Name: 哺乳類細胞における微小コッカルヌクレアーゼを用いてクロマチン免疫沈殿アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 学ぶ 微小コッカルヌクレアーゼを用いたChIPアッセイで、哺乳類細胞におけるタンパク質-DNA相互作用と遺伝子発現調節メカニズムを解明する方法。この再現性の高いプロトコルは、クロマチン生物学研究に有用です。

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この研究は、ジェネンテックのホープ市へのロイヤリティによって支えられている。この研究は、国立衛生研究所の全部または一部をサポートしていません。

<ol><li>Nikolov, D. B., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II+transcription+initiation%3A+a+structural+view%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II transcription initiation: a structural view.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).</li>
<li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+covalent+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li>
<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nature protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).</li>
<li>Jackson, V., Chalkley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+whole-cell+fixation+to+visualize+replicating+and+maturing+simian+virus+40%3A+identification+of+new+viral+gene+product%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Use of whole-cell fixation to visualize replicating and maturing simian virus 40: identification of new viral gene product.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (10), 6081-6085 (1981).</li>
<li>Jackson, V., Chalkley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+isolation+of+replicative+chromatin%3A+selective+deposition+of+histone+on+both+new+and+old+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A new method for the isolation of replicative chromatin: selective deposition of histone on both new and old DNA.</a> Cell. 23 (1), 121-134 (1981).</li>
<li>Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+state+of+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The current state of chromatin immunoprecipitation.</a> Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).</li>
<li>Ausubel, R. B., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Short+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of Genomic DNA.</a> Short Protocols in Molecular Biology. , Second Edition, Unit 2.1, 2-4 (1992).</li>
<li>Crouse, J., Amorese, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+Precipitation%3A+Ammonium+Acetate+as+an+Alternative+to+Sodium+Acetate%5BTitle%5D)+AND+%22Focus%22%5BJournal%5D)">Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate.</a> Focus. 9 (2), 3-5 (1987).</li>
<li>Zeugin, J. A., Hartley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+Precipitation+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Focus%22%5BJournal%5D)">Ethanol Precipitation of DNA.</a> Focus. 7 (4), 1-2 (1985).</li>
<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Guenther, M. G., Levine, S. S., Boyer, L. A., Jaenisch, R., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromatin+landmark+and+transcription+initiation+at+most+promoters+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells.</a> Cell. 130 (1), 77-88 (2007).</li>
<li>Louie, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen-induced+recruitment+of+RNA+polymerase+II+to+a+nuclear+receptor-p160+coactivator+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-p160 coactivator complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2226-2230 (2003).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+feedback+loop+mediated+by+protein+phosphatase+1alpha+mobilization+of+P-TEFb+and+basal+CDK1+drives+androgen+receptor+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Positive feedback loop mediated by protein phosphatase 1alpha mobilization of P-TEFb and basal CDK1 drives androgen receptor in prostate cancer.</a> Nucleic Acids Research. 45 (7), 3738-3751 (2017).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+valid+reference+genes+for+mRNA+and+microRNA+normalisation+in+prostate+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines.</a> Scientific reports. 8 (1), 1949(2018).</li>
<li>Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+fast+chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method.</a> Nature. 1 (1), 179-185 (2006).</li>
<li>Gade, P., Kalvakolanu, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay+as+a+tool+for+analyzing+transcription+factor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity.</a> Methods in molecular biology. 809, Clifton, N.J. 85-104 (2012).</li>
<li>Lund, E. G., Duband-Goulet, I., Oldenburg, A., Buendia, B., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+features+of+lamin+A-interacting+chromatin+domains+mapped+by+ChIP-sequencing+from+sonicated+or+micrococcal+nuclease-digested+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Distinct features of lamin A-interacting chromatin domains mapped by ChIP-sequencing from sonicated or micrococcal nuclease-digested chromatin.</a> Nucleus. 6 (1), 30-39 (2015).</li>
<li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+%28microChIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP).</a> Nature protocols. 3 (6), 1032-1045 (2008).</li>
<li>Yamakawa, T., Waer, C., Itakura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AT-rich+interactive+domain+5B+regulates+androgen+receptor+transcription+in+human+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">AT-rich interactive domain 5B regulates androgen receptor transcription in human prostate cancer cells.</a> Prostate. 78 (16), 1238-1247 (2018).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

