哺乳類細胞における微小コッカルヌクレアーゼを用いてクロマチン免疫沈殿アッセイ

このプロトコルでは、タンパク質とDNAの相互作用を同定し、遺伝子の転写調節を明らかにすることができる。これは、細胞内の分子メカニズムを理解するのに役立ちます.既存のプロトコルを変更し、簡単で明確なアッセイプロトコルを確立します。

最初のステップからプロトコルに従うだけで、アッセイが正常に実行されます。クロスリンクされたクロマチンを調製するには、ヒュームフードに、1%VCaP細胞培養培地の4ミリリットルと18.5%PFAの0.229ミリリットルを6センチメートルの皿に加えます。皿をそっと渦巻いてPFAを均等に分配します。

室温で正確に10分間インキュベートします。その後、皿に0.47モルグリシン溶液の0.47ミリリットルを加え、さらに架橋を停止するために5分間室温でインキュベートします。原稿に従って細胞を洗浄した後、細胞を掻き取り、細胞懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移します。

細胞懸濁液を用いてチューブを3,000倍のgで室温で5分間遠心し、細胞ペレットを回収する。PBSを完全に除去するためにピペットを使用してください。チューブあたりのセル数を記録し、セルペレットをマイナス80°Cで保存します。

細胞のリシスを行うために、まず貯めたVCaP細胞ペレットを氷上で解凍する。各チューブにPICを添加した調製されたChIP細胞のリシスバッファーの300マイクロリットルを加え、ペレットを十分に再懸濁します。チューブを15秒間ボルテックスし、氷上で懸濁液を10分間インキュベートする。

摂氏4度で3分間9,000倍gの遠心分離機。上清を完全に取り除き、300マイクロリットルのMNase消化バッファーを加え、ペレットを再懸濁させます。MNaseと1.5ミリリットルのチューブでMNase消化バッファーを希釈し、マイクロリットル当たり50ゲル単位を生成します。

希釈したMNaseを懸濁液に加え、摂氏37度で正確に10分間インキュベートします。2 1/2分ごとに反転して混合を設定します。MNase消化を終了するには、pH 8で0.5モルEDTAの30マイクロリットルを加え、渦を短時間加えます。

氷の上で5分間培養した後、摂氏4度で5分間9,000倍gの遠心分離機。上清を完全に取り除き、PICを補充して調製したChIP希釈バッファーの300マイクロリットルでペレットを再懸濁させた。次に、マイクロチッププローブを搭載した超音波処理器で、超音波処理条件を振幅2、処理時間15秒、パルスオン5秒、パルスオフ30秒に設定します。

氷の上の懸濁液を超音波処理します。1マイクロリットルの懸濁液を引き、スライドガラスにスポットを当てる。顕微鏡下で、細胞構造がほぼ壊れていることを確認するために観察する。

チューブを摂氏4度で10分間9,000倍のグラムで遠心し、上清を新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移します。さらに処理するために1.5ミリリットルのスクリューチューブに消化したクロマチンの20マイクロリットルを保存し、残りをマイナス80°Cで保存します。まず、各1.5ミリリットルのスクリューチューブに、75マイクロリットルの水、5モル塩化ナトリウム4マイクロリットル、タンパク質とDNAの架橋を取り除K.To 1マイクロリットルのタンパク質分解酵素を加え、各MNase消化条件から20マイクロリットルの消化されたクロマチンをスクリューチューブに加えます。

キャップをしっかりと閉じ、完全に混ぜ、一晩で摂氏65度でチューブをインキュベートします。朝、チューブを2~3,000倍gで数秒間遠心した後、100マイクロリットルのPCIを加える。エマルジョンを形成するために激しく渦を発生させた。

室温で30秒間、再び最高速度でチューブを遠心分離します。その後、条件ごとに2つの1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブを調製します。1本のチューブに100マイクロリットルのPCIを加えます。

pH 5.2で酢酸3モル酢酸ナトリウム10マイクロリットル、グリコーゲン2マイクロリットルを別のチューブに加えます。遠心分離機から取り出したチューブから、DNAを含む上相を慎重に引き出し、PCIを含むチューブに加えます。激しく渦を巻き、室温で30秒間最高速度でチューブを遠心分離する。

次に、先に調製した酢酸ナトリウムおよびグリコーゲンを含む管に上相を移す。エタノールを250マイクロリットル加え、反転して混ぜます。室温で10分間インキュベートします。

最高速度でチューブを摂氏4度で30分遠心分離します。チューブの底部のペレットを確認します。ペレットを乱さないよう上澄みをよく取り出し、500マイクロリットルの70%エタノールを加えます。

