Name: Aggresome のような誘発構造で退色の黄色蛍光タンパク質タグ p62 後の蛍光回復 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: 学ぶ蛍光回復後光漂白法（FRAP）を用いた生細胞内タンパク質動態の定量解析。マウスマクロファージRAW264.7細胞でYFP-p62タグ付き凝集体構造の可動性を評価し、細胞生物学・創薬研究に応用可能な実用的プロトコルを提供する。

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この原稿の彼の貴重なコメント、ロヨラ大学シカゴ校で博士セス Robia に感謝しますこの作品は、NIH グラント 1R01NS073967 01A1 ジョアンナ C. Bakowska にによって支えられました。

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</ol>

著者はある利益相反を開示します。

生きているセルと FRAP 実験の包括的な実用的なおよび簡単なステップバイ ステップのプロトコルを提供します。ここで、RAW264.7 マクロファージ ALIS で YFP p62 の移動度を測定するために使用された、プロトコルがレーザ共焦点顕微鏡システムの多くに適用されることができます、利用可能になりました蛍光タンパク質遺伝子をエンコードします。あらゆる顕微鏡システムのパイロット実験は退色と prebleach と postbleach の画像の獲得のための取得、漂白剤、および、コントロール ROI サイズのレーザー強度を含む最適な FRAP パラメーターを決定するため重要です。各遺伝子にエンコードされた蛍光タンパク質と細胞ラインのために異なる最適な FRAP パラメーターを期待するは無理です。
(A) 適切な達成を含める FRAP 実験を行なうとき考慮すべき重要な要因はブリーチ深さ、(b) 簡単な漂白のステップ、完全復旧機能、(d) 光効率を観察する (c) できるように十分な時間 postbleach の使用 (e)。細胞毒性と繰り返し FRAP、(f) 繰り返しイメージングによる蛍光の損失のためのコントロールを含めることです。セクション 3.3.1 で提供される同等化に従って計算することができます、漂白剤深さ ≥9013であることをお勧めします。漂白剤の深さが < 90、postbleach 蛍光回復の程度を過小評価することと値 i Mf、ft1/2不正確になります。FRAP 実験の期間と漂白剤誘導レーザー パルスの強度はさまざまフォトブリーチング ステップする簡潔な蛍光の回復機能よりもかなり速いことが重要です。それはない、漂白の段階の蛍光回復のかなりの量が起こります。時間が長い漂白剤の漂白の段階の蛍光回復ない測定されると私の不正確な測定につながるfMf、およびt1/2。さらに、fMf、私の正しい値を取得してt1/2、投資収益率の獲得を守らなければなりません postbleach ROI 漂白剤に蛍光レベルが高原に達するまで。たとえば、FRAP 実験ではなかった間違い Mf、ft1/2値 32.2 分ブリーチ投資収益率 ROI 漂白剤で YFP p62 を見ましたとき対 postbleach YFP p62 蛍光観測したときの15.1 分 postbleach;したがって、我々 は回復機能 15.1 分 postbleach12のプラトーに達したことを締結しました。フォトブリーチング効率に関してフォトブリーチング光学ズーム係数14の正方形と増加します。したがって、高光学ズーム レンズの使用は急速な退色のために好ましいが、望ましくないフォトブリーチング取得中に発生することができます。後者把握できるイメージ コントロール ROI によって。繰り返し退色は細胞毒性活性酸素種 (ROS) の生成することになるために避けられることです。しかし、高強度レーザー照射による活性酸素生成の度合いが低い化学発光する蛍光剤 (蛍光抗体など)15日より遺伝的コード化蛍光蛋白質と生成された ROS は反応する可能性が高い蛋白質の内で遺伝的コード化蛍光よりもセル4の他の分子と。細胞傷害性 ROS の生成の増加の確率に加えて繰り返し退色はコントロールすることは困難であるに避けられることです。最後に、低レーザー伝送はブリーチ以外のすべての画像を取得する使用されますが、いくつかの退色が必ず発生するを制御する必要があります。このため可能なコントロール監視など買収 ROI 内のコントロール ROI で蛍光、隣接無漂白セルにコントロールのイメージを取得で使用される同一の設定と制御実験を行うこと、退色実験なく退色イベント。

