使用します。子宮の角に37°C PBSの数滴を適用した後、子宮嚢内の損傷または奇形がないか胚を検査する。各注射の所望の位置が達成されるまで、胚を嚢の中に慎重に回します。胚が所定の位置にある場合は、各胚にファーストグリーン標識ウイルス粒子溶液の1〜2マイクロリットルを注入する。すべての胚が注入された後、子宮の角を腹腔に戻し、腹部に37°CPBSの数滴を加える。その後、ポリアミド6-0サイズの縫合糸を使用して腹膜壁とポリアミド3-0サイズの縫合糸とハルステッドのモスキートヘモスタティック鉗子を閉じて皮膚を閉じます。テレマクロ撮影に関心のある孤立した組織を埋め込むには、組織サンプルを再現可能な断面角度を持つ特別なフレームに入れ、座標を文書化します。組織が覆われるまで30°C3%アガロースでフレームを充填し、アガロースが硬化するまでプラスチック製の蓋でフレームを覆います。アガロースが硬化している間、フレーム内の埋め込まれた組織とその座標を画像化するためにテレマクログラフィックデバイスを使用します。アガロースが固まったら、第1フレームの座標に対応する切断隙を有して、アガロース埋め込まれた組織をフレームに移す。薄く振動カミソリの刃を備えた装置を使用して、埋め込まれた組織を適切な実験の厚さのセクションに切断します。次に、PBSの各組織セクションを画像化し、画像をフォルダに集めます。透過電子顕微鏡用の組織サンプルを調製するために、バイオセーフティキャビネットで、PBSで2回の30分間の洗浄で組織切片を洗浄し、続いて2%水性四酸化オスミウム溶液を室温で2時間培養します。インキュベーションの終わりに、PBSでさらに2回、洗浄につき30分間、浸透したセクションを洗浄し、示されているように10〜15分間の連続したエタノール浸漬でセクションを脱水します。70%エタノール浸漬後、各サンプルを黒い黒い背景に黒い皿に入れ、45度の角度で左右の側面からサンプルに適用されるLED RGB光の下で70%エタノールで標本をイメージします。フォルダー内のシリーズのサンプルの画像を収集することにより座標を使用してセクション画像の地図帳を作成します。2つの30分100%エタノールインキュベーションで試料を処理し、続いて室温で2つの30分100%プロピレンオキシドインキュベーションを行います。サンプルがインキュベートされている間、1対1および1対2の比率でプロピレンオキシドと作りたての樹脂を混合し、両方の溶液に3%の加速剤を加えます。第2のプロピレンオキシドインキュベーション後、試料を室温で2時間、1対1の樹脂プロピレンオキシド埋め込み液溶液中に2時間インキュベーションして、室温で1対2の樹脂プロピレンオキシド埋め込み培地溶液に移します。2回目のインキュベーションの終わりに、組織を平らなポリプロピレン皿に移し、65〜85°Cで12〜24時間3%の加速器を含む新鮮な樹脂で埋め込まれた組織を治す。その後、組織を室温まで冷却し、ポリプロピレン製の皿から樹脂埋め込み標本を取り除きます。対象領域をマップするには、以前に準備した画像アトラスから対象領域を含む画像を選択します。断面化された画像に対象領域の境界をスケッチし、これらの境界を顕微鏡下の埋め込み標本に光学的に重ね合わせ、1インチ26ゲージ針を使用してこれらの領域の境界を樹脂標本に傷つけます。その後、樹脂を軟化させるために、試料を95°Cに加熱します。次に、オーブンから暖かい樹脂の標本を取り出し、カミソリの刃を使用して対象領域を切除します。適切な口径のアクリルガラス保持バーに標本を接着し、半および超薄い切断のために取り付けられた標本をトリミングします。超マイクロトームを使用して、半薄型0.7マイクロメートルと超薄型70ナノメートルのセクションを取得し、ガラスキャリアの半薄いセクションとニッケルグリッドの超薄いセクションを収集します。PBSで1%トルイジンブルーの半薄いセクションを4分間染色し、続いて脱イオン水で数回の水を流し、軽い顕微鏡でセクションを調べる。超薄型断面は、さらに変更することなく、180キロボルトの透過電子顕微鏡検査によって直接評価することができます。断面化後、ティッシュスライスは、ちょうど実証したように、テレマクロ写真によって画像化されます。浸透およびエタノール浸漬後、各セクションは干渉光テレマクログラフィーによって再び画像化され、各組織表面に特異的に着色されたパターンを明らかにする。追加の脱水および樹脂埋め込み後、対象領域を選択し、さらに透過電子顕微鏡のために処理される。海馬や小脳では、苔むした繊維シナプスは、シナプス前の大型ブトンを含む他のシナプスと比較してユニークな超構造的特性を示すことが知られている。彼らの断面プロファイルでは、ブトンは膨大な数の小胞とミトコンドリアを含み、非常に頻繁にいくつかの樹状脊椎を囲みます。脊髄では、背骨の真菌は、オリゴデンドロリアによってミリン化される多くの軸索繊維を含む。横切り部では、脊髄の後角の両方の間に後部真菌が見られる。透過型電子顕微鏡画像では、断面化されたミエリン軸索が丸く現れ、軸索を取り巻くミエリン鞘はラメラに組織化されています。調製されたアトラスと超構造パラメータの顕微鏡顕微鏡画像は、様々な治療条件下での異なるセクションの形態学的神経可塑性の比較だけでなく、同じ領域内のパラメータ間の比較にも有用である。子宮内の導入を開始する前に徹底的に計画し、準備し、合併症の場合には材料や器具のバックアップを持っていることを確認することを忘れないでください。我々の方法に従って、他の技術は、対象となる定義された分子の超構造トレースのための電子顕微鏡の前に免疫金標識のような追加することができる。生物全体の全体的な視点から始まり、分子地形に向かってズームインし、組織機能と形態の関係を研究し、操作することができます。四酸化オスミウムは危険です。常にボンネットの下で作業し、この試薬で作業するときは保護メガネと手手袋を着用してください。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