超音波処理は、断片化したクロマチンを得るために一般的に使用されますが、再現可能な条件を識別するために時間がかかり、面倒です。このプロトコルでは、酵素消化が再現可能な条件を識別しやすくなるので、MNase消化を使用しました。MNase消化後の短い超音波処理ステップ(ステップ2.2を参照)は、細胞膜を破壊し、消化されたクロマチンを放出するために必要であった。したがって、私たちのプロトコルの超音波処理能力は、可能な限り低くする必要があります。私たちは、膜の完全な内訳を得るために、私たちが採用したすべての細胞(図1と表1を参照)に同じ超音波処理条件を使用します。
MNaseによるクロマチンの消化は、我々のプロトコルの重要なステップであり、したがって、我々は細胞内のクロマチンの消化のための条件を最適化するために多大な努力を行っています。消化活性は、酵素および基板(クロマチン)および潜伏時間の量によって決定される。また、細胞間でploidyは異なるため、細胞種ごとにMNase消化に最適な条件を特定する...

哺乳類細胞における遺伝子発現は、緊密かつ動的に調節され、転写は重要なステップの1つである。遺伝子転写は、主に転写因子およびヒストンによって調節される。転写因子は、特定のDNA配列に結合し、遺伝子転写を制御するタンパク質です。これらの因子は、RNAポリメラーゼII(PolII)の募集を促進または阻害するかのいずれかであり、これは、テンプレート1としてゲノムDNAからのmRNA合成を開始する。ヒストンテール残基のアセチル化およびメチル化などのヒストン修飾は、クロマチン構造2を変化させ、遺伝子転写にプラスおよび悪影響を及ぼす。遺伝子発現の変化は細胞の文脈に影響を与えるので、転写が調節される分子機構を調べることが不可欠である。
現在までに、遺伝子転写の調節を調るためのいくつかの方法が利用可能である。電気泳動性シフトアッセイ(EMSA)は、ゲルシフトアッセイとも呼ばれ、タンパク質DNA相互作用3を分析するために使用される。目的の細胞からの核抽出物を放射性同位元素(例えば、32P)標識DNAプローブでインキュベートし、ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動する。その自動ラジオグラムは、DNAタンパク質複合体がゲル中のプローブよりも遅く移行することを示しています。タンパク質に対する抗体の存在下では、DNAタンパク質抗体複合体は、DNAタンパク質複合体よりもゆっくりとゲル中に移行する。この超シフトバンドは、DNAとタンパク質の間の特異的な結合を明らかにする。しかし、EMSAは、細胞のないシステムにおける特定のDNAタンパク質相互作用のみを決定するため、相互作用が生細胞内の転写を制御するかどうかは不明です。一般にルシフェラーゼレポーターアッセイと呼ばれる一過性レポーターアッセイは、細胞における遺伝子発現調節に対処するために開発されました。典型的には、目的の遺伝子の上流ゲノム領域がレポータープラスミドに挿入され、一時的に細胞にトランスフェクトされ、レポーター活性が測定される。様々な欠失変異体により、遺伝子調節を担う領域の同定が可能になります。レポーターアッセイは転写因子を同定し、転写を制御する結合DNA配列を特定するのに有用なツールですが、この方法はレポータープラスミドがクロマチン構造を含んでおらず、「本物」を反映していないという点で大きな欠点があります。転写機械。さらに、ヒストン修正の変更はシステムによって決定できません。
クロマチン免疫沈殿(ChIP)法の開発は、ホルムアルデヒドを用いた「全細胞」固定がクロマチン構造4、5であるというジャクソンとチョークリーの報告に基づいていた。それ以来、多くの関連技術が開発され、6.ChIPアッセイでは、細胞はホルムアルデヒドで固定され、DNAとタンパク質を架け取ります。クロマチンは断片化され、次いで目的の抗体で免疫沈殿する。免疫複合体を洗浄し、DNAを精製します。ゲノムの特定の領域を標的とするプライマーによるPCR増幅は、ゲノムに関心のあるタンパク質の占有率を明らかにする。
ChIPは転写因子や改変ヒストンなどのタンパク質とDNAとの相互作用を識別するための強力なツールですが、この方法は実際にはクロマチン断片化ステップなどのいくつかの困難を伴います。超音波処理は、広くクロマチンを剪断するために使用されています。ただし、再現可能な条件を特定するのは面倒です。微小コッカルヌクレアーゼ(MNase)治療は、クロマチン剪断のための代替方法である。MNaseは、二本鎖、一本鎖、円形および線形DNAおよびRNAを消化するエンドエキゾヌクレアーゼです。クロマチンと酵素の量、温度、インキュベーション時間を含む条件を決定することは比較的容易であり、最適なクロマチン断片化を行う。既存のプロトコルを変更および簡素化し、簡単で再現可能な方法を確立しました。本論文では、哺乳動物細胞におけるMNaseを用いてChIPアッセイのプロトコルを提供する。

