Name: Germinosomes と枯草菌胞子の内部の膜の可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 学ぶ 枯草菌胞子におけるgerminosomeと内膜ドメインの可視化法。超高解像度構造照明顕微鏡（3D-SIM）を用いて、発芽受容体クラスターの局在を詳細に解析する手法を解説します。

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著者はクリスティアーン ・ Zeelenberg の SIM イメージング中に彼の援助をありがちましょう。JW は中国奨学金博士課程フェローシップ委員会を認識し、アイリーン Stellingwerf とイメージングの第一次段階の間に彼女の助けをありがちましょう。

1 B. subtillis胞子形成 (タイミング: 顕微鏡観察する前に 7 日間)。
<ol><li>
日 1
	<ol>
<li>ルリア ベルターニカミラ スープ (LB) 寒天培地プレート (1% トリプトン、0.5% 酵母エキス、1% 食塩水, 1% 寒天)13に細菌培養を連勝し、シングル コロニーを取得する 37 ° C で一晩インキュベートします。B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB mCherry 猫、逆流性食道炎 gfp 菅) ひずみとその親株背景に枯草PS4150 を使用 (PS832 ΔgerE::spc、ΔcotE::tet)7を前述のよう。 注:ΔcotEΔgerEの背景を持つ胞子の使用は胞子コート レイヤー7の自発蛍光を最小限にするために germinosome 可視化に不可欠です。</li>
		<li>すべてのメディア、チューブ、pipets、適切な方法で使用される他の文化の資料を殺菌します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
日 2
	<ol>
<li>早朝に 5 mL の LB 培地に単一コロニーを接種して OD600 0.3 から 0.4 (約 7 時間) に達するまでに 200 回転/分、37 ° C でスクリュー キャップ チューブの連続撹拌下で文化を孵化させなさい。</li>
		<li>モップ媒体 (pH 7.5) 500 ml ペットボトル 3 nM (NH4)6Mo7O24·4H2O、0.4 μ M H3を含んでいる BO3, 30 nM CoCl2·6H2O, 10 nM CuSO4·5H2O、10 nMZnSO4·7H2O、1.32 ミリメートル K2HPO4、0.4 mM MgCl2·6H2O、0.276 mM K24、0.01 mM FeSO4·7H2O、0.14 mM CaCl2·2H2O、80 mMモップ、4 mM 0.1 mM MnCl2·2H2O、トリシン 10 mM D-グルコース-一水和物、および 10 mM NH4Cl。</li>
		<li>スクリュー キャップ チューブ 10-1- 5 mL の LB 文化 10-7シリアル希薄でモップの培地を準備し、一晩 200 回転/分、37 ° C で連続攪拌下で文化を孵化させなさい 注:ここで用意されるシリアルの希薄は翌朝早い指数段階の希釈を取得を目指します。このステップと次のステップ モップ バッファー成長媒体に適応するセルを許可に必要です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
日 3
	<ol>
<li>0.3 0.4 の OD600モップ希釈液のいずれかを選択します。予め温めておいた (37 ° C) モップ培地 20 mL 円錐形の 250 mL のフラスコの中に文化の 0.2 mL を接種して OD600に達する 0.3 から 0.4 (〜 7 h) まで連続攪拌下で孵化させなさい。</li>
		<li>1.3.1 のステップから 1% (v/v) 前培養とモップ ベース胞子形成培地 (250 mL) を接種して連続攪拌下の円錐形のリットルのフラスコで 37 ° C で 3 日間インキュベートします。FM4 64 PS4150 胞子の染色、2 μ G/ml FM4 64 プローブ (材料表参照) 胞子形成培地 1 または 2 h に OD600値 (一般に約 2) 栄養生長のピークに達した後を追加し、許可する文化その後感受性光5から保護しながら。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
7 日目: 胞子の収穫
	<ol>
<li>位相暗細胞から段階明るい胞子とおそらく成熟した胞子を区別するために、100 倍の倍率で位相差顕微鏡を使用して胞子形成収率 (胞子対栄養細胞) を決定します。90% 相明るい胞子収量が期待されます。</li>
