Name: ハチミツガ口腔管理モデル Study Commensal-Induced 自然免疫応答 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: 学ぶハチミツガ口腔管理モデルによる自然免疫応答解析法。Galleria mellonellaを用いて細菌経口投与と免疫マーカー発現を測定し、ネズミ代替モデルとして免疫学研究に応用する。

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この作品は感染症研究 (DZIF) のためのドイツ センター同毛皮 Bildung und 上海虹橋 (BMBF)、DFG 研究訓練グループ 1708 DFG (SPP1656) によって賄われていた。

<ol><li>Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+the+microbiota+on+the+pathogenesis+of+IBD%3A+lessons+from+mouse+infection+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).</li>
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<li>Waidmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteroides+vulgatus+protects+against+Escherichia+coli-induced+colitis+in+gnotobiotic+interleukin-2-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Bacteroides vulgatus protects against Escherichia coli-induced colitis in gnotobiotic interleukin-2-deficient mice.</a> Gastroenterology. 125 (1), 162-177 (2003).</li>
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<li>Hermann-Bank, M. L., Skovgaard, K., Stockmarr, A., Larsen, N., Molbak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Gut+Microbiotassay%3A+a+high-throughput+qPCR+approach+combinable+with+next+generation+sequencing+to+study+gut+microbial+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The Gut Microbiotassay: a high-throughput qPCR approach combinable with next generation sequencing to study gut microbial diversity.</a> BMC Genomics. 14, 788(2013).</li>
<li>Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OmpA+variants+affecting+the+adherence+of+ulcerative+colitis-derived+Bacteroides+vulgatus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+and+Dental+Science%22%5BJournal%5D)">OmpA variants affecting the adherence of ulcerative colitis-derived Bacteroides vulgatus.</a> Journal of Medical and Dental Science. 57 (1), 55-64 (2010).</li>
<li>Freitak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maternal+transfer+of+bacteria+can+mediate+trans-generational+immune+priming+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">The maternal transfer of bacteria can mediate trans-generational immune priming in insects.</a> Virulence. 5 (4), 547-554 (2014).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Research. 29 (9), 45(2001).</li>
<li>Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insect+Galleria+mellonella+as+a+powerful+infection+model+to+investigate+bacterial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4392(2012).</li>
<li>Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insect+Galleria+mellonella+as+a+powerful+infection+model+to+investigate+bacterial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4392(2012).</li>
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G. mellonellaモデル全身性感染症アプローチ21で細菌の病原性因子を評価するために頻繁に使用されるモデルです。多くの病原体や細菌、口腔の植民地や感染ルート経由でホストを入力、新しい洞察力口腔植民地化および伝染のためのモデルとしてg. mellonellaの評価を発見する必要があります。
後部G. mellonella 15-37 ° C の間に可能性は大きな利点は、ほとんどの哺乳類モデル537 ° C の体温を維持します。G. mellonella幼虫はサプライヤーから購入することができますが、独自の繁殖人口の確立、アッセイに干渉、実験を開始するときは、推定をより抗生物質の不在など多くの利点を提供します。仕入先がないため常に輸送や温度変化に起因する準備段階とストレス反応における幼虫が回避されます。G. mellonellaの温度の許容のために繁殖を行うことが温度は高いです。高い温度が幼虫の...

