Name: 免疫ペルオキシダーゼおよび免疫蛍光法を用いて成体ゼブラフィッシュにおけるオレキシンおよびエンドカンナビノイド受容体の同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学ぶ 免疫ペルオキシダーゼ法と免疫蛍光法を用いて、成体ゼブラフィッシュにおけるオレキシンおよびエンドカンナビノイド受容体の局在と発現を解析する方法。肥満モデルでの分子変化を可視化し、進化的保存性の研究に活用できます。

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この研究は、サンニオ大学フォンディ・リサーカ・ディ・アテネオ(FRA)2015-2016によって支援されました。

著者は利益相反を宣言しない。

サンプル調製
サンプル調製は、IHCの最初の重要なステップです。信頼性の高いプロトコルは、細胞形態、組織構造、および抗原性の維持を可能にします。このステップでは、正しい組織収集、固定、および断面22、23が必要です。固定の目的は、組織を保存し、組織酵素や微生物の作用を減らすことです。特に、固定工程は、細胞成分および生体分子を保存し、細胞成分(抗原や酵素など)の自己分解およびシフトを防止し、以下の手順の回避効果に対して細胞材料を安定化させ、免疫染色4、7、24を容易にする。
断面化の前に、組織は、パラフィン埋め込み(免疫ペルオキシダーゼ法)または凍結保存(クライオメディアで凍結、複...