退色 (FRAP) はライブにおけるタンパク質ダイナミクスを定量化するため顕微法後の蛍光回復細胞1,2です。レーザ走査型共焦点顕微鏡高解像度、速度、感度と、広範な商業的利用のため FRAP の人気が増加しているし、の「虹」遺伝子にエンコードされた蛍光タンパク質、蛍光グリーンなどタンパク質 (GFP) と黄色い蛍光蛋白質 (YFP)3。興味の蛋白質の細胞レベル下のローカリゼーションのために興味の蛋白質を遺伝子にエンコードされた蛍光タンパク質を融合します。典型的な FRAP 実験低強度レーザー光と ROI の繰り返し画像を用いてセル内の利益 (率 ROI) の買収地域の定常状態の蛍光が観察されます。その後、蛍光分子は、以下に高強度レーザー光を簡単に暴露によって投資収益率、漂白剤と呼ばれる買収投資収益率の定義済みのサブセットで迅速かつ不可逆的に障害します。無漂白の新しい蛋白質は、時間をかけて漂白蛋白質を補充すると速度と漂白剤 ROI の蛍光回復の強度は蛋白質の移動性 (図 1)4についてを説明します。
リポ多糖 (LPS) の刺激がきっかけに、FRAP を確認後 RAW264.7 マウスマクロファージ内 aggresome のような誘導構造 (ALIS) のユビキチン結合タンパク質 p62 (として知られている sequestosome-1) の流動性を決定する上で我々 の関心文学。残念ながら、多くの既存 FRAP プロトコル、不完全なまたは極端に複雑で5,6,7,8,9です。いくつかは、レーザーの設定、ビーム パス構成では、画像集録パラメーター5,6,7,8,9の詳細を行いません。他の人はブリーチ ROI ドリフト6,9の問題に対処する方法やモバイル分数 (Mf)、不動小数を含む重要な回復パラメーターを計算する方法などのデータ分析に関する重要な詳細事項を省略しました。(私f)、および回復 (t½)5,7の半分の時間。逆に、他の人は Mf、計算に使用される複雑な数式にあまり重点を置く私f、および t1/25,6,8,9。したがって、我々 の目的は生きているセルと FRAP 実験の包括的な実用的な簡単なステップバイ ステップ プロトコルを提供します。

<table><tbody><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグルミディアムハイ</td><td>クロン</td><td>SH30022.01</td>高<td>グルコース(4.5 g / L)</td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td>ジェミニバイオプロダクツ</td><td>100-106</td><td></td></tr>ガラス<tr><td>底皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>ImageJソフトウェア</td><td>国立衛生研究所</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>リポ多糖類(LPS)</td><td>シグマ</td><td>L4391</td><td></td></tr>ノ<tr><td>コダゾール</td><td>シグマ</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液</td><td>コーニング</td><td>30-002-Cl</td><td>100&��回;</td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 63&times;/1.40 油対物レンズ</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td><td>4407629904000000</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine (PEI)</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td>linear (MW 25,000)</td></tr><tr><td>RAW 264.7 マウスマクロファージ</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 共焦点顕微鏡</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td><td>LSM 510</td><td></td></tr></tbody></table>

aggresome のような誘発構造で退色の黄色蛍光タンパク質タグ p62 後の蛍光回復

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

(FRAP) 退色後蛍光回復 生細胞における蛋白質の移動性を定量化する使用ことができます顕微鏡手法です。典型的な FRAP 実験で繰り返される低強度レーザー光による定常状態の蛍光が観察されます。その後、蛍光分子が高強度レーザー光を簡単に暴露を介して迅速かつ不可逆的障害です。蛋白質の移動性に関する情報は、蛍光の回復を監視することによって取得されます。リポ多糖 (LPS) の刺激によた後マウスマクロファージ内 aggresome のような誘導構造 (ALIS) の p62 の流動性を決定する FRAP を使いました。不完全なまたは複雑な多くの既存 FRAP プロトコルであるために、私たちの目標は生きているセルと FRAP 実験の包括的な実用的な簡単なステップバイ ステップ プロトコルを提供するためにでした。ここでは、黄色蛍光タンパク質-p62 (YFP p62)、細胞を LPS、および prebleach、postbleach FRAP の画像とデータ解析を収集するためのステップバイ ステップのメソッドを公開することによってアリスの誘導の RAW264.7 マクロファージ トランスフェクションについて述べる。最後に、我々 は FRAP 実験を行う際の重要な要因をについて説明します。