腸内マイクロバイ オームの恒常性の維持のために不可欠なコンポーネントをおよび両方の自然免疫と適応免疫応答1,2が含まれます。共生微生物叢コミュニティは異なった主成分共生によって特徴付けられる: 重要な免疫調節機能と遺伝的傾向有害な影響を持つことができます pathobionts の有益な効果を与える共生ホストを促進・炎症性腸3,4をトリガーします。共生と pathobionts に関する多くの研究とその宿主の免疫系に及ぼす影響は、適応免疫応答を主に勉強して公開されています。
免疫原性の異なる細菌のスクリーニングを可能にする交換用のモデルを検索しよう以来、これらの研究を含む多くの動物調査及び保護のため、実験に使用される動物の交換が公共の利益を増やすことでプロパティ。昆虫、特にハチミツガは、感染症の研究で広く使用されている交換用のモデルです。G. mellonellaは、低コスト、高スループットなど別の利点を組み合わせた自然暴露経路である細菌の経口投与し、全身性感染症5,6のこと。G. mellonellaさらには哺乳類と細菌の病原性因子式5のための最適の生理的体温である 37 ° C で培養できます。G. mellonellaの主な利点は、保存された自然免疫系は非自己から自己の差別を有効にし、さまざまな apolipophorin やオプソニン ヘモリン6,のようなパターン認識の受容器を符号化する7. g. mellonella微生物認識時に異なるダウン ストリーム体液性免疫を引き起こすことができます。酸化ストレス応答を誘導でき、NOS (硝酸酸化酵素合成酵素) や NOX (NADPH オキシダーゼ)6,8の活動では、活性酸素種 (ROS) を分泌します。さらに、 G. mellonellaは、gloverin、moricin、セクロピン ディフェンシンのような gallerimycin6,などの異なるアンプの混合物の分泌による強力な抗菌ペプチド (AMP) の応答をアクティブに8,9,10。一般に、アンプはグラム陽性およびグラム陰性の細菌やカビに対して非常に広い宿主特異性を有し、昆虫の適応応答10本が欠けているので、強力な応答を提供する必要があります。Gloverin は細菌やカビに対してアクティブ アンプで、外膜形成6,11を抑制します。Moricins は、膜を貫通し、細孔9,11を形成グラム陽性およびグラム陰性の細菌に対する抗菌機能を展示します。Cecropins は細菌および真菌に対して活動を提供し、同様に moricins9,10のような膜を permeabilize します。Gallerimycin は抗真菌特性9ディフェンシンのようなペプチドです。興味深いことに、セクロピンと gallerimycin の組み合わせがエシェリヒア属大腸菌10に対して相乗的な活性を持っていたことが分かった。
自分の使いやすい文字g. mellonella幼虫が細菌の病原性を評価するために頻繁に使用される感染症モデル。特に、 G. mellonellaから得られるデータの研究は、この代替ホスト モデルの強度マウス サポートから得られたデータと関連付けてください。全身性感染症後にマウス感染モデルにおけるリステリア菌の最も病原血清型をg. mellonellaの高い死亡率につながるもわかった。さらに、以下の病原血清型が判明もg. mellonellaモデル12により少なく劇毒性であること。人間の病原真菌カンジダ ・ アルビカンスと同様の観測が行われました。病原性全身性感染症と幼虫生存率のモニタリングによって異なるC. albicansの系統が評価されました。マウス非病原性菌株も非病原性または展示マウス病原性菌株リードも高いため幼虫死亡率13に対し、 g. mellonella、病原性を削減します。G. mellonellaモデルは、緑膿菌14の 3 型分泌システム病原性要因を識別するためにさらに使用できます。
特に経口強制的に腸内共生生物を解析に適した方法を提供することに興味を持っていたg. mellonellaを含むほとんどの調査された全身性感染症のアプローチを使用して病原因子に焦点を当てたのでモデル、我々 幼虫ごと細菌の異なる用量を適用しだけでなく幼虫の死亡率を観察が腸内の恒常性を維持するために免疫反応の異なる特徴を分析します。
本手法は、我々 は細菌のアプリケーションおよび RNA 発現の解析を組み合わせるため交換用のモデルとしてg. mellonellaの使用を増やすのに役立ちます。じゃないだけ経口投与だけでなく全身性感染症後の死亡率の観察後の免疫応答の解析を含むとき病原細菌研究の意味を強化するために役立ちます。私たちの方法は、細菌の免疫原性の性質の解析非病原性共生生物だから生きている有機体の腸粘膜バリアーを提供することによって細胞培養よりも複雑な条件を提供します。