最高速度でチューブを摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を完全に取り出し、ペレットを室温で約5分間乾燥させます。次いで、20マイクロリットルのTEを加え、ペレットを溶解させた。

UV分光光度計を用いてDNA濃度を測定します。消化したクロマチンを調製した後、氷上のすべてのサンプルを解凍します。1200マイクロリットルあたり5マイクログラムの濃度に消化クロマチンを希釈するためにPICで補われた準備されたChIP希釈バッファーの1200マイクロリットルを加えます。

希釈した消化クロマチンを5マイクロリットルを入力サンプルとして1.5ミリリットルのスクリューチューブに加えます。サンプルをマイナス80°Cで保存します。希釈した消化クロマチンを免疫沈降サンプルとして1.5ミリリットルのスクリューチューブにそれぞれ500マイクロリットル加えます。

各チューブに2マイクログラムの抗体を加え、キャップを閉じます。ロッキングプラットフォーム上で穏やかに混合して、一晩摂氏4度でチューブをインキュベートします。朝、各チューブに30マイクロリットルのChIPグレードのプロテインG磁気ビーズを加えます。

穏やかな混合で2時間摂氏4度で再びチューブをインキュベートします。その後、2~3,000倍gでチューブを短く回転させ、ネオジム磁石を含むポリエチレンラックに1分間チューブを入れてください。その後、吸引によって上清を慎重に除去する。

次に、各チューブに0.5ミリリットルの低塩免疫複合体洗浄バッファーを加えます。ビーズを分散させるためにチューブを簡単に渦を出す。ロッキングプラットフォーム上で穏やかな混合で5分間摂氏4度でチューブをインキュベートします。

原稿に従って高塩免疫複合体及び塩化リチウム免疫複合体で洗浄を繰り返す。残りの上清を完全に除去した後、チューブに溶出バッファーの150マイクロリットルを追加します。ビーズを完全に分散させるチューブをボルテックス。

キャップを閉め、チューブを摂氏65度で30分間インキュベートします。ビーズを十分に分散させるには、5分ごとに反転して混ぜます。インキュベーション中に、1.5ミリリットルのスクリューチューブを準備し、6マイクロリットルの塩化5モルの塩化ナトリウムと2マイクロリットルのプロテイナーゼK.Thawを氷上で以前に調製した1%入力サンプルを加えます。

溶出バッファーの 150 マイクロリットル、5 モル塩化ナトリウム 6 マイクロリットル、2 マイクロリットルのプロテイナーゼ K を入力サンプルに加えます。ビーズを含むチューブのインキュベーション後、スピンダウンします。チューブを磁気ラックに1分間置き、上澄み液を塩化ナトリウムとプロテイナーゼK.代表マイクロ写真の架橋を超音波処理前後のクロスリンクされた細胞ペレットのマイクロ写真に移し、明確な違いを示します。

超音波処理がなければ、細胞構造はそのまま残り、クロマチンが核内に存在することを示す。短い超音波処理は、細胞構造を壊します。架橋クロマチンをVCaP細胞から調製し、様々な量のMNaseで消化した。

MNaseを添加することなく、非常に高い分子量のスミアパターンが現れました。MNaseの添加は、MNaseが核間を消化することを示すラダーパターンを与えた。クロマチンフラグメントを900bpまで生成した条件のみが適切な消化と考えられるのに対し、不適切な消化パターンは消化過剰を示し、主に単核球体産生をもたらした。

VCaP細胞におけるクロマチンの消化パターンは、クロマチンの適切な消化を示す。H3K4メチル3の最も高い占有率は、AR-TSSの約0.5キロベースおよび1キロベース上流で観察された。しかし、AR-TSSの19キロベースと8キロの上流と12キロベースの下流に位置する地域は、H3K4メチル3の占有率がほとんどなく、これらは負の領域として使用できることを示しています。

MNase消化状態を決定することが最も重要です。実験のたびに細胞数、バッファー量、酵素量を維持します。条件は、各セル・タイプごとに識別する必要があります。

我々は、因子およびクロマチンの立体構造の捕獲のグローバル占有のためのChIPシーケンシングを行い、遠位ゲノム病変間の相互作用を決定することができる。この方法は、転写のプロセス機構を明らかにすることができる。ChIPアッセイは、転写制御を調査するための強力なツールですが、面倒で再現性がありません。

私たちの方法は、研究者が日常的かつ簡単にアッセイを行うことを奨励します。