Name: 分離、伝達、およびプリオン蛋白質発現ひと歯髄幹細胞の神経分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: 学ぶ歯髄幹細胞の効率的な分離・培養法と神経分化におけるプリオン蛋白質発現評価法。再生医療への応用とバイオバンク構築に有用なプロトコルを解説します。

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この作品は、「Fondazione Varrone」と Rieti 大学ハブ ヴィンチェンツォ ・ マッテイを"サビーナ大学」によって支持されました。
テイラー & フランシス ・株式会社から、図 5 (a, B) は出版社の許可を得て転載: 人間歯科パルプ由来幹細胞の神経分化の間に役割のプリオン蛋白質 EGFR multimolecular 複合体。Martellucci、s.、マンジャネッリ V. マッテイ V.プリオンSorice m ・ ピコリ L. Santilli F. Santacroce C.。2018 3 月 4日。テイラー ・ フランシス (株)

研究で使用されている第三大臼歯 (13-19 歳) 薬剤またはアルコールの消費のない前の歴史、すべて禁煙と適切な口腔衛生の患者から摘出し.科学歯科で「サピエンツァ」ローマ大学の顎顔面の説明の日に患者または両親からインフォームド コンセントを得た。倫理的な考察、倫理委員会の承認に基づくインフォームド コンセントを得た。
1. 歯や歯髄の抽出
<ol><li>
保全または交通機関のための適切な媒体の準備。
	<ol>
<li>ダルベッコ変更されたワシの中低濃度 L-グルタミン (494.5 mL) とグルコース (DMEM L) を準備します。</li>
		<li>ペニシリン/ストレプトマイシン (1%) 5 mL を追加します。0.5 mL アムホテリシン (0.1%)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>患者から第 3 大臼歯を抽出、すぐに PBS で洗い、培地 15 mL の試験管に入れ、2 時間未満で研究室にそれを転送します。</li>
	<li>バイオハザード フード カッターでコロナ カットパスの並列と歯髄腔の屋根を接線によって歯を開きます。</li>
	<li>優しく小さなショベルとパルプを削除し、テスト チューブ内に配置します。</li>
	<li>3 回 PBS で洗浄し、室温 10 分 2,500 × gで遠心分離</li>
</ol>2. 歯髄幹細胞の処理
<ol><li>上澄みを除去、ハンクのソリューションでペレットを再懸濁します、ペトリ皿に配置。5% CO2の 37 ° C で 2 時間インキュベートします。</li>
	<li>
IV コラゲナーゼ溶液製剤を入力します。
	<ol>
<li>DMEM L の 0.8 mL を準備します。</li>
		<li>DMEM L といくつかの分の渦の 0.8 mL のタイプ IV コラゲナーゼの 1 mg を溶かします。</li>
		<li>DMEM L を追加最終濃度を持っているまで 1 mL 1 mg/mL。</li>
		<li>0.22 μ M のフィルターでソリューションをフィルター処理します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>常温 10 分 2,500 × gで遠心分離によってハンクのソリューションを削除し、使い捨てメスと approximatively 1 mm の小さなスライスにパルプを分割します。</li>
	<li>ペトリ皿で果肉のスライスを配置し、1 ml 5% CO2の 37 ° C で 15 分間タイプ IV コラゲナーゼの間加温します。</li>
	<li>
培準備 (500 mL)。
	<ol>
<li>445 ml と L グルタミン DMEM L。</li>
		<li>ウシ胎児血清 (FBS) (10%) の 50 mL を追加します。</li>
		<li>ペニシリン/ストレプトマイシン (1%) 5 mL を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2,500 x gで RT 10 分のサンプルを遠心、上清を削除、5% CO2の 37 ° c (ステップ 2.5) 中ペレットと T25 フラスコ幹細胞の特定の文化を再懸濁します。</li>
</ol>3. 幹細胞文化および伝搬
<ol><li>毎日文化を確認し、成長の 3 日後、フラスコ内の付着性のセルの異なるクローンを観察します。</li>
	<li>培を 3 日おきに変更します。</li>
	<li>7 と 12 日間付着性のセルがリーチの合流点にしたら、それらをデタッチ 1 ml のトリプシン-EDTA 37 ° C で 3 分間のセルを扱うか優しく細胞スクレーパーを使用しています。</li>
	<li>トリプシンのアクションを停止する培養液 (ステップ 2.5) 4 ml (比率 1:5) を追加します。</li>
	<li>259 × gで 6 分の細胞懸濁液を遠心分離機、上澄みを除去し、伝達する T25 フラスコにセルを配置します。 注:3 日おき、電池が合流点に達する。</li>
	<li>21 または 28 日間 (約 6-8 通路)、培養細胞のような非幹の存在を避けるためにまでセルを反映します。</li>
	<li>1 ml のトリプシン-EDTA 37 ° C または優しくこするで 3 分のための細胞をデタッチします。259 × gで 6 分の細胞懸濁液を遠心します。</li>
	<li>上澄みを除去し、cytofluorimetric 分析 (手順 6) のセルをテストします。</li>
</ol>4. 過渡 PrPCサイレンシング siRNA
<ol><li>2 ml の培養液 (ステップ 2.5) 24 時間 hDPSCsin 6 ウェル プレート (2 x 105セル/mL) の文化します。</li>
	<li>
翌日、siRNA PrP メディア (400 μ L) の準備します。
	<ol>
<li>滅菌試験管に 384 μ L を追加 DMEM l.</li>
		<li>5 の最終濃度を持っている DMEM L に siRNA PrP の種類ごとに 1 μ L を追加 nM (4 siRNA PrP された使用、ノックダウン効率 70% を保証する製造業者によって確認しました)。</li>
		<li>DMEM l. に transfectionreagent の 12 μ L を追加します。</li>
		<li>渦混合物、トランスフェクションの複合体の形成を許可する RT で 10 分間インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>各サンプルに siRNA PrP 中の 400 μ L を追加し、37 ° C で 6 時間インキュベート</li>
	<li>SiRNA PrP 媒体を破棄せず培 (ステップ 2.5) の 1.6 mL (1 ~ 5 の比) を追加します。</li>
	<li>37 ° C で 72 時間細胞を残す</li>
	<li>上澄みを除去し、2 mL の PBS 室温で 3 回洗浄</li>
	<li>7/14 日 (ステップ 5.1) の神経細胞培養培地 2 mL を追加します。</li>
	<li>神経細胞の培養液を 3 日ごとに変更します。 注:置換 siRNA PrP ソリューション各時間神経細胞培養培地。</li>
	<li>時間の終わりに、2 mL の PBS 常温で 3 回洗って、西部のしみの分析による神経細胞の表面抗原のテストします。</li>
</ol>5. 神経誘導過程 hDPSCs
<ol><li>
神経細胞培養培地の調製 (500 mL)。
	<ol>
<li>神経細胞に作り出される基底メディア 444.7 mL を準備します。</li>
		<li>媒体無血清サプリメント胎児および成体の神経幹細胞 (10%) の長期的な存続を支援するために使用の 50 mL を追加します。</li>
		<li>メディア (最終濃度 20 ng/mL) に 200 μ L の塩基性線維芽細胞成長因子 (bFGF) (最終濃度 40 ng/mL) と 100 μ L の表皮成長因子 (EGF) を追加します。</li>
		<li>ペニシリン/ストレプトマイシン (1%) 5 mL を追加します。[中]。</li>
	</ol>
</li>
	<li>6 ウェル プレート (2 x 105セル/mL) の文化 hDPSCs パルプ分離から 28 日まで、神経細胞培養培地 2 mL にそれらを刺激します。</li>