3-5 h12RAW264.7 細胞の lps の ALIS の p62 の可動性を調べる FRAP を用いた典型的な実験の結果は、ここに示します。図 3Aは、漂白剤から得られる生データを制御して背景画像のスタックは、少量を補正するため配置されたいた後の投資収益率を示しています (&lt; 〜 3 μ m)、アリスの画像ドリフトの。図 3Eと補足のビデオ 1に prebleach と postbleach でこのアリスに YFP p62 蛍光を示します。図 3Bは、バック グラウンド補正後、これらのデータを示しています。図 3Cは、投資収益率のコントロールで蛍光を補正した後これらのデータを示しています。図 3Dは、漂白剤の投資収益率の 5 prebleach 値の平均蛍光に正規化されたこれらのデータを示しています。漂白の度合いはこの実験で十分だった (深さをブリーチ 91.94 を =)。このアリス内 p62 YFP の蛍光回復ゆっくりと、t1/2 = 128.27 s (2.14 分)。YFP p62 ではなかったこの実験では、非常に携帯電話の蛋白質として Mf = 21.97 とf = 78.03。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig1.jpg"> 図 1: RAW264.7 細胞と FRAP 画像は、アリスの画像ドリフトを補正するため配置されている後の画像解析の手順の図。(A) いくつかのアリスと漂白剤、制御、および買収 ROI 内背景・ ロワを描いた RAW264.7 細胞の図。(B) 生 FRAP の理想的にされた描写データは、漂白剤、コントロール パネル (C) A の背景・ ロワ背景修正されている生の FRAP データの理想化されたグラフを取得しました。(D) 制御 ROI で蛍光正規化されているバック グラウンド補正の FRAP データの理想化されたグラフ。Prebleach 蛍光漂白剤 ROI に正規化されている正規化と背景修正の FRAP のデータのグラフを (E) 理想的。略語: Con = 制御;BG バック グラウンドを =。この図は、Rabut、Ellenberg4から変更されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig2.jpg"> 図 2:レーザー選択目的ソフトウェア (材料表) のユーザー インターフェイスの画像ビーム パスの構成と FRAP 実験の画像集録パラメーター 。(A) レーザー アルゴン/2 レーザー ライン、出力、および使用される管電流を示す画面を制御します。(B) 構成制御ビームを示す画面分割と発光フィルター使用の設定。(C) スキャンは、画像の取得に使用される設定を表示する画面を制御します。(D) スキャンは、ピンホール、検出器ゲイン、増幅器のオフセット、アンプのゲイン、およびアルゴン/2 514 nm レーザー回線の転送の設定を表示する画面を制御します。(E) 時系列制御使用時間シリーズの設定を表示する画面。(F) 漂白剤、prebleach を示す画面を制御し、使用するパラメーターを postbleach します。略語: HFT = ハウプト ファーブ Teiler (プライマリ ダイクロイック ビーム分割);NT1 = Neben ファーブ Teiler 1 (最初二次二色性ビームスプリッター);NT2 = Neben ファーブ Teiler 2 (ダイクロイックばり第 2 分割);EF = 排出フィルター。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig3.jpg"> 図 3: RAW264.7 細胞でアリスに YFP p62 の動態を勉強する代表的な FRAP 実験。漂白剤、制御、および投資収益率の背景の (A) 生蛍光強度データです。(B) 漂白剤とコントロール投資収益率 ROI の背景の蛍光性のため修正されていた後、パネル A で与えられたデータ。(C) 蛍光バック グラウンド補正コントロールの投資収益率のための口座に投資収益率漂白剤に蛍光強度の正規化後パネル A と B で与えられたデータ。(D) ブリーチ ROI の最初 5 prebleach 値の平均を正規化し、背景修正ブリーチ ROI の蛍光強度の正規化後パネル A ~ C で与えられたデータ。Mf = 21.97、私f 78.03、t1/2 = = 128.27 s (2.14 分) と漂白剤深さ = 91.94。(E) prebleach (1.5 分) と postbleach でアリスのイメージ (0、6、および 16 分)。スケール バー = 5 μ m とすべてのパネルです。略語: Con = 制御;BG = 背景;コアー = 訂正。規範。= 正規化されます。平均平均を =。この図はカベら12から変更された<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Supplementary Video 1" src="/files/ftp_upload/59288/59288supvideo1.jpg"> 補助ビデオ 1: RAW264.7 マクロファージ前に、と退色後の典型的な ALIS 。P62 YFP の蛍光は photobleach; 後の回復に時間がかかるしたがって、p62 は非常に携帯電話のタンパク質ではありません。この実験は、Mf = 25.62、私f 74.38、t1/2 = = 442.79 s (7.38 分) と漂白剤の深さ = 90.19。スケール バー 5 μ m を =。このビデオから修正されたカベら12<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/Fig_4-Vid_FINAL.avi" target="_blank">してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)</a>