		<li>4,270 x g丸底遠心チューブの 4 ° C で 15 分間で胞子をペレットします。50 mL コニカル遠沈管 (材料の表を参照) で 2-3 回滅菌超純水タイプ 1 脱水 40 mL で胞子ペレットを洗浄します。4,270 × gで 15 分 (4 ° C) で洗うたびにスピンダウンします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
7 日目:胞子浄化
	<ol>
<li>浄化を胞子: 20% 非イオン密度勾配媒体の 750 μ L で胞子ペレットを中断 (材料の表参照) し 800 μ L の滅菌マイクロ遠心チューブ用で 50% 非イオン密度勾配媒体に読み込みます。21,500 x gで 60 分間遠心します。得られたペレットには、無料の胞子が含まれています。20% 非イオン密度勾配媒体を 200 μ l 添加の胞子ペレットを中断し、1 mL 遠心チューブで 21,500 × gで 15 分遠心分離 50% 非イオン密度勾配媒体の上にロードします。</li>
		<li>最終的な胞子準備・洗浄: 得られたペレットには精製の休眠胞子が含まれています。洗浄滅菌超純水タイプ 1 の 1.5 mL で 2-3 回胞子ペレット (材料の表を参照) を水と 4 ° C で 15 分間 9,560 x gで間にスピン ・ ダウン最後に、約 30 の最終の OD600滅菌超純水タイプ 1 水でペレットを中断します。胞子の因数は、8 週間14-80 ° C で保存できます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. decoating
<ol><li>PS4150 胞子を扱うと 0.1 M 塩化ナトリウム/0.1 M NaOH/1% ナトリウム dodecyl 硫酸 (SDS)/1 h. の 70 ° C で 0.1 M ジチオトレイトール (DTT) 洗浄滅菌超純水水タイプ 115,16で 10 倍胞子。これによりいずれかは胞子の外膜で FM4 64 プローブを吸着し、外側の層が削除されます。</li>
</ol>3. Coverslip とスライド準備11 (タイミング: 観察する前に 1 H)
<ol><li>クリーン前高精度 coverslips は、優しく揺れ水浴中で 30 分間 1 M HCl で (材料の表を参照)。超純水の種類 1 水で 2 回 coverslips を洗浄し、100% (巻/巻) 江藤に保存します。乾燥し、使用する前に彼らの明快さを確認しましょう。中古 70% でスライド ガラスをきれい江藤。乾燥し、使用する前に彼らの明快さを確認しましょう。</li>
</ol>4. サンプリング蛍光マイクロスフィアまたは胞子遺伝子フレーム スライド10 (15 分タイミング)
<ol><li>前 2 つ 70 %etoh 掃除を暖かいと 70 ° C 加熱ブロックでは数秒の空気の乾燥したガラス スライド (材料の表を参照)、65 μ L 1 つのガラス スライド上に 70 ° C で開催された滅菌の 2% の agarose をドロップしてアガロース b を普及する上で他のガラス スライドを配置etween スライド。アガロースのパッチは約 5 分で乾燥します。</li>
	<li>ガラス スライドの 1 つを削除した後に 1 × 1 cm 断面 agarose パッチをカット サンプル (蛍光マイクロスフィアまたは 10 〜8/mL の胞子)、0.4 μ を追加して、パッチに coverslip を配置することによって高精度の coverslip にパッチを転送し、オフにスライド。</li>
	<li>従って完了顕微鏡用スライド、フレームのすべてのコーナーを終了、coverslip を配置先、乾燥したスライド上に遺伝子のフレーム (1.5 x 1.6 cm2、65 μ L) を修正します。</li>
</ol>5. イメージング11,17(タイミング: 1 H)
<ol><li>胞子の伝送と蛍光画像だけでなく、赤の混合物をキャプチャし、構造化照明顕微鏡黄緑色のカルボン酸修飾微粒子蛍光は油客観的 (x 100 装備 (材料の表参照)開口数 = 1.49)、CCD カメラと画像解析ソフトウェア (材料の表を参照)。周囲の光の妨害することがなく室温ですべての画像を生成します。目的とイメージングの前に 75% エタノール スライド x 100 を常にきれいにすることを確認します。</li>
	<li>100 nm (直径) 蛍光マイクロスフィアに焦点を当てるし、対称の psf が得られる、画像のぶれを最小限に抑えるまで 100 x 目的の補正リングを調整することによって点拡がり関数 (psf) を最適化します。Psf は、インパルス応答またはイメージング システムの点光源または point オブジェクトへの応答。</li>