	<li>上澄みを廃棄するごとに 3 日間、2 mL の PBS 常温で 3 回洗浄し、交換神経細胞培養培地 2 mL。</li>
	<li>7 および 14 日後に、1 ml のトリプシン-EDTA 37 ° C で 3 分のためのまたは軽くスクレーパーとセルをデタッチします。</li>
	<li>トリプシンのアクションを停止する培養液 (ステップ 2.5) 4 mL (比率 1:5) を追加します。</li>
	<li>フローサイトメトリー法によるプリオン蛋白質の表現 (ステップ 7) または神経細胞表面抗原 (手順 6) の存在をテストします。</li>
</ol>6. フローサイトメトリーによる hDPSCs の評価
<ol><li>間葉系間質 (MSC) を選択- または特定の神経細胞表面抗原。</li>
	<li>6 ウェル プレート (2 x 105セル/mL) 2 ml の培養液 (ステップ 2.5) で hDPSCs の文化.</li>
	<li>歯髄の分離または 37 ° C または優しくスクレーパーで 3 分の 1 ml のトリプシン-EDTA の神経細胞の培養液 (ステップ 5.1) 14 日後 28 日目に hDPSCs をデタッチします。</li>
	<li>トリプシンのアクションを停止する培養液 (ステップ 2.5) 4 ml (比率 1:5) を追加し、259 x centrifugate g室温 6 分別 2 回洗浄 2 ml の PBS の室温</li>
	<li>4 ° C で 10 分間の PBS で 4% パラホルムアルデヒドで未処理または処理の hDPSCs を修正します。</li>
	<li>室温でさらに 10 分の PBS で 0.1% (v/v) 非イオン性界面活性剤 hDPSCS を permeabilize します。</li>
	<li>5% 脱脂粉乳室温 1 時間 1 mL の PBS でブロックを実行します</li>
	<li>1 mL の PBS で 3 回洗浄し、反 CD105 とセルを孵化させなさい (1: 100/5 x 105セル)、抗 CD44 (1: 100/5 x 105セル)、反 STRO 1 (1: 100/5 x 105セル)、アンチ CD90 (1: 100/5 x 105セル)、アンチ CD73 (1: 100/5 x 105細胞)、β3-チューブリン アンチ (1: 100/5 x 105セル)、反フォッカー (1: 100/5 x 105セル) と反 GAP43 (1: 100/5 x 105セル) 室温 1 時間 mAb</li>
	<li>3 回で 1 mL の PBS セルを洗浄し、抗マウス PE (1:50/5 x 10 の5セル) または抗家兎 CY5 と孵化室温追加 1 時間 (1:50/5 x 10 の5セル) モノクローナル抗体</li>
	<li>免疫陽性細胞 (抗マウス PE または抗家兎 CY5 mAb) をゲートの二次抗体を使用し流れの cytometer ですべてのサンプルを分析し、少なくとも 20,000 のイベント。</li>
</ol>7. 流れ Cytometry による hDPSCs の PrPC式の評価
<ol><li>2 ml の培養液 (ステップ 2.5) hDPSCsin 6 ウェル プレート (2 x 105セル/mL) の文化します。</li>
	<li>21 と 28 日歯髄分離から、神経細胞培養培地 1 ml のトリプシン-EDTA の (手順 5.1) で 7 および 14 日後に hDPSCs を外し、手順 6.4 トリプシン アクションを停止します。4 ° C で 10 分間の PBS で 4% パラホルムアルデヒドで試料を固定します。</li>
	<li>0.1% (v/v) 非イオン性 surfactantin PBS で 10 分間でルート削除と上澄みを permeabilize し、ウサギ抗 PrP mAb EP1802Y (1:50/5 x 10 の5細胞) 細胞を染色抗家兎 CY5 とした加温 (1:50/5 x 10 の5セル) で 1 時間の mAb の mAbさらに 1 時間室温</li>
	<li>流れの cytometer ですべてのサンプルを分析し、少なくとも 20,000 のイベントを取得します。</li>
</ol>

<ol><li>Robey, P. G., Kuznetsov, S. A., Riminucci, M., Bianco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cell+assays%3A+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cell assays: in vitro and in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 1130, 279-293 (2014).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adult+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.</a> Nature. 418, 1-49 (2002).</li>
<li>Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+mesenchymal+stem+cells+from+bone+marrow%2C+umbilical+cord+blood%2C+or+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue.</a> Stem Cells. 24, 1294-1301 (2006).</li>
<li>Zannettino, A. C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-potential+Human+adipose-derived+stromal+stem+cells+exhibit+a+perivascular+phenotype+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multi-potential Human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo.</a> Journal of Cellular Physiology. 214, 413-421 (2008).</li>
<li>Mattei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+lipid+rafts+in+neuronal+differentiation+of+dental+pulp-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Role of lipid rafts in neuronal differentiation of dental pulp-derived stem cells.</a> Experimental Cell Research. 339, 231-240 (2015).</li>
<li>Jansen, J., Hanks, S., Thompson, J. M., Dugan, M. J., Akard, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+from+the+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Transplantation of hematopoietic stem cells from the peripheral blood.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (1), 37-50 (2005).</li>
<li>Young, F. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+heterogeneity+in+the+neuronal+and+glial+differentiation+of+dental+pulp+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Clonal heterogeneity in the neuronal and glial differentiation of dental pulp stem/progenitor cells.</a> Stem Cells International. 2016, 1290561(2016).</li>