退色実験細胞のライブ後の蛍光回復のための包括的かつ実用的なプロトコルについて述べる。プロトコル aggresome のような誘導構造の黄色蛍光タンパク質タグ p62 のモビリティの測定に使用しているが、各種顕微鏡システム、蛍光蛋白質に適用できます。

Aggresome のような誘発構造で退色の黄色蛍光タンパク質タグ p62 後の蛍光回復

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

光漂白後の既存の蛍光回復は、FRAPプロトコルは不完全か過度に複雑です。このビデオで紹介するプロトコルは、包括的で実用的でわかりやすいという点で重要です。このFRAP技術の主な利点は、生細胞内および細胞内の細胞内の区画間のタンパク質移動度の定量化を可能にすることです。FRAPは、治療と診断の両方の目的で研究されています。そのような使用の1つは、生体内の異なる組織における薬物送達システム内の拡散を定量化することです。この情報は、薬物の構造と組成を最適化するために使用することができます。FRAP顕微鏡技術は、拡散現象の理解が関心のある幅広い分野での洞察を提供してきました。これらには、細胞生物学、分子生物学、発生生物学、神経科学、材料科学、先端バイオマテリアル、創薬などがあります。記載されているプロトコルは哺乳類細胞と共に使用されるが、その概念は植物細胞、酵母細胞、細菌などの他のシステムに適用することができる。この手法を実行したことがない個人は、最適な画像取得パラメータを決定し、実験に適した対象の取得領域を作成し、回復のモバイルフラクションとハーフタイムを計算するのに苦労する可能性があります。この手順を初めて試す際には、実験の目的に合わせてプロトコルを最適化するために、いくつかの試験実験を行ってください。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の技術者であるマリーン・ケイブと、イメージング施設の中核的なマネージャーであるデビッド・ラデマッハーです。まず、YFP-p62トランスフェクションRAW264.7マクロファージのプレートを調製し、付随するテキストプロトコルに記載されているようにリポ多糖で処理します。次に、処理した細胞を氷冷タイロードのバッファーで1回リンスします。その後、ノコダゾールを添加したタイローデのバッファーを2ミリリットルプレートに加え、FRAPイメージングおよび分析の前にプレートを摂氏4度で15〜20分間インキュベートします。FRAPのイメージングと分析の前に、プレートを摂氏4度で15〜20分間インキュベートします。イメージング設定では、蛍光マーカーが512ナノメートルでピーク励起し、527ナノメートルでピークエミッションを有するので、アルゴン/2レーザーの514ナノメートルラインを選択します。次に、レーザーコントロールウィンドウで、Argon/2、458、477、488、514をクリックし、スタンバイボタンをクリックします。レーザーがウォームアップするまで約 3 分待った後、[オン] ボタンをクリックします。次に、レーザーのレーザーパワーを100%に設定し、Enterキーを押します。次に、レーザーラインの透過を5%に設定し、プラン・アポクロマート63倍倍率1.40数値開口油目的にします。顕微鏡接眼を通して標本を見て、視野の中心にアグレソームのような誘導構造を置く。次に、取得ソフトウェアで、フレームサイズを512 x 512ピクセル、スキャン速度を8ピクセル、データ深度を12ビットに設定します。また、スキャン平均を 1 に設定し、光学ズームを 3 に設定して、Enter キーを押します。次に、ピンホールを1.95エラーユニットに、検出器ゲインを582にして、飽和度をわずかに下回ります。サイズが 150 x 150 ピクセルの画像取得に対象となる四角形の領域を作成します。対象地域を 30 秒に 1 回、35 回スキャンできるように時系列を設定します。次いで、スキャン番号5の後に光漂白が起こるように漂白制御を設定し、対象領域の5つのプレブリーチ画像を収集する。Enter キーを押して確定します。次に、[ブリーチ領域]ウィンドウに移動し、アグリソーム状の誘導構造領域内に目的の円形の漂白領域を作成します。次に、反復回数を 300 に設定し、Enter キーを押します。次に、レーザーラインを100%の電力に設定し、レーザーの透過率フィールドに100と入力し、Enterキーを押します。最後に、画像取得プログラムを実行して、ドリフトの約3ミクロン未満の10個の細胞内の10個のアグレソーム状誘導構造からFRAPデータを収集する。データ分析を開始するには、まず、データ分析のために、AIM lsm ファイルをパーソナル・コンピューターに転送します。