<table><tbody><tr><td>1.5 mLチューブ</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNAラダー&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15628019</td><td></td></tr><tr><td>1-ブロモ-3-クロロプロパン (BCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9673</td><td></td></tr><tr><td>2 mL チューブ</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>2x Mangomix</td><td>Bioline</td><td>BIO-25033</td><td>コロニー PCR</td></tr><tr><td>50 mL チューブ</td><td>Greiner Bio-One</td><td>210 261</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>蜜蝋</td><td>Mixed-Store.de</td><td>&nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>脳の心臓注入ブロス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>CM1135</td><td></td></tr><tr><td>CloneJET PCR クローニングキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>K1232</td><td>16Sフラグメント用クローニングベクター</td></tr><tr><td>コーングリッツ</td><td>オステルム&uuml;hle Naturkost GmbH</td><td>306</td><td>有機栽培</td></tr><tr><td>Difco LB寒天、ミラー(ルリア-ベルタニ)</td><td>ベクトンディキンソン</td><td>BD</td><td></td></tr><tr><td>ディフォコLBブロス、ミラー(ルリア-ベルタニ)</td><td>ベクトンディキンソン</td><td>244610DNA</td><td></td></tr><tr><td>フリーDNA除去キット&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>244510</td><td>&nbsp;Dnase消化乾燥</td></tr><tr><td>酵母</td><td>ラプンツェル</td><td>&nbsp;</td><td>-有機栽培</td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14040</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>VWR</td><td>20821.330</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td></td>W252506<td></td></tr><tr><td>蜂蜜</td><td>Osterm&uuml;hle Naturkost GmbH</td><td>487</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール&nbsp;</td><td>VWR</td><td>20842.330</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480 Instrument II</td><td>Roche Molecular Systems</td><td>5015278001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Multiwell Plate 96、ホワイト</td><td>Roche Molecular Systems</td><td>4729692001</td><td></td></tr><tr><td>デジタルディスプレイ付き手動マイクロシリンジポンプ</td><td>World Precision Instruments</td><td>DMP</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Fine+ U-100 インスリンシリンジ 0.3 x 8 mm</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>324826</td><td>経口投与</td></tr><tr><td>モルタル、素焼きVWR</td><td></td><td>410-9327&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-400-518</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10977035</td><td></td></tr><tr><td>オキソイドアナエロゲン小袋&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AN0025A</td><td>RNA PCR ストライプの品質と量</td></tr><tr><td></td><td>Biozym</td><td>710970</td><td></td></tr><tr><td>乳棒、素焼き研削面</td><td>VWR</td><td>410-9324&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Phusion校正酵素&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>F553S</td><td></td></tr><tr><td>プライマー</td>バイオ<td>マー</td><td>&nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>PureYield Plasmid Miniprep System</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>QuantiFast SYBR Green PCR kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>204056</td><td>qPCR for bacterial copy number measurementment</td></tr><tr><td>QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit&nbsp;</td>遺伝子発現測定のための<td>Qiagen</td><td>204156</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>QuantiTect Reverse Transcription Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td>cDNA合成</td></tr><tr><td>Qubit Assay Tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsHS DNAキット&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Q32851</td><td>プラスミドおよびcDNAサンプルの定量</td></tr><tr><td>Qubit蛍光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Q33226</td><td>プラスミドおよびcDNAサンプルの定量</td></tr><tr><td>RNase-ExitusPlus</td><td>AppliChem</td><td>A7153</td><td></td></tr><tr><td>ルナシンリボヌクレアーゼ阻害剤</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>スキム粉乳</td><td>スコフィン</td><td>&nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>SYBR safe DNA Gel Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>TRI 試薬&nbsp;</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>計量ボート</td><td>VWR10803-148</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小麦ミール</td><td>オステルム。hle Naturkost GmbH</td><td>6462</td><td>有機栽培</td></tr></tbody></table>