<li>Pisciotta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dental+pulp+stem+cells+%28hDPSCs%29%3A+isolation%2C+enrichment+and+comparative+differentiation+of+two+sub-populations%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Human dental pulp stem cells (hDPSCs): isolation, enrichment and comparative differentiation of two sub-populations.</a> BMC Developmental Biology. 15, 14(2015).</li>
<li>Atari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+pulp+of+the+third+molar%3A+a+new+source+of+pluripotent-like+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Dental pulp of the third molar: a new source of pluripotent-like stem cells.</a> Journal of Cell Science. 125, 3343-3356 (2012).</li>
<li>Koyama, N., Okubo, Y., Nakao, K., Bessho, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+pluripotency+in+human+dental+pulp+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+oral+and+maxillofacial+surgery%3A+official+journal+of+the+American+Association+of+Oral+and+Maxillofacial+Surgeons%22%5BJournal%5D)">Evaluation of pluripotency in human dental pulp cells.</a> Journal of oral and maxillofacial surgery: official journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 67, 501-506 (2009).</li>
<li>Gronthos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+properties+of+human+dental+pulp+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Stem cell properties of human dental pulp stem cells.</a> Journal of Dental Research. 81, 531-535 (2002).</li>
<li>Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S. A., Gronthos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+dental+pulp+stem+cells+differentiate+toward+functionally+active+neurons+under+appropriate+environmental+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues.</a> Stem Cells. 7, 1787-1795 (2008).</li>
<li>Lee, Y. J., Baskakov, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+form+of+the+prion+protein+is+involved+in+controlling+cell+cycle+dynamics%2C+self-renewal%2C+and+the+fate+of+human+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">The cellular form of the prion protein is involved in controlling cell cycle dynamics, self-renewal, and the fate of human embryonic stem cell differentiation.</a> Journal of Neurochemistry. 124, 310-322 (2013).</li>
<li>Steele, A. D., Emsley, J. G., Ozdinler, P. H., Lindquist, S., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+protein+%28PrPc%29+positively+regulates+neural+precursor+proliferation+during+developmental+and+adult+mammalian+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prion protein (PrPc) positively regulates neural precursor proliferation during developmental and adult mammalian neurogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 3416-3421 (2006).</li>
<li>Wulf, M. A., Senatore, A., Aguzzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+function+of+the+cellular+prion+protein%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">The biological function of the cellular prion protein: an update.</a> BMC Biology. 15, 34(2017).</li>
<li>Mattei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+cellular+prion+protein+to+mitochondrial+raft-like+microdomains+contributes+to+apoptosis+execution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Recruitment of cellular prion protein to mitochondrial raft-like microdomains contributes to apoptosis execution.</a> Molecular Biology of the Cell. 22, 4842-4853 (2011).</li>
<li>Linden, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biological+Function+of+the+Prion+Protein%3A+A+Cell+Surface+Scaffold+of+Signaling+Modules%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Biological Function of the Prion Protein: A Cell Surface Scaffold of Signaling Modules.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 77(2017).</li>