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>2 M KCl</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>2x iQ SYBR Green supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1706862</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>50 bp DNA ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3236S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Research ProductInternational</td><td>A20090</td><td></td></tr><tr><td>分岐オクチルフェノキシポリ(エチレンオキシ)エタノール</td><td>ミリポアシグマ</td><td>I8896</td><td>IGEPAL CA-630</td></tr><tr><td>ChIPグレードプロテインG磁気ビーズ</td><td>細胞シグナル技術</td><td>9006S</td><td></td></tr><tr><td>クロマチン免疫沈降(ChIP)希釈バッファー</td><td>ミリポアシグマ</td><td>20-153</td><td>バッファー組成:0.01% SDS、1.1% Triton X-100、1.2 mM EDTA、16.7 mM Tris-HCl、pH 8.1、167 mM NaCl。</td></tr><tr><td>Gel Loading Dye Purple (6x)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0724</td><td>Electropheresis grade</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Millipore Sigma</td><td>G1767</td><td>19-22 mg/mL</td></tr><tr><td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>78445</td><td></td></tr><tr><td>High Salt Immune Complex Wash Buffer</td><td>Millipore Sigma</td><td>20-155</td><td>緩衝液組成:0.1% SDS、1% Triton X-100、2 mM EDTA、20 mM Tris-HCl、pH 8.1、500 mM NaCl。</td></tr><tr><td>Histone H3K4me3 抗体 (pAb)</td><td>Active Motif</td><td>39915</td><td></td></tr><tr><td>LiCl Immune Complex Wash Buffer</td><td>Millipore Sigma</td><td>20-156</td><td>緩衝液組成:0.25 M LiCl、1% IGEPAL CA630、1% デオキシコール酸 (ナトリウム塩)、1 mM EDTA、10 mM Tris、pH 8.1。</td></tr><tr><td>低塩免疫複合体洗浄バッファー</td><td>ミリポアシグマ</td><td>20-154</td><td>バッファー組成:0.1% SDS、1% Triton X-100、2 mM EDTA、20 mM Tris-HCl、pH 8.1、150 mM NaCl。</td></tr><tr><td>マグナGrIPラック(8ウェル)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>20-400</td><td>1.5mLチューブと互換性のある磁気分離スタンドであれば、どんな種類でも問題ありません。</td></tr><tr><td>Micrococcal nuclease</td><td>New England Biolabs</td><td>M0247S</td><td>には、10xバッファー(500 mM Tris-HCl、50 mM CaCl2、pH 7.9、25°C;C) および 100x BSA (10 mg/mL)</td></tr><tr><td>NaHCO3</sub</td><td>>JT Baker</td><td>3506-01</td><td></td></tr><tr><td>正常ウサギ IgG</td><td>ミリポアシグマ</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>パイプ</td>ス <td>ミリポアシグマ</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K</td><td>ミリポアシグマ</td><td>3115887001</td><td></td></tr><tr><td>リアルタイム PCR システム</td><td>バイオ・ラッド</td><td>CFX96, C1000</td><td></td></tr><tr><td>RNA pol II CTDリン酸化Ser5抗体</td><td>アクティブモチーフ</td><td>39749</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>ベーリンガー マンハイム</td><td>100155</td><td>エレクトロフェレーシスグレードの</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>ミリポアシグマ</td><td>S5636</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチッププローブを装備したソニケーター</td><td>QSONICA</td><td>Q700</td><td>1.5mLチューブと互換性のあるソニケーターなら何でも大丈夫です。</td></tr><tr><td>UltraPure Phenol:Chloroform:イソアミルアルコール (25:24:1, v/v)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15593031</td><td>pH 8.05</td></tr></tbody></table>