免疫組織化学(IHC)は、抗原抗体相互作用1、2によって細胞または組織成分(抗原)を同定するために使用される確立された古典的な技術である。組織内の標的生体分子の局在化および分布を同定するために使用することができる。IHCは、組織セクション3の抗原を検出するために免疫学的および化学的反応を使用しています。抗原抗体相互作用の可視化に使用される主なマーカーには、蛍光色素(免疫蛍光)および酵素基質色反応(免疫ペルオキシダーゼ)が含まれ、いずれも抗体4に共役する。顕微鏡観察を用いて、組織内の標的抗原の局在化にほぼ対応する標識組織の局在を決定することができる。
タンパク質を検出するための蛍光または発色反応には、特定の一次抗体が直接標識される直接検出方法の2つの方法があります。二次抗体が標識5、6、7を運ぶ間、一次抗体が結合されない間接検出方法。間接法には、主に信号増幅であるいくつかの利点があります。また、他の分子および細胞技術とは異なり、免疫蛍光を伴い、細胞および組織7内で分化して発現する2つ以上のタンパク質の分布、局在、および共発現を可視化することができる。使用される検出方法の選択は、実験の詳細に依存します。
現在までに、IHCは、バイオマーカーの分布と局在化を理解し、ヒトから無脊椎動物への生体組織における異なるタンパク質の一般的なプロファイリングを理解するための強力かつ不可欠なツールとして、基礎研究に広く使用されています8、9,10歳,11.この技術は、多数の正常および変化した動物器官および異なる組織型におけるタンパク質発現の地図を表示するのに役立ち、生理学的および病理学的変化によって誘発される発現のダウンまたはアップレギュレーションの可能性を示す。IHCは、最適な結果を得るために正確さと方法の正しい選択を必要とする高感度技術です 12.まず第一に、固定、交差反応性、抗原検索、および抗体の感受性などの多くの異なる因子は、偽陽性および偽陰性シグナル13を引き起こす可能性がある。抗体の選択は、IHCにおける最も重要なステップの1つであり、抗原特異性および調査中のタンパク質および種との親和性に依存する7.
最近では、成体ゼブラフィッシュ組織のオレキシン/ヒポクレチンおよびエンドカンナビノイド系のメンバーを検出するためにIHC技術を最適化しました。我々は主に固定、2つの異なるアプローチを使用して組織埋め込み、断面および取り付け(顕微鏡分析中の解像度および詳細に影響を与える可能性がある)、およびブロッキング(偽陽性を防止し、背景を減らすために)14に焦点を当てている。他の重要な特徴は、個々のIHCプロトコルの抗体特異性および選択性および再現性である。抗体特異性を提供する鍵は、負のコントロール(標的タンパク質を発現しないことが知られている一次抗体または組織を含まない)と陽性コントロール(標的タンパク質を発現することが知られている組織を含む)の使用である15.IHCのための抗体の選択は、その種特異性(それらが目的の抗原と反応する可能性)および4、5、6を使用される抗原抗体結合検出システムに基づいて行われる。 、7.免疫ペルオキシダーゼの場合、反応の色は沈殿染色体の選択によって決定され、通常ジアミノベンジジン(褐色)16。一方、i mmuno蛍光は、蛍光結合抗体を利用して凍結組織切片におけるタンパク質発現を可視化し、発色検出システムに関して複数のタンパク質を容易に解析することができます。5,7.
免疫ペルオキシダーゼ技術では、二次抗体をビオチンに結合させ、発色レポーター分子[アビジンビオチン複合体(ABC)]をリクルートすることができるリンカー分子であり、染色シグナルの増幅につながる。ABCレポーター法では、酵素ペルオキシダーゼが3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)と反応し、酵素が二次抗体に結合する強烈な茶色の染色を生み出し、通常の光顕微鏡で分析することができます。ABC染色は、ビオチンに対するアビジンの親和性が高いため、一次抗体反応性の部位に付着した二次抗体がほとんどなく、迅速かつ最適な反応を生み出す。この発色検出方法は、シグナルの密度分析を可能にし、タンパク質発現レベル18との褐色シグナルレベルの相関に基づく半定量的データを提供する。
免疫蛍光技術では、異なるフルオロクロムが独特の波長で発光する能力により、複数のタンパク質の同時検出が可能ですが、スペクトルの重複を最小限に抑えるために、蛍光色素を慎重に選択することが重要です。5.さらに、異なる宿主種における一次抗体の使用は、交差反応性に関する困難を最小限に抑える。この場合、種特異的二次抗体は1種類の一次抗体のみを認識する。蛍光レポーターは、Alexa Fluor染料などの市販の誘導体を含む小さな有機分子です。
多くの動物モデルは、特定の生理学的および病理学的状態を理解するために使用される。今日まで、多くの代謝経路が進化の過程で保存されていることが確立されています。したがって、ゼブラフィッシュなどのモデル生物におけるIHC研究は、病理学的および非病理学的状態の起源および維持に関する洞察を提供することができる17.この報告書は、成虫ゼブラフィッシュ組織に対して行うことができ、周辺および中央レベルでのOXA、OX-2R、およびCB1Rの分布および局在化の詳細な画像を得るために使用されるIHCプロトコルを示すことを目的とする。また、成ゼブラフィッシュの末梢および中央組織における2つの主要なIHC間接法の適用のためのプロトコルも報告されている。記載されている間接法は、二次抗体が蛍光色素(免疫蛍光法)または酵素レポーター(免疫ペルオキシダーゼ法)に結合した場合のシグナル増幅を可能にする。発色性および蛍光検出方法の両方に長所と短所があります。このプロトコルで報告されているのは、IHCの使用、主に免疫蛍光、成体ゼブラフィッシュにおいて、異なる生理学的および病理学的条件にわたって進化的に保存されるシステムを研究するために広く使用される動物モデルである。