<li>Garofalo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mitochondrial+raft-like+microdomains+in+the+regulation+of+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Role of mitochondrial raft-like microdomains in the regulation of cell apoptosis.</a> Apoptosis. , 621-634 (2015).</li>
<li>Watt, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species-mediated+beta-cleavage+of+the+prion+protein+in+the+cellular+response+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species-mediated beta-cleavage of the prion protein in the cellular response to oxidative stress.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 35914-35921 (2005).</li>
<li>Mattei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+Withdrawal+Modifies+Prion+Protein+Expression+in+Rat+Hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Morphine Withdrawal Modifies Prion Protein Expression in Rat Hippocampus.</a> PLoS One. 12, 0169571(2017).</li>
<li>Hu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+proteins%3A+physiological+functions+and+role+in+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Neurological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Prion proteins: physiological functions and role in neurological disorders.</a> Journal of the Neurological Sciences. 264, 1-8 (2008).</li>
<li>Sorice, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+PrPC+to+mitochondrial+raft-like+microdomains+during+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Trafficking of PrPC to mitochondrial raft-like microdomains during cell apoptosis.</a> Prion. 6, 354-358 (2012).</li>
<li>Martellucci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Prion+protein-EGFR+multimolecular+complex+during+neuronal+differentiation+of+human+dental+pulp-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Role of Prion protein-EGFR multimolecular complex during neuronal differentiation of human dental pulp-derived stem cells.</a> Prion. 12 (2), 117-126 (2018).</li>
<li>Lee, Y. J., Baskokov, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+form+of+the+prion+protein+guides+the+differentiation+of+human+embryonic+stem+cell+into+neuron-%2C+oligodendrocyte-+and+astrocyte-committed+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">The cellular form of the prion protein guides the differentiation of human embryonic stem cell into neuron-, oligodendrocyte- and astrocyte-committed lineages.</a> Prion. 8, 266-275 (2014).</li>
<li>Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+human+dental+pulp+cells%3A+various+isolation+methods+and+culturing+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments.</a> Cell and Tissue Research. 324, 225-236 (2006).</li>
<li>Suchanek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+pulp+stem+cells+and+their+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+papers+of+the+Medical+Faculty+of+the+University+Palack%C3%BD%22%5BJournal%5D)">Dental pulp stem cells and their characterization.</a> Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacký. 153, Olomouc, Czechoslovakia. 31-35 (2009).</li>
<li>Bressan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+age-related+biological+properties+of+human+dental+pulp+stem+cells+change+in+nanostructured+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Donor age-related biological properties of human dental pulp stem cells change in nanostructured scaffolds.</a> PLoS One. 7 (11), 49146(2012).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

この作品での分離と hDPSCs; 神経分化の方法論に着目さらに、このプロセスで PrPCの役割を評価しました。分離し、プロセス中に神経細胞のような細胞で重要なステップ hDPSCs を区別するいくつかの方法があります。hDPSCs は、軟骨細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、神経細胞などいくつかの系統に区別することができます。私たちの論文では神経細胞の分化のメカニズムと PrPCの存在を調べた。前述したように、これらの細胞は、CD44、CD90, CD105、CD73、STRO 110,25,26など典型的な間葉系間質固有表面抗原を表現します。
プロトコルでは、いくつかの重要なステップ分離のプロシージャのエラーが発生することができます。最初の重要なステップは、患者の27の選択によって表されます。我々 の経験でわかっ...