哺乳類細胞における微小コッカルヌクレアーゼを用いてクロマチン免疫沈殿アッセイ

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

生物の細胞表現型を発現させるには、生細胞がそれに応じて遺伝子発現を行い、転写プログラムは遺伝子発現において中心的な役割を果たす。細胞転写機械とそのクロマチン修飾タンパク質は、転写を調節するために調整する。分子レベルで転写調節を分析するために、電気泳動性シフト、一過性レポーターおよびクロマチン免疫沈殿(ChIP)アッセイなどのいくつかの実験方法が利用可能である。この記事では、ヒストン修飾と細胞内のタンパク質とDNAの相互作用を直接示す利点があるため、改変されたChIPアッセイについて詳しく説明します。成功したChIPアッセイの重要なステップの1つは、クロマチン剪断です。超音波処理は、一般的にクロマチンを剪断するために使用されますが、再現可能な条件を識別することは困難です。超音波処理によるクロマチンの剪断の代わりに、微小コッカルヌクレアーゼ(MNase)による酵素消化を利用して、より再現性の高い結果を得ました。この記事では、MNase を使用した簡単な ChIP アッセイ プロトコルを提供します。

クロマチンの消化は、ChIPアッセイの重要なステップの1つです。MNaseを使用してクロマチンを消化し、ヌクレオソームオリゴマーの混合物を得た。MNase消化ステップでは、MNaseは核膜を通過し、クロマチンを消化することができます。しかし、消化されたクロマチンは膜を通過することができず、核中に残ります。消化されたクロマチンを核から放出するには、簡単な超音波処理が必要である。図1Aは、VCaP細胞懸濁液の超音波処理前後のマイクロ写真を示す。超音波処理なしでは、細胞構造はそのまま残り、クロマチンが核内に存在することを示す。簡単な超音波処理は、細胞構造を破壊し、マイクロフォトで細胞をチェックすることは、短い超音波処理条件を決定するのに役立ちます。また、ヒトB細胞急性リンパ芽球性白血病細胞株、REH細胞(図1C)及びヒト前立腺癌細胞株であるLNCaP(図1D)における293T細胞における簡潔な超音波処理の他の例も述べた。</...

クロマチン免疫沈殿(ChIP)は、遺伝子調節の分子機構を理解するための強力なツールです。しかしながら、この方法は、機械的せん断による再現性クロマチン断片化を得ることに困難を伴う。ここでは、酵素消化を用いたChIPアッセイの改良されたプロトコルを提供する。