<table><tbody><tr><td>アンチCB1</td><td>アブカム</td><td>ab23703</td><td></td></tr><tr><td>アンチOX-2R</td><td>サンタクルーズ</td><td>sc-8074</td><td></td></tr><tr><td>アンチオキサ</td><td>サンタクルーズ</td><td>sc8070</td><td></td></tr><tr><td>アクアテックス</td><td>メルク</td><td>1,085,620,050</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化ウサギ 抗ヤギ</td><td>ベクターラボ</td><td>BA-5000</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>ニコン エクリプス Ti2</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカバイオシステム</td><td>CM3050S</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>32670</td><td></td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td>ライカバイオシステム</td><td>DFC320</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡用デジタルカメラ</td><td>ニコン</td><td>DS-Qi2</td><td></td></tr><tr><td>ロバ アンチヤギ アレクサ 蛍光 488-共役二次抗体</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>ロバ抗ヤギ アレクサフルーア 594標識二次抗体</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A11058</td><td></td></tr><tr><td>ロバ抗ウサギ アレクサフルーア 488標識二次抗体</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>ロバ抗ウサギ アレクサフルーア594標識二次抗体</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーA21207</td><td></td></tr>エ<tr><td>タノール絶対</td><td>VWR</td><td>20,821,330</td><td></td></tr><tr><td>凍結切片化合物</td><td>ライカバイオシステム</td><td>FSC 22 凍結切片 メディア</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>31642</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>20,252,290</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB</td><td>ベクターラボ</td><td>SK4105</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ライカバイオシステム</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>ミクロトーム</td><td>ライカ バイオシステム</td><td>RM2125RT</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>ノーマル ロバ血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>ノーマル ウサギ セラム</td><td>ベクターラボ</td><td>S-5000</td><td></td></tr><tr><td>パラフィンワックス</td><td>カルロエルバ</td><td>46793801</td><td></td></tr><tr><td>パラphormaldeydeシ</td><td>グマアルドリッチ</td><td>P6148</td><td></td></tr>ク<tr><td>エン酸ナトリウム二水和物</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>フルーカ分析</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>トリズマ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>ベクタステインエリートABCキット</td><td>ベクターラボ</td><td>PK6100</td><td></td></tr><tr><td>キシレンピュア</td><td>カルロエルバ</td><td>392603</td><td></td></tr></tbody></table>

免疫ペルオキシダーゼおよび免疫蛍光法を用いて成体ゼブラフィッシュにおけるオレキシンおよびエンドカンナビノイド受容体の同定

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

免疫組織化学(IHC)は、標識抗体を持つ組織切片における標的抗原の検出に関与する高感度かつ特異的な技術である。これは、最適な特定の信号を得るために各ステップの最適化が重要であるマルチステッププロセスです。IHCを通じて、特定のバイオマーカーの分布と局在化を検出し、進化的保全に関する情報を明らかにすることができます。さらに、IHCは肥満などの病理学的状態におけるバイオマーカーの発現および分布変化を理解することを可能にする。IHCは、主に免疫蛍光技術を用いて、成体ゼブラフィッシュで系統的に保存された分子の組織と分布を検出するために使用できますが、標準的なIHCプロトコルは絶え間ない。オレキシンとエンドカンナビノイドは、食物摂取と肥満病理の制御に関与する2つの高度に保存されたシステムです。ここで報告されるプロトコルは、オレキシンペプチド(OXA)、オレキシン受容体(OX-2R)、およびカンナビノイド受容体(CB1R)の正常および食事誘発肥満(DIO)成人ゼブラフィッシュモデルの腸および脳における局在および分布に関する情報を得るために使用されるプロトコルである。また、免疫ペルオキシダーゼおよび二重免疫蛍光、試薬の調製、固定、パラフィン埋め込み、ゼブラフィッシュ組織の凍結保護および内因性活性遮断工程および背景の調製方法についても説明する。カウンターステイン。パラメータの完全なセットは、以前のIHC実験から得られ、免疫蛍光が成人ゼブラフィッシュにおけるOX、OX-2R、CB1R分布、局在化、発現の保全の理解にどのように役立するかを示しました。組織。得られた画像は、非常に特異的なシグナル強度を有する画像で、ゼブラフィッシュが特定バイオマーカーの分布、局在化、進化的保存の免疫組織化学的研究に適した動物モデルであることを確認した。生理学的および病理学的状態。ここで提示されるプロトコルは、成ゼブラフィッシュにおけるIHC実験に推奨されます。