ハチミツガ口腔管理モデル study commensal-induced 自然免疫応答

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

ホストの免疫システムの共生細菌の免疫原性の可能性の調査は、腸宿主微生物間相互作用の勉強 1 つの重要なコンポーネントです。まあ、別の共生生物が宿主の腸管免疫系を刺激するために異なる可能性を示すことを設立します。このような調査は、脊椎動物、特に齧歯動物を含みます。増加の倫理的な問題は、脊椎動物を含む実験でリンクされるので、無脊椎動物の代替モデルのための高需要があります。
ここでは、 g. mellonellaの免疫システムの共生非病原性細菌と共生生物の免疫原性の可能性の可能な評価を使用してハチミツガ経口投与モデルを提案します。G. mellonellaがvulgatus バクテロイデスや大腸菌など別の免疫原性の可能性と共生生物を分析できるようにする有用な代わりとなる無脊椎動物取り替えモデルであることを示します。興味深いことに、細菌を起こしません殺害に及ぼす幼虫は、哺乳類に似ています。G. mellonellaの免疫応答は、脊椎動物の生得の免疫反応と同等であったし、細菌の認識および抗菌分子の生産を含みます。G. mellonellaが復元前の微生物叢バランスを健全な哺乳類の個人から知られていることを提案します。G. mellonellaと脊椎動物の両方に匹敵する自然免疫応答を提供しが、 G. mellonellaは適応免疫系を抱いていません。生得の免疫組織の調査のコンポーネントが保存されて進化を遂げて以来、モデルで細菌の免疫原性プロパティの事前チェックと分析できます。

G. mellonella体液感染モデルは広く巨大な様々 な病原体の病原性因子を分析します。ほとんどの計測には、かなり簡単な方法です幼虫の死亡率の分析が含まれます。それにもかかわらず、このメソッドはない免疫反応についての結論を一般的に許可する、脊椎動物の免疫機構とg. mellonellaの免疫応答の結果をリンクします。G. mellonella経口投与モデル一方、まれにしか使用経口感染症または困難であるため幼虫の植民地化の正確な感染用量9を取得します。さらに、少しだけ非病原性細菌特に哺乳類の腸内共生生物に向かってG. mellonella免疫反応について知られています。
病原体とは対照的共生生物チャレンジ ホストとトリガーの免疫応答がホストの免疫システムは免疫恒常性を維持することができます。G. mellonella</em...

ここでは、我々 はハチミツガの幼虫を用いた経口投与モデルの詳細なプロトコルを提供し、特徴付ける方法による自然免疫応答。このプロトコルを使用して、実用的な経験のない研究者はg. mellonellaメソッドを強制的を使用することができます。