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

このプロトコルでは、タンパク質とDNAの相互作用を同定し、遺伝子の転写調節を明らかにすることができる。これは、細胞内の分子メカニズムを理解するのに役立ちます.既存のプロトコルを変更し、簡単で明確なアッセイプロトコルを確立します。最初のステップからプロトコルに従うだけで、アッセイが正常に実行されます。クロスリンクされたクロマチンを調製するには、ヒュームフードに、1%VCaP細胞培養培地の4ミリリットルと18.5%PFAの0.229ミリリットルを6センチメートルの皿に加えます。皿をそっと渦巻いてPFAを均等に分配します。室温で正確に10分間インキュベートします。その後、皿に0.47モルグリシン溶液の0.47ミリリットルを加え、さらに架橋を停止するために5分間室温でインキュベートします。原稿に従って細胞を洗浄した後、細胞を掻き取り、細胞懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移します。細胞懸濁液を用いてチューブを3,000倍のgで室温で5分間遠心し、細胞ペレットを回収する。PBSを完全に除去するためにピペットを使用してください。チューブあたりのセル数を記録し、セルペレットをマイナス80°Cで保存します。細胞のリシスを行うために、まず貯めたVCaP細胞ペレットを氷上で解凍する。各チューブにPICを添加した調製されたChIP細胞のリシスバッファーの300マイクロリットルを加え、ペレットを十分に再懸濁します。チューブを15秒間ボルテックスし、氷上で懸濁液を10分間インキュベートする。摂氏4度で3分間9,000倍gの遠心分離機。上清を完全に取り除き、300マイクロリットルのMNase消化バッファーを加え、ペレットを再懸濁させます。MNaseと1.5ミリリットルのチューブでMNase消化バッファーを希釈し、マイクロリットル当たり50ゲル単位を生成します。希釈したMNaseを懸濁液に加え、摂氏37度で正確に10分間インキュベートします。2 1/2分ごとに反転して混合を設定します。MNase消化を終了するには、pH 8で0.5モルEDTAの30マイクロリットルを加え、渦を短時間加えます。氷の上で5分間培養した後、摂氏4度で5分間9,000倍gの遠心分離機。上清を完全に取り除き、PICを補充して調製したChIP希釈バッファーの300マイクロリットルでペレットを再懸濁させた。次に、マイクロチッププローブを搭載した超音波処理器で、超音波処理条件を振幅2、処理時間15秒、パルスオン5秒、パルスオフ30秒に設定します。氷の上の懸濁液を超音波処理します。1マイクロリットルの懸濁液を引き、スライドガラスにスポットを当てる。顕微鏡下で、細胞構造がほぼ壊れていることを確認するために観察する。チューブを摂氏4度で10分間9,000倍のグラムで遠心し、上清を新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移します。さらに処理するために1.5ミリリットルのスクリューチューブに消化したクロマチンの20マイクロリットルを保存し、残りをマイナス80°Cで保存します。まず、各1.5ミリリットルのスクリューチューブに、75マイクロリットルの水、5モル塩化ナトリウム4マイクロリットル、タンパク質とDNAの架橋を取り除K.To 1マイクロリットルのタンパク質分解酵素を加え、各MNase消化条件から20マイクロリットルの消化されたクロマチンをスクリューチューブに加えます。キャップをしっかりと閉じ、完全に混ぜ、一晩で摂氏65度でチューブをインキュベートします。朝、チューブを2~3,000倍gで数秒間遠心した後、100マイクロリットルのPCIを加える。エマルジョンを形成するために激しく渦を発生させた。室温で30秒間、再び最高速度でチューブを遠心分離します。その後、条件ごとに2つの1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブを調製します。1本のチューブに100マイクロリットルのPCIを加えます。pH 5.2で酢酸3モル酢酸ナトリウム10マイクロリットル、グリコーゲン2マイクロリットルを別のチューブに加えます。遠心分離機から取り出したチューブから、DNAを含む上相を慎重に引き出し、PCIを含むチューブに加えます。激しく渦を巻き、室温で30秒間最高速度でチューブを遠心分離する。次に、先に調製した酢酸ナトリウムおよびグリコーゲンを含む管に上相を移す。エタノールを250マイクロリットル加え、反転して混ぜます。室温で10分間インキュベートします。