免疫ペルオキシダーゼ染色の代表的なデータを図1および図2に示す。成体ゼブラフィッシュの腸内におけるOX-AおよびOX-2R分布の免疫組織化学的分析は、OX-AおよびOX-2Rの異なる局在部位およびDIOゼブラフィッシュの腸細胞における発現の増加を示した。前腸および前腸の細胞においてOX-Aに対する強烈な褐色染色が認められた(図1A,A1)。OX-Aの免疫発現は、異なる腸内腸内で明確なシグナルを発し、前部から中間腸に向かって減少した(図1B、B1)。負の対照は、背景の基準として使用され、OX-A信号の特異性を確認した(図1E)。染色体DABへの長期暴露は、背景強度の増加をもたらした(図1D)。DIOおよびコントロール食ゼブラフィッシュの腸にお...

ここでは、オレキシンペプチド、オレキシン受容体、および正常および食事誘発肥満(DIO)成人ゼブラフィッシュモデルの腸および脳における内因性カンナビノイド受容体の免疫組織化学的特徴付けおよび局在化のためのプロトコルを示す。免疫ペリキシダーゼおよび二重免疫蛍光法。

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

現在、免疫組織化学は、特定の分子マーカーの存在および病理の場合の変化を特定するために頻度を増加させるとともに使用され、定量的分析を行う可能性に根を下ろしています。免疫体化学は、主に免疫蛍光技術が幼虫および成体ゼブラフィッシュ動物モデルに使用されるが、ゼブラフィッシュの良い標準免疫体化学プロトコルについてはほとんど知られていない。ここでは、成体ゼブラフィッシュの重要なタンパク質の進化的保存を研究するために使用できるプロトコルを説明し、説明する。成体ゼブラフィッシュの免疫組織化学のための良いプロトコルは、高度に保存された生体分子の形態学的発現および分布を研究するために、この動物モデルの有用性の根源となる可能性がある。この方法はまた、ヒト生理病理学と相関する病理学的状態によるこれらの生体分子の変化の可能性を分析するのに役立つ。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士課程の学生であるリー・チュニシ博士です。この手順を開始するには、調製した凍結組織ブロックをマイナス20°Cのクライオスタットに移します。10マイクロメートルのコロナまたは矢状のセクションでブロックをカットします。次に、免疫組織化学に適した接着ガラススライドに代替シリアルセクションの組織を収集し、進む準備ができるまでマイナス20°Cで保管します。まず、溶剤耐性ペンを使用して、スライド上の組織領域を区切ります。0.1モルリン酸緩衝液を使用して、各5分間に3回ずつセクションをすすいします。次に、トリトンX-100の0.3ミリリットルを0.1モルリン酸緩衝バッファーの100ミリリットルに溶解し、0.3%トリトンX-100を含むリン酸緩衝液中に0.1%正常ロバ血清を溶解してブロッキング溶液を調製する。透過性バッファーPB-Triton X-100 0.3%に溶解した正常ロバ血清の溶液を用いて切片を室温で30分間インキュベートし、細胞膜を透過させ、非特異的結合部位を遮断する。まず、0.1モルリン酸緩衝液で各5分間、セクションを3回リンスします。PB-Tで希釈した一次抗体の混合物を加え、室温で湿気の多い箱に一晩切片をインキュベートする。翌日、0.1モルリン酸緩衝液でそれぞれ5分間、セクションを3回リンスします。PB-Tで希釈した二次抗体の適切な混合物で2時間室温で切片をインキュベートする。まず、セクションを3回5分間に3回リンスし、それぞれ0.1モルリン酸緩衝液を使用します。1.5マイクロリットルのDAPIを3ミリリットルのリン酸バッファーに溶解し、核染料DAPIを調製します。染料のセクションに対抗します。次に、取り付け媒体を使用してスライドをカバースリップし、組織を安定させ、長期間使用するために汚れをする。