ハチミツガ口腔管理モデル Study Commensal-Induced 自然免疫応答

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

私たちのプロトコルは、全身感染モデルから自然な経口経路を介した細菌投与を可能にするモデルにG.mellllellaの使用を拡大します。G.mellonellaは、幼虫がヒト病原性細菌に使用できるため、先天的なマイクロポスト相互作用の異なる特徴を分析するげっ歯類に適した代替モデルです。大人の蛾によって産まれた卵を、暗闇の中で30°Cのワックスガ基板を含む2リットルの箱に移すことから始めます。1~2週間後、小さくて小さな幼虫が見えるようになると、基板を含む25グラムの幼虫を新鮮な基材に移します。幼虫をその大きさに応じて2週間後に、ワックスガ基板上の新しい2リットル容器の中の30〜40匹の幼虫のグループに同期させます。2週間後、実験用の幼虫を体重で選択します。180〜200ミリグラムの質量を持つ淡い、速く動く幼虫のみを使用しています。幼虫に強制的に餌を与えるために、経口塗布のために鈍い針でインスリン注射器をロードし、幼虫1回当たりDPBSの10マイクロリットル当たり10〜7番目の細菌を1回ずつ服用する。注射器をマイクロシリンジポンプに積み込みます。幼虫が口の部分を開くのを待ってから、下顎の間に注射器を慎重に挿入し、細菌を送達します。幼虫のすべてが供給されたら、1〜24時間の間に摂氏37度で暗闇の中で動物をインキュベートします。幼虫加工の場合は、RNase汚染を防止するためのエタノールとスプレー試薬で安全フードを洗浄してください。スナップは、液体窒素中の生きている幼虫を凍結します。乳鉢と害虫と少量の液体窒素を使用して、個々の凍結幼虫を均質化します。粉末ホモゲン酸が製造されたら、ホモゲン酸を使い捨て待ちボートに移し、液体窒素が蒸発するのを待ちます。幼虫のすべてが均質化されたら、粉末ホモジナイートを2ミリリットルチューブに1ミリリットルのTRIzolと混合します。混合物を室温で1時間インキュベートする。インキュベーションの終わりに、遠心分離によってホモゲネートをペレットする。上清を新しいチューブに移します。上清を1-ブロモ-3クロロプロパン(BCP)の200マイクロリットルと混ぜます。渦を起分し、室温で5分間インキュベートし、続いて氷の上に10分間インキュベーションを行います。第2インキュベーションの終わりに、BCPを加えた反応を遠心分離し、上部透明層を新しい2つのミリリットルチューブに移す。5分間チューブを混合および反転させることにより、移管した上層のRNAを500マイクロリットルのイソプロパノールで沈殿させます。次いで遠心分離により沈殿したRNAを回収する。沈殿したRNAペレットを75%エタノールの500マイクロリットルで洗浄し、室温で5~10分間RNAを乾燥させます。エタノールが蒸発したら、リボヌクレアーゼ阻害剤を100マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に加えて乾燥したRNAペレットに加え、ペレットが完全に溶解するまでチューブを慎重に渦液化する。標準プロトコルでRNAの品質と量を測定し、260~280の比が約2、260~230の比が2~2.2の範囲であることを確認します。次に、DNaseの消化および遺伝子発現解析のために、標準的なプロトコルに従って、単離されたRNAの5マイクログラムを使用します。G.mellonellaは、細菌が検出されるまで、細菌の負荷を与えられた初期力をクリアすることができます。16s遺伝子コピー数はB.vulgatusと大腸菌の両方で24時間以内に大幅に減少した。コメンサル投与されたG.mellonella幼虫は、様々な自然免疫マーカー遺伝子のRNA遺伝子発現を誘導する。例えば、LPS認識分子、アポリポホリンおよびヘモリンは、一般に、幼虫を投与したB.vulgatusと比較して大腸菌投与幼虫においてより高く発現される。また、B.vulgatusに比べ、大腸菌の摂食時に活性酸素や窒素の生成が強くアップレギュレートされ、抗酸化GST遺伝子発現も強く行われています。また、B.vulgatus力の摂食に応答するよりも、大腸菌投与後のペプチド発現の差動が強く誘導される。健康で白く、速く動く幼虫のみを使用し、幼虫にストレスを与えないように力を与える間に忍耐を使用し、必要なすべてのコントロールを含めることを忘れないでください。G.mellonella免疫マーカーの活性化は、RUSまたはGST活性アッセイによって直接決定することができ、ANPの存在量は細菌増殖阻害アッセイによって決定することができる。この技術は、多くの脊椎動物を犠牲にすることなく、腸の共生生物および病理生物を探索するための、コメンサルおよび病原性細菌のスクリーニングツールとして使用することができる。液体窒素、BCP、またはTRIzol物質を扱う場合は、常に適切な個人用保護具を使用してください。

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Research

JoVE Journal

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学ぶハチミツガ口腔管理モデルによる自然免疫応答解析法。Galleria mellonellaを用いて細菌経口投与と免疫マーカー発現を測定し、ネズミ代替モデルとして免疫学研究に応用する。

ハチミツガ口腔管理モデル Study Commensal-Induced 自然免疫応答

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