各 AIM lsm ファイルを画像処理プログラムで開くことで、対象となる取得領域の時系列画像のスタックを整列または一致させることにより、画像ドリフトを補正します。次に、[プラグイン]、[登録]、[StackReg]、[翻訳] の順に選択し、[プラグイン]、[登録]、[StackReg]、[リジッド ボディ] の順に選択します。次に、関心のあるブリーチ領域のシグナル強度を測定するために、関心のある領域マネージャを設定します。この場合は、楕円形ツールを選択し、直径 10 ピクセルの対象となるブリーチ領域に円を描き、[追加] ボタンをクリックします。追加したら、対象の制御領域の信号強度を測定するプログラムを設定します。長方形ツールを選択し、コントロール領域に 20 x 20 ピクセルの正方形を描画し、[追加] ボタンをクリックします。最後に、関心のあるバックグラウンド領域のシグナル強度を測定するために、関心のある領域マネージャを設定します。四角形ツールを選択し、背景領域に 20 x 20 ピクセルの正方形を描画し、[追加] ボタンをクリックします。ROI マネージャで分析する領域を追加した後、それに応じて[ブリーチ ROI]、[コントロール ROI]、[バックグラウンド ROI]の名前を変更します。各領域の信号強度を測定します。これを行うには、[ブリーチ ROI]、[コントロール ROI]、[バックグラウンド ROI] の順に選択し、[その他] に移動して、[マルチ メジャー] を選択します。結果を、それぞれ [ブリーチ ROI]、[コントロール ROI]、および [背景 ROI] というラベルの列に貼り付けます。まず、Bleach ROI とコントロール ROI のラベルが付いた列の値から[背景 ROI]という列の値を減算し、コントロール ROI というラベルの列から、コントロール ROI というラベルの列から値を減算することで、Bleach ROI とコントロール ROI の信号強度をバックグラウンドで補正します。これらの新しい列にラベルを付け、漂白剤ROIと補正されたコントロールROIを修正しました。次に、Bleach ROI の信号をコントロール ROI のバックグラウンド補正信号に正規化します。[補正された漂白剤 ROI] というラベルの列の値を、修正されたコントロール ROI というラベルの列の値で割ります。この新しい列に、正規化補正ブリーチ ROI というラベルを付けます。次に、正規化補正ブリーチ ROI カラムのシグナルを、Bleach ROI の 5 つのプレブリーチ値の平均に正規化します。[正規化補正ブリーチ ROI] というラベルの列の値を、Bleach ROI の 5 つのプレブリーチ値の平均で割ります。この新しい列にラベルを付け、正規化補正済みプレブリーチ平均漂白剤ROI。最後に、画像処理用のプログラムを開きます。曲線は、正規化された、補正された漂白剤 ROI データに適合し、正規化された後の正規化された漂白剤 ROI 値とそれに対応する時間値をコピーします。カーブ フィッター ウィンドウに貼り付け、[カーブ フィッター] ドロップダウン メニューから指数関数的な回復を選択し、[フィット] を選択します。ここに示されているのが、LPSで処理されたRAW264.7細胞の光漂白後の蛍光回復の典型的なビデオである。凝集体様誘導構造領域内の蛍光回復は、遅い。この実験では、p62の移動度を調べるためにフォトブリーチを使用します。凝集様誘導構造におけるp62蛍光、プレブリーチおよびポストブリュチが、ここに示されている。このビデオで説明したように、蛍光強度は時間の経過とともに追跡することができます。バックグラウンドでの補正と正規化の後、p62蛍光は、移動率を78%として22%非移動分率と表現し、アグレソーム状誘導構造内の回復のハーフタイムを2.14分として記述するために計算することができる。関心のある ALIS、対象の制御領域、および関心のある背景領域を含む、対象の取得領域を適切に定義することが特に重要です。この手順に従って、他の定量的蛍光顕微鏡法、例えば、光漂白、FLIP、および選択的光漂白における蛍光損失を適用することができる。FLIPは細胞内区画間の連続性と通信の程度を測定するのに対し、選択的光漂白は、オルガネラへのタンパク質の能動的および受動的輸送、またはタンパク質が豊富な領域間の移動情報を提供する。FRAPは、細胞膜中のタンパク質の横運動を定量化するために開発されました。その後、細胞内および細胞内の様々な区画間のタンパク質移動度を定量化し、細胞生物学、発生生物学、神経科学、材料科学、高度な生体材料、創薬など、さまざまな分野で質問に答える道を開きました。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