発展途上のマウス脳への遺伝子導入法は、ユニークな手術法と電極の特殊な形状を用いて記述されます。このユニークな手法は、脳の発達の研究に多くの神経科学者を支援する時間的および空間的にプラスミドDNAのトランスフェクションすることができます。...

マウス子宮内でエレクトロポレーション：制御時空間遺伝子導入

この資料では詳細に子宮内で大脳皮質およびマウスのE14.5における海馬をエレクトロポためのプロトコルについて説明します。また、このこれらの2つの脳領域で樹状突起と棘を研究する貴重な方法であることを示している。...

使用して、マウス大脳皮質および海馬における可視化と樹状突起と棘の遺伝子操作<em&gt;子宮内で</em&gt;エレクトロポレーション

出典: Lutz, D., et al.発育中のマウス脳と脊髄の子宮内形質導入後の超微細構造神経可塑性パラメータの評価。J. Vis.

マウスにおける子宮内ウイルス形質導入

出典:Lutz, D., et.al.発達中のマウス脳および脊髄の子宮内形質導入後の超微細構造神経可塑性パラメータの評価。J. Vis. Exp.

透過型電子顕微鏡を用いたマウス脳切片の超微細構造解析

視床下部の機能や医療の重要性にもかかわらず、...

マウスの遺伝子操作は、視床下部を介して開発<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーション

このプロトコルは、子宮内エレクトロポレーションを介してC57BL/6中枢神経系の異なる領域を特異的にトランスフェクションする方法を詳細に説明しています。このプロトコルには、皮質、海馬、視床、視床下部、外側中隔核、線条体に発達する領域のトランスフェクションに関する詳細な指示が含まれています。...

Cortex-、Hippocampus-、Thalamus-、Hypothalamus-、横中隔Nucleus-と線条体固有<em&gt;子宮内</em&gt; C57BL / 6マウスでのエレクトロポレーション

この記事では、新生児マウスで再現可能な脊髄圧迫損傷(SCI)を生成する方法について説明します。このモデルは、自発的な機能回復の根底にある適応可塑性のメカニズムを研究するための有利なプラットフォームを提供します。...

新生児マウス脊髄圧縮損傷モデル

この原稿は、単一細胞レベルおよび蛍光標識された神経細胞の興奮で、ニューロンの構造的接続性を記述するために子宮内エレクトロポレーション（IUE） で使用するプロトコルを提供します。組織学は、樹状突起および軸索突起を特徴付けるために使用されます。急性スライスにおける全細胞記録は、興奮性を調査するために使用されます。...

子宮内エレクトロポレーションは、神経部分集団の興奮とシングルセルの接続を研究するためのアプローチ

新しい脳領域の若いニューロンに挑戦と、神経細胞の運命と成熟の環境の sculpts に重要な洞察を明らかにできます。このプロトコルを記述する特定の脳領域からの介在ニューロン前駆体を収穫し、それらのいずれかの homotopically...

早期の生後早期のマウス脳に介在ニューロン前駆体の Homochronic 移植

このプロトコルでは、E7.5のマウス羊膜腔にレンチウイルスを注入し、生存や胚発生への有害な影響を最小限に抑えながら、神経板全体の均一な形質導入をもたらす方法について説明します。...

胎内ナノ注射(NEPTUNE)によるマウス神経板ターゲティング(胎内7.5日目)

学ぶ 子宮内発達段階における神経可塑性の微細構造変化をマウスで評価する方法です。透過型電子顕微鏡と子宮内トランスダクションを組み合わせ、神経系の形態学的変化を高解像度で観察できます。

子宮内開発のマウスの脳および脊髄の伝達の後の微細構造神経可塑性パラメーターの評価

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