間葉系幹細胞は、骨髄、臍帯血、歯髄、脂肪組織、血液1,2,3,4,5など、いくつかの組織から分離されています。,6。 hDPSCs がプラスチック付着、典型的な線維芽細胞様形態を示す何人かの著者によって報告されるようです。これらは異なるクローン増殖と分化能力7,8の違いと非常に異種の人口を表しています。hDPSCs 間葉系幹細胞 (すなわち CD44、CD90、CD73, CD105、STRO 1) 特定のマーカーの表現、(CD14 CD19 など) いくつかの造血のマーカーは陰性、血液分化9、ことができる10,11。
何人かの著者は、これらの細胞は神経成長因子、bFGF、特定メディアとサプリメント7,12との組み合わせで EGF を添加し、異なるプロトコルを使用して神経細胞のような細胞に分化することが示されています。また、神経細胞の分化のプロセス中に多くのタンパク質が関与しているし、これらのうち、いくつかの論文を表示関連する役割と重要な発現細胞プリオンタンパク質 (PrPC)、胎児および成体幹細胞13,の両方14., 分子として銅代謝、アポトーシス、細胞内の異なる機能を実行できるを表し、耐酸化ストレス15,16,17 PrPC,18,19,20,21,22。
私たち以前紙23、hDPSCs 神経分化過程における PrPCの役割を検討しました。実際には、hDPSCs エクスプレス早熟 PrPCと、神経細胞の分化後追加の増加を観察することが可能だった。他の著者は、幹細胞の神経分化過程における PrPCの可能な役割を仮定しました。確かに、PrPCはアストロ サイト、オリゴデンドロ サイト、ニューロンの24にヒト胚性幹細胞の分化をドライブします。本研究の目的は、神経細胞の分化の間に歯髄、その分化過程と PrPCの役割から幹細胞を得るための方法論を強調していた。

<table><tbody><tr><td>アムホテリシンB溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td>細胞培養培地を補うために使用され、Streptomyce</td></tr><tr><td>Anti-B3tubulin</td><td>Cell Signaling Technology</td>のポリエン抗真菌抗生物質です&nbsp;<td>#4466</td><td>6つのB-チューブリンアイソフォームの1つで、胎児および出生後の発育中に高発現し、末梢神経系で高いままです</td></tr><tr><td>抗CD105&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>611314</td><td>Endoglin (CD105) は、ヒト血管内皮の主要な糖タンパク質であり、大きな細胞外領域、疎水性膜貫通領域、および短い細胞質尾部を持つ</td></tr><tr><td>抗 CD44</td><td>ミリポア</td><td>CBL154-20ul</td><td>ポジティブ セル マーカー 間葉系幹細胞に対する抗体</td></tr><tr><td>抗 CD73&nbsp;</td><td>細胞シグナル伝達技術&nbsp;</td><td>13160</td><td>CD73は、70 kDaのグリコシルホスファチジルイノシトールに固定された膜結合糖タンパク質で、細胞外ヌクレオシド一リン酸の生理活性ヌクレオシドへの加水分解を触媒</td></tr>します <tr><td>抗CD90</td><td>ミリポア</td><td>CBL415-20ul</td><td>間葉系幹細胞に対する陽性細胞マーカー抗体</td></tr><tr><td>抗GAP43&nbsp;</td><td>細胞シグナル伝達技術&nbsp;</td><td>#8945</td><td>は、成長円錐体および高可塑性の領域における神経系特異的な成長関連タンパク質です</td></tr><tr><td>抗マウスPE&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab7003</td><td>は、フローサイトメトリーまたはFACS分析で使用される抗体です</td></tr><tr><td>。</td><td>細胞シグナル伝達技術&nbsp;</td><td>#2836</td><td>ニューロフィラメント-Hタンパク質 Anti-PrP mAb の全内因性レベルを検出する抗体です</td></tr><tr><td>EP1802Y&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab52604</td><td>ウサギモノクローナル [EP 1802Y] to Prion protein PrP</td></tr><tr><td>Anti-rabbit CY5&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab6564</td><td>は、フローサイトメトリーまたはFACS分析で使用される抗体です</td></tr><tr><td>抗STRO 1</td><td>ミリポア</td><td>MAB4315-20ul</td><td>陽性細胞マーカー抗体 間葉系幹細胞</td></tr><tr><td>B27 Supp XF CTS</td><td>Gibcoによって生命技術</td><td>A14867-01</td><td>B-27&nbsp;多能性幹細胞(PSC)からのヒト神経幹細胞(hNSC)の誘導、hNSCsの拡大をサポートするために使用できます。 培養BD Accuri C6フローサイトメーターにおけるhNSCの分化と成熟分化ニューロンの維持</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>AC6531180187</td><td>青色レーザー (488 nm) と赤色レーザー (640 nm) を搭載したフローサイトメーターBD</td></tr> <tr><td>Accuri C6 ソフトウェア&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>は、データの取得、統計の生成、および結果の分析のためにBD Accuri C6フローサイトメーターシステムを制御</td></tr>しています <tr><td>bFGF</td><td>PeproThec、DBA</td><td>100-18B</td><td>基本的な線維芽細胞成長因子&nbsp;</td></tr><tr><td>遠心分離機CL30R</td><td>Termoの漁師の科学</td><td>的な11210908</td>それは密度のCO2インキュベーター3541 Termoの漁師科学的な317527-185に基づいて<td>液体、ガスまたは液体の分離のために使用される装置である</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>それは細胞培養のための最適で、再現可能な成長条件を保障</td></tr>する <tr><td>コラゲナーゼ、タイプIV&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ17104019</td><td>コラゲナーゼは、コラーゲンの使い捨てメスに高頻度で見られるPro-X-Glyc-Pro配列の中性アミノ酸(X)とグリシンとの間の結合を切断するプロテアーゼ</td></tr><tr><td>です。</td><td>スワン・モートン</td><td>501</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-L</td><td>ユーロクロン</td><td>ECM0060L</td><td>ダルベッコのモディファイドイーグルの中低グルコース、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム</td></tr><tr><td>EGF</td><td>ペプロテック、DBA</td><td>AF-100-15</td><td>上皮成長因子&nbsp;</td></tr><tr>Life Technologies <td>10270-106</td> FBSによる<td>ウシ胎児血清</td><td>Gibco</td><td>は、細胞培養において幅広い機能を提供するため、人気のある培地サプリメントです。