FRAPは、緑色蛍光タンパク質（GFP）タグ付き培養細胞中のタンパク質の移動度を定量化するために使用されています。我々は、光退色後蛍光回復の割合を分析することにより、GFPのモバイル/不動の分画を検討した。本研究では、FRAPは、海馬ニューロンのスパインで行われました。...

培養海馬ニューロンの樹状突起棘の蛍光タグ融合タンパク質の光退色後蛍光回復（FRAP）

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遺伝子組み換えショウジョウバエの脳におけるタンパク質凝集体のイメージングと定量

この資料は、調査するホタルルシフェラーゼ-GFP融合タンパク質の使用を記載...

のリフォールディング監視タンパク質を結合アッセイ<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

このレポートは、ウェスタンブロットまたは蛍光ベースのアッセイによって、誤って折り畳まれたタンパク質の分解速度を測定するためのプロトコルを説明しています。この方法は、他のミスフォールドタンパク質の分析やハイスループットスクリーニングに適用できます。...

細胞におけるミスフォールドタンパク質の分解のためのアッセイ

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マイクロマニピュレーション技術形成ダイナミクスの解析と細胞骨格のレギュレータの売り上げ高

この資料では、蛍光タンパク質凝集の効果と蛍光レポーターのコンテキストで新しく,...

酵母におけるポリグルタミン毒性の試金を使用して融合パートナーの蛍光タンパク質の効果

蛍光寿命イメージングは、生きている、老化、およびストレスを受けたC.エレガンス病モデルにおけるタンパク質の凝集傾向を監視し、定量化し、区別する。...

蛍光生涯イメージングを用いたエージングC.エレガンスにおけるアミロイド構造の特徴

ここでは、蛍光相関分光法を用いて、細胞ライセートおよび生細胞におけるタンパク質オリゴマーおよび凝集を測定する手順を紹介する。...

蛍光相関分光法を用いたタンパク質凝集の検出

シナプス伝達に必要な細胞内事象を視覚化するために、2つの関連する方法が記載されている。これらのプロトコルは、 in vitro...

筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

古典的な部位特異的突然変異誘発の限界を克服するために、特定の修飾を有するプロリン類似体をいくつかの蛍光タンパク質に組み込んだ。我々は、水素をフッ素で置換するか、またはプロリン残基中の二重結合による単置換(「分子手術」)が、その折り畳みおよび光との相互作用を含む基本的なタンパク質特性にどのように影響するかを示す。...

蛍光タンパク質中のプロリン類似体によるプロリンの残基特異的交換:骨格の「分子手術」が折り畳みと安定性にどのように影響するか

学ぶ蛍光回復後光漂白法（FRAP）を用いた生細胞内タンパク質動態の定量解析。マウスマクロファージRAW264.7細胞でYFP-p62タグ付き凝集体構造の可動性を評価し、細胞生物学・創薬研究に応用可能な実用的プロトコルを提供する。

Aggresome のような誘発構造で退色の黄色蛍光タンパク質タグ p62 後の蛍光回復

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