最高速度でチューブを摂氏4度で30分遠心分離します。チューブの底部のペレットを確認します。ペレットを乱さないよう上澄みをよく取り出し、500マイクロリットルの70%エタノールを加えます。最高速度でチューブを摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を完全に取り出し、ペレットを室温で約5分間乾燥させます。次いで、20マイクロリットルのTEを加え、ペレットを溶解させた。UV分光光度計を用いてDNA濃度を測定します。消化したクロマチンを調製した後、氷上のすべてのサンプルを解凍します。1200マイクロリットルあたり5マイクログラムの濃度に消化クロマチンを希釈するためにPICで補われた準備されたChIP希釈バッファーの1200マイクロリットルを加えます。希釈した消化クロマチンを5マイクロリットルを入力サンプルとして1.5ミリリットルのスクリューチューブに加えます。サンプルをマイナス80°Cで保存します。希釈した消化クロマチンを免疫沈降サンプルとして1.5ミリリットルのスクリューチューブにそれぞれ500マイクロリットル加えます。各チューブに2マイクログラムの抗体を加え、キャップを閉じます。ロッキングプラットフォーム上で穏やかに混合して、一晩摂氏4度でチューブをインキュベートします。朝、各チューブに30マイクロリットルのChIPグレードのプロテインG磁気ビーズを加えます。穏やかな混合で2時間摂氏4度で再びチューブをインキュベートします。その後、2~3,000倍gでチューブを短く回転させ、ネオジム磁石を含むポリエチレンラックに1分間チューブを入れてください。その後、吸引によって上清を慎重に除去する。次に、各チューブに0.5ミリリットルの低塩免疫複合体洗浄バッファーを加えます。ビーズを分散させるためにチューブを簡単に渦を出す。ロッキングプラットフォーム上で穏やかな混合で5分間摂氏4度でチューブをインキュベートします。原稿に従って高塩免疫複合体及び塩化リチウム免疫複合体で洗浄を繰り返す。残りの上清を完全に除去した後、チューブに溶出バッファーの150マイクロリットルを追加します。ビーズを完全に分散させるチューブをボルテックス。キャップを閉め、チューブを摂氏65度で30分間インキュベートします。ビーズを十分に分散させるには、5分ごとに反転して混ぜます。インキュベーション中に、1.5ミリリットルのスクリューチューブを準備し、6マイクロリットルの塩化5モルの塩化ナトリウムと2マイクロリットルのプロテイナーゼK.Thawを氷上で以前に調製した1%入力サンプルを加えます。溶出バッファーの 150 マイクロリットル、5 モル塩化ナトリウム 6 マイクロリットル、2 マイクロリットルのプロテイナーゼ K を入力サンプルに加えます。ビーズを含むチューブのインキュベーション後、スピンダウンします。チューブを磁気ラックに1分間置き、上澄み液を塩化ナトリウムとプロテイナーゼK.代表マイクロ写真の架橋を超音波処理前後のクロスリンクされた細胞ペレットのマイクロ写真に移し、明確な違いを示します。超音波処理がなければ、細胞構造はそのまま残り、クロマチンが核内に存在することを示す。短い超音波処理は、細胞構造を壊します。架橋クロマチンをVCaP細胞から調製し、様々な量のMNaseで消化した。MNaseを添加することなく、非常に高い分子量のスミアパターンが現れました。MNaseの添加は、MNaseが核間を消化することを示すラダーパターンを与えた。クロマチンフラグメントを900bpまで生成した条件のみが適切な消化と考えられるのに対し、不適切な消化パターンは消化過剰を示し、主に単核球体産生をもたらした。VCaP細胞におけるクロマチンの消化パターンは、クロマチンの適切な消化を示す。H3K4メチル3の最も高い占有率は、AR-TSSの約0.5キロベースおよび1キロベース上流で観察された。しかし、AR-TSSの19キロベースと8キロの上流と12キロベースの下流に位置する地域は、H3K4メチル3の占有率がほとんどなく、これらは負の領域として使用できることを示しています。MNase消化状態を決定することが最も重要です。実験のたびに細胞数、バッファー量、酵素量を維持します。条件は、各セル・タイプごとに識別する必要があります。我々は、因子およびクロマチンの立体構造の捕獲のグローバル占有のためのChIPシーケンシングを行い、遠位ゲノム病変間の相互作用を決定することができる。この方法は、転写のプロセス機構を明らかにすることができる。ChIPアッセイは、転写制御を調査するための強力なツールですが、面倒で再現性がありません。私たちの方法は、研究者が日常的かつ簡単にアッセイを行うことを奨励します。