FBSは、栄養素、増殖因子、付着因子を送達し、無血清培地(SFM)システムでは再現が困難なメカニズムにより、細胞を酸化的損傷やアポトーシスから保護します</td></tr><tr><td>Filtropur BT50 0.2,500 mL ボトルトップフィルター</td><td>Sarstedt</td><td>831,823,101</td> これは、<td>PRNP</td></tr><tr><td>Qiagen</td><td>GS5621</td><td>用の溶液Flexitube GeneSolution</td>のろ過に使用されるデバイスです<td>Entrez遺伝子5621の4つのsiRNA。ターゲットシーケンスN.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA&nbsp;N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA&nbsp;N.3. CTGAATCGTTTTTCATGTAAGAA&nbsp;N.4&nbsp;CAGTGACTATGAGGACCGTTA</td></tr><tr><td>ハンクのソリューション 1x</td><td>Gibco by life technologies</td><td>240200083</td><td>ハンクス&プライムの本質的な機能;バランスの取れた塩溶液は、pHと浸透圧のバランスを維持するためのものです。また、細胞に水と必須無機イオンを提供します</td></tr><tr><td>HiPerFectトランスフェクション試薬&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>301705</td><td>HiPerFect Transfection Reagentは、カチオン性脂質と中性脂質のユニークなブレンドであり、効果的なsiRNAの取り込みと細胞内のsiRNAの効率的な放出を可能にし、低siRNA濃度の</td></tr>神経<tr><td>基礎A&nbsp;</td><td>Gibco by life technologies</td><td>10888022</td><td>Neurobasal-A Mediumは、純粋な出生後および成人の脳ニューロンの長期維持と成熟のために設計された基礎培地です。</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td>パラホルムアルデヒドは、ペ</td></tr><tr><td>ニシリン/ストレプトマイシン</td>の染色手順中に細胞および組織切片の固定に使用されています。<td>ユーロクロン</td><td>ECB3001D&nbsp;</td><td>細菌汚染を制御するための細胞培養培地の補充に使用します</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水&nbsp;(PBSの)</td><td>ユーロクローン</td><td>ECB4004LX10&nbsp;</td><td>PBSは、哺乳類細胞の取り扱いと培養に使用されるバランスの取れた塩溶液です。PBSは、哺乳類細胞の灌漑、洗浄、希釈に使用されます。リン酸緩衝剤は、生理学的範囲のpHを維持します</td></tr><tr><td>TC-Platte 6 well, Cell+,F</td><td>Sarstedt</td><td>833,920,300</td><td>それは付着細胞の成長面です</td></tr><tr><td>組織培養フラスコ T-25,Cell+,Vented Cap</td><td>Sarstedt</td><td>833,910,302</td><td>組織培養フラスコT-25、ポリスチレン、Cell+敏感な接着細胞のための成長面、例えば、初代細胞、傾斜した首、換気キャップ、黄色、滅菌、パイロジェンフリー、非細胞毒性、 10個/袋</td></tr><tr><td>トリトン X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>穏やかな非変性条件下での膜成分の回収に広く使用されている非イオン性界面活性剤</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA&nbsp;</td><td>ユーロクロン</td><td>ECB3052D&nbsp;</td><td>トリプシンは、リジンおよびアルギニンアミノ酸残基のC末端側のペプチドを切断します。トリプシンは、培養表面から付着細胞を除去するために使用されます</td></tr><tr><td>チューブ</td><td>Sarstedt</td><td>62,554,502</td><td>チューブ 15 mL、120 mm x17 mm、PP</td></tr><tr><td>VBH 36 C2 コンパクト</td><td>滅菌</td><td>ST-003009000</td><td>環境と労働者のための完全な保護を提供します</td></tr><tr><td>ZEISS Axio Vert.A1 &ndash;反転&nbsp;顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>3849000962</td><td>ZEISS Axio Vert.A1は、ユニークなエントリーレベルの価格を提供し、明視野、位相コントラスト、PlasDIC、VAREL、改善ホフマン変調コントラスト(iHMC)、DIC、蛍光を含むすべてのコントラスト技術を提供できます。LED照明を組み込んで、蛍光標識細胞を優しくイメージングします。Axio Vert.A1は、人間工学に基づいて設計されており、日常的な作業のために設計されており、組織培養フードの内側に収まるほどコンパクトです。</td></tr></tbody></table>

分離、伝達、およびプリオン蛋白質発現ひと歯髄幹細胞の神経分化

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

胚性幹細胞の操作に関連する生命倫理の問題は、医学研究の分野での進歩を妨げています。このため、脂肪、臍帯、骨髄血などさまざまな組織から成体幹細胞を得ることが非常に重要です。可能なソースの間で倫理的配慮に関して入手が容易だから、歯髄は特に興味深いです。確かに、ひと歯髄幹細胞 (hDPSCs) は成体幹細胞の神経様細胞に区別することの一種で、健康な患者 (13-19 歳) の第 3 大臼歯から取得することができます。特に、歯髄除去掘削機と、小さなスライスにカット、IV コラゲナーゼで処理し、フラスコで培養します。神経細胞の分化を誘導して、2 週間 hDPSCs EGF/bFGF と刺激を受けました。以前は、その分化過程プリオンの内容 hDPSCs の蛋白質 (PrPC) 増加を確認しました。Cytofluorimetric 分析は、神経細胞の分化プロセス後に増加した PrPCの早期発現を示した。SiRNA による prpCアブレーション PrP EGF/bfgf 投与による神経細胞の分化を防止しました。本稿で我々 は分離、分離およびいくつかの簡単な手順で hDPSCs 栽培体外を強化より効率的な細胞クローンされた間葉系幹細胞 (MSCs) の取得と大規模な拡大を説明します。観察されました。また、どのプロトコルでは、詳細な方法で得られた、hDPSCs、MSCs の神経分化過程とその後の細胞および分子プロセスを研究する優秀な実験モデルを示す.