蛍光サンプルは摂氏4度で暗闇の中に貯蔵することができる。免疫蛍光プロトコルを繰り返し、一次または二次抗体を省略するか、一次または二次抗血清をリン酸緩衝液に置換して陰性対照を調製する。次に、免疫蛍光プロトコルを繰り返し、各一次抗体を過剰の相対ペプチドで事前吸収する。マウス脳のスライスに免疫蛍光プロトコルを繰り返し、陽性制御を準備します。X-Y-Zモーター化ステージを搭載した共焦点顕微鏡、デジタルカメラ、取得・解析ソフトウェアを用いて、免疫染色部を観察・解析します。5倍、20倍、40倍の目標を持つデジタル画像を取得します。各チャンネルで各セクションの画像を低倍率で撮影し、低倍率のモンタージュを構成します。蛍光画像を最大コントラストとオーバーレイに正規化します。関心のある領域全体で、1〜1.8マイクロメートルの焦点ステップを持つ6つの焦点面を通して画像のシリアルZスタックを収集します。このコレクションは、チャネルごとに個別に実行します。その後、イメージデコンボルケーションソフトウェアを使用して、10回の反復を適用して画像をデコンし、シリアルZプレーン画像を単一の最大投影画像に集約します。適切な画像編集ソフトウェアを使用して、光とコントラストのマイクログラフを調整します。成人ゼブラフィッシュの腸内におけるOX-AおよびOX-2R分布の免疫学的分析は、OX-AおよびOX-2Rの異なる局在部位およびDIOゼブラフィッシュの腸内細胞における発現の増加を示す。OX-Aの強烈な褐色染色は、内側および前腸の細胞で観察される。OX-Aの免疫発現は、異なる腸内の明確なシグナルを与え、前部から内側腸に向かって減少する。同様の結果は、DIOおよびコントロール食ゼブラフィッシュの腸内のOX-2R免疫発現について観察される。DIO成体ゼブラフィッシュにおけるOX-Aシグナルの増加は、他の腸内のOX-2Rの過剰発現を伴う。免疫蛍光画像の正確な分析は、対照食ゼブラフィッシュと比較して、DIO成体ゼブラフィッシュの腸内でのOX-2R/CB1R共局在の増加を示しています。同様の状況は、例えば、後頭脳、視床下部、視状骨、トーラス・ラテラリス、および下葉のびまん核のような異なる脳領域で観察される。オレキシンAとCB1Rの共局在化を伴う二重免疫染色により、視床下部のオレキシンニューロンにおける共局在化の増加が見られ、オレキシンA蛍光シグナルの増加を伴う。これらの結果は、二重免疫蛍光が、生理学的に保存されたタンパク質発現、標的タンパク質の共局在化、およびそれらの分布および/または異なる病理学的状態における発現変化を同定するのにどのように役立つかを示している。免疫蛍光を用いれば、生体分子の共分布と共発現、相互作用の可能性をよりよく理解することができ、異なる病理の場合の変化の目に見えるイメージを持つことができます。さらに、代謝酵素発現または受容体の神経解剖学的分布は、組織内のタンパク質シグナル伝達の役割をさらに明らかにすることができる。本技術研究では、成人ゼブラフィッシュモデルを用いて、2つの高度に保存されたシステムであるオレキシンとエンドカンナビノイドを研究するための免疫蛍光アプローチを導入した。ここで説明したこのプロトコルを使用して、成体ゼブラフィッシュの脳で初めて、オレキシン-2受容体の解剖学的分布と共発現とエンドカンナビノイド-CB1受容体は決定されていない。我々は、免疫組織化学実験のために、そしてそれらの機能をよりよく理解するために、成体ゼブラフィッシュのペプチドの空間分布および受容体の組織化を検出するためにここに記載されているプロトコルを推奨する。

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Biochemistry

生物化学

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