chromatin-immunoprecipitation-assay-using-micrococcal-nucleases

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

ヌクレオソームELISA（NU - ELISA）は、ネイティブ、無傷のヌクレオソームの調製品で、翻訳後修飾のグローバルなパターンを検出する高感度かつ定量的な方法です。これらの変更は、メチル化、アセチル化、および特定のヒストンのアミノ酸残基でリン酸化が含まれており、それ故にNU -...

ELISAによるネイティブ無傷ヌクレオソーム上の翻訳後修飾の検出

出典:Mendez, F. M. et al., Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres. J. Vis. Exp.

ニューロスフェア細胞のネイティブクロマチン免疫沈降

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バイオマスの制限額を使用して効率的なクロマチン免疫沈降

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ツールは、Helix歪曲、部位特異的DNA鎖間架橋の処理に建築タンパク質HMGB1の役割を研究するために

この研究は、成熟マウスT細胞株を用いたクロマチン免疫沈降（ChIP）のためのプロトコールを記載している。このプロトコルは、特定のプロモーター部位またはゲノムワイドにおける特定のヒストンマークの分布を調べるのに適しています。...

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エピジェネティックなメカニズムは、神経膠腫で頻繁に変更されます。クロマチン免疫沈降は、クロマチン構造と遺伝子の転写を調節するヒストンの修正の変更から発生する神経膠腫の遺伝子変異の結果を研究に使用できます。このプロトコルはマウスの脳腫瘍細胞のネイティブのクロマチン免疫沈降をについて説明します。...

マウスの脳腫瘍細胞を使用してネイティブのクロマチン免疫沈降

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交配の適応は哺乳類細胞プロテオミクスのクロマチン関連タンパク質の捕捉します。

ここの褐色脂肪組織 (BAT) マウスから分離した高スループット DNA シーケンス (チップ seq) 続いて効率的なクロマチン免疫沈降 (チップ)...

マウスの褐色脂肪組織のクロマチン免疫沈降

ゲノム全体のタンパク質結合位置の正確な決定は、遺伝子調節を理解するために重要です。ここでは、クロマチン免疫沈降DNAをエキソヌクレアーゼ消化(ChIP-exo)に続けてハイスループットシーケンシングで処理するゲノムマッピング方法について説明します。この方法は、哺乳類ニューロンにおける近接塩基対マッピング分解能および高いシグナル対雑音比を用いてタンパク質とDNAの相互作用を検出する。...

クロマチン免疫沈降-エキソヌクレアーゼ(ChIP-Exo)を用いたマウス幹細胞由来ニューロンにおけるタンパク質-DNA相互作用の高分解能マッピング

CUT&amp;RUNおよびその変異体は、クロマチン上のタンパク質占有率を決定するために使用することができる。このプロトコルは、単一細胞uliCUT&amp;RUNを使用してクロマチン上のタンパク質局在を決定する方法を説明しています。...

標的下での超低入力切断とヌクレアーゼを用いた放出を用いたクロマチン上の単一細胞因子局在化

ゲノムワイド染色体コンフォメーションキャプチャー法Micro-C-XLを使用して、ヌクレオソーム分解能で三次元ゲノム構成をマッピングするためのプロトコルがここに示されます。...

Micro-C-XLによる哺乳類3Dゲノム相互作用のマッピング

学ぶ 微小コッカルヌクレアーゼを用いたChIPアッセイで、哺乳類細胞におけるタンパク質-DNA相互作用と遺伝子発現調節メカニズムを解明する方法。この再現性の高いプロトコルは、クロマチン生物学研究に有用です。

哺乳類細胞における微小コッカルヌクレアーゼを用いてクロマチン免疫沈殿アッセイ

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