第 3 大臼歯から得られる歯髄から hDPSCs の分離と分離のプロシージャは、小さな変化が破滅的な結果を導くことができる複雑なプロセスです。本稿でのアーサー et al.プロトコルを使用してください。12いくつかの改善をします。プロシージャの代表的な方式を図 1に示します。
hDPSCs は、異なるクローン増殖と分化能力7,8の違いと細胞の異種集団を表します。パルプの分離およびパルプの小さな断片のシード後、細胞周囲に拡大を見ました。図 2は、4 日 (中央パネル) と 7 日 (右側のパネル) 歯髄分離から 1 日 (左のパネル)、細胞の小さなクラスタ...

ここでプリオン蛋白発現神経細胞の分化過程を評価するために人間の歯髄幹細胞の分離と伝搬するためのプロトコルを提案する.

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...

歯髄から幹細胞を得るための標準的な方法は効率が悪く、これはいくつかの可変に依存する。我々のプロトコルは、症例の90%で治療された歯から幹細胞の正常な分離を得ることを可能にした。数週間で多数の細胞を得ることが主な利点です。これにより、細胞を再生医療に使用し、他の科学者にこの有用なツールを提供するバイオバンクを作成することができます。歯を開くための手順は、コンスタンティノサンタクローチェ博士によって行われます。その後、このプロトコルは、記事の最初の著者である私の研究室の博士課程の学生、ステファノ・マルテルッチによって示されます。まず、患者から3番目の大臼歯を抽出し、PBSで素早くリンスし、培地と一緒に15ミリリットルの試験管に入れ、2時間以内に実験室に移します。バイオハザードフードの下で、カッターを使用して、パルプチャンバーの屋根を通って平行で接線のコロナ切断パスで歯を開きます。小さな掘削機で、パルプを静かに取り外し、試験管に入れてください。次いで、PBSを3回洗浄し、遠心分離機を室温で2、500倍に10分間洗浄した。遠心分離後、上清を取り除く。ハンクの溶液中のペレットを再び懸濁し、ペトリ皿にサンプルを移します。ハンクの溶液を室温で2、500倍のgで10分間遠心分離して取り除きます。その後、使い捨てのメスで、パルプを約1ミリメートルのスライスに分け、IV型コラゲターゼを1ミリリットル加えます。次に、試料を室温で2、500倍gで10分間遠心する。上清を取り除き、培地中のペレットを再懸濁する。T25フラスコで、5%の二酸化炭素で摂氏37度の幹細胞に特異的な培養を行います。インキュベーション期間中、3日毎に培地を交換する。接着細胞が合流したら、トリプシン-EDTA溶液を1ミリリットル加えて細胞を取り外し、37°Cで3分間培養します。次に、トリプシン作用を停止するために1対5の比率で培養培地を4ミリリットル加え、細胞懸濁液を259回gで6分間遠心する。上清を取り除く。次に、細胞をT25フラスコに入れて伝播します。その後、トリプシン-EDTAを1ミリリットルのトリプシン-EDTAで37°Cで3分間取り外します。細胞懸濁液を259回gで6分間遠心分離する。上清を取り除き、細胞の試験に進みます。一過性プリオンタンパク質サイレンシング工程を行うために、まずヒト歯髄幹細胞を2ミリリットルの培養培地を用いた6ウェルプレートで24時間培養する。次に、各サンプルに400マイクロリットルの小さな干渉RNA PrP培地を加え、摂氏37度で6時間インキュベートします。siRNA PrP培地を廃棄せずに、1対5の比率で1.6ミリリットルの培養培地を添加し、細胞を摂氏37度で72時間放置する。インキュベーション期間の後、上清を取り除き、室温で2ミリリットルのPBSで細胞を3回洗浄する。次に、2ミリリットルの神経培養培地を加え、細胞を37°Cのインキュベーターに7〜14日間保持する。インキュベーション期間の後、室温で2ミリリットルのPBSで細胞を3回洗浄し、ウェスタンブロット分析に進み、神経表面抗原を検査します。神経伝達過程を行うために、6ウェルプレートで200万個のヒト歯髄幹細胞を培養し、パルプ分離から最大28日を行う。3日ごとに上清を捨てる。室温でPBSを2ミリリットルで3回洗浄し、2ミリリットルの神経培養培地を交換する。7~14日後、トリプシン-EDTAを1ミリリットルのトリプシン-EDTAで37°Cで3分間取り外します。次いで、トリプシン作用を停止させるために1対5の比率で培養培地の4ミリリットルを加える。フローサイトメトリーによりヒト歯髄幹細胞を特徴付けるために、培養液を2ミリリットルの培養液で6ウェルプレートに2ミリリットル培養する。歯髄分離後28日または神経細胞培養培地でさらに14日後に、トリプシン-EDTAの1ミリリットルを摂氏37度で3分間加えて細胞を剥離する。次に、トリプシン作用を停止するために1対5の比率で培養培地を4ミリリットル加え、室温で259倍gの遠心分離物を6分間加える。PBSで4%パラホルムアルデヒドの300マイクロリットルで未処理または処理された細胞を摂氏4度で10分間固定します。次に、遠心分離機を、上清を捨て、PBSで1%非イオン性界面活性剤を1%で透過させ、さらに10分間室温で培養した。次いで、再度遠心分離機を、上清を捨て、室温で1ミリリットルのPBSで5%ノンファットドライミルクでブロッキングを1時間行う。PBSを1ミリリットルで3回洗浄し、抗CD105、抗CD44、抗STRO-1、抗CD90、抗CD73、抗ベータ3チューブリン、抗NFH、抗GAP43モノクローナル抗体を室温で1時間インキュベートします。次に、6分間間隔でPBSを1ミリリットルで細胞を3回連続して遠心分離し、次に抗マウスPEまたは抗ウサギCY5モノクローナル抗体を室温で1時間追加でインキュベートする。免疫陽性細胞を測定するための二次抗体を使用し、フローサイトメーターですべてのサンプルを分析します。培養培地2ミリリットルの6ウェルプレートにヒト歯髄幹細胞の1ミリリットル当たり200万個の細胞を培養する。歯髄分離後21日および28日、または神経細胞培地でさらに7〜14日後に、トリプシン-EDTAの1ミリリットルを摂氏37度で3分間加えて細胞を剥離する。次いで、遠心分離機を、上清を捨て、その後、PBSで4%パラホルムアルデヒドを10分間摂氏4度で固定します。次に、遠心分離機を、上清を捨て、次いでPBSで1%非イオン性界面活性剤を室温で10分間透過させた。上清を取り除き、ウサギの抗PrPモノクローナル抗体を室温で1時間染色します。最後に、遠心分離機を、上清を捨て、次に抗ウサギCY5モノクローナル抗体を室温で1時間インキュベートする。フローサイトメーターですべてのサンプルを分析します。パルプ分離後、ヒト歯髄幹細胞のクラスターが周辺に拡大した。EGF/bFGFによって誘導されるニューロン分化前後のこれらの細胞の増殖の比較は、細胞形態および神経突起の成長に有意な変化を示した。未治療ヒト歯髄幹細胞は、CD44、CD90、CD105、CD73、STRO-1などの多能性間葉間質比表面抗原を発現した。適切な神経誘導刺激の後、これらの細胞はβ-3-チューブリン、NFH、GAP43などの特定のニューロンマーカーを発現した。未処理または処理細胞は、CD14およびCD19のような造血マーカーを発現しなかった。28日後、プリオンタンパク質は、対応する陰性対照と比較してヒト歯髄幹細胞で初期発現し、EGF/bFGFによって誘導された神経細胞分化プロセスの後にその発現を増加した。ウェスタンブロット分析は、EGF/bFGF刺激の前にsRNAによってプリオンタンパク質をサイレンシングすることは、ニューロンマーカーβ-3チューブリンおよびNHFの発現を防ぐことによってヒト歯髄幹細胞の神経分化プロセスに影響を及ぼす可能性があることを示した。最も重要なことは、パルプから細胞を分離する酵素の選択です。実際、酵素があまりにも積極的な場合、細胞が損傷し、その成長と分化能力が損なわれる可能性があります。歯髄幹細胞は、再生医療分野で生体内およびインビトロ研究で採用できる優れた実験モデルです。PrPは歯髄幹細胞の神経分化過程において重要な役割を果たすため、このマーカーは神経変性疾患における有効な標的として優れた候補となる可能性がある。最も重要な点は、感染症の存在など、患者の健康状態です。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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分離、伝達、およびプリオン蛋白質発現ひと歯髄幹細胞の神経分化

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