	<li>約 10 ラウンド蛍光マイクロスフィアとビューのフィールドを選択します。回折格子を適用ピント調整の両方 561 nm と画像解析ソフトウェアのためのガイドとして 488 nm 励起波の長さ。</li>
	<li>透過光で胞子を集中し、イメージごとに 200 ミリ秒のエクスポー ジャーを持つ 16 × 平均モードで透過光像をキャプチャします。</li>
	<li>照明モード読み出しモード電子乗算 (EM) 利得 10 MHz にカメラ設定「3 D シム」では、14 ビットと 175 で EM ゲインと胞子の 3D SIM raw 蛍光画像をキャプチャします。レーザー出力の 20% で 561 nm のレーザー光で PS4150 胞子で FM4 64 プローブと照明時間 400 ms を刺激します。</li>
	<li>エキサイト GerKB mCherry と KGB80 で逆流性食道炎 GFP 胞子、それぞれ、561 nm レーザー光で 30% レーザー パワーで 1 s、および 488 nm レーザー光 60% で 3 s. Z スタック設定は/ステップのモードでは、0.2 μ m を下へ、7 つのステップ、germinosome の 20 の手順で電源をレーザーとIM 解析、それぞれ。 注:これらのレーザーのパラメーターは、約 4,000 のヒストグラム ウィンドウの明るさの最大値を保証するために適用されました。</li>
</ol>6. 3D SIM FM4-64 PS4150 の胞子を染色の Raw 画像を再構築します。
<ol><li>PS4150 胞子の生データを染色 FM4 64 N SIM スライス再構成を実行します。N-シム スライス再構成ウィンドウを開く N SIM パッド] タブ シートに再構成スライス Paramボタン クリックします。</li>
	<li>N SIM スライス再構成ウィンドウで復元パラメーターを設定します。最適な再構成画像を得るため N SIM 命令の提案に従うし、照明変調コントラスト (IMC)を自動高に設定するN SIM スライス再構成ウィンドウに適切なコントロールをクリックしてください解像度ノイズ抑制 (HRNS) 1.00、焦点ぼかし抑制 (OFBS) から開始点として 0.05 〜。</li>
	<li>イメージを再構築するN SIM スライス再構成ウィンドウで再構成スライス] ボタンをクリックします。高速フーリエ変換 (FFT) 画像と復興12後表示復興のスコアによる再構成画像の品質を評価します。</li>
	<li>0.10 からHRNSを調整 5.00 そしてのOFBSには 0.01 から 0.50 によって最適なパラメーター設定が得られるまでN SIM スライス再構成ウィンドウ内の適切なコントロールをクリックします。</li>
	<li>変更されたパラメーターを適用するN SIM スライス再構築] ウィンドウで [適用] ボタンをクリックします。ウィンドウを閉じるに [閉じる] ボタンをクリックします。</li>
	<li>[FM4-64 ステンド PS4150 の胞子の raw 画像のアクティブなN SIM パッド] タブ シートのスライスの再構築ボタンをクリックしてスライス再構成を実行するを確認します。再構築された画像を保存します。</li>
</ol>7. 画像解析
<ol><li>
KGB80 germinosome の擬似広視野画像を変換します。
	<ol>
<li>ImageJ プラグインSIMcheckユーティリティRaw データ SI 擬似広視野12左クリックでアクティブにして擬似広視野画像に 3 D SIM KGB80 の raw 画像を変換します。擬似広視野生 SIM データから画像の平均値し、の比較のため、従来の広視野照明12と同等のイメージを組み立てます。ImageJ 自体は、https://imagej.net/Welcome を参照してください。蛍光の擬似広視野画像で後で germinosome 分析の各逆透過像の ~ 25 胞子がランダムに選択します。</li>
		<li>2 枚のスライドからの眺めの 14 のフィールド (この例では、346) の合計約 350 KGB80 胞子で選択します。選択した KGB80 の胞子の逆流性食道炎 GFP と GerKB mCherry 蛍光巣番号は、2 つの研究者によって独立してカウント必要があります。研究者胞子で別蛍光 germinosome 巣の存在を疑うときは常に 3 D SIM の raw 画像を参照できます。</li>
		<li>各逆流性食道炎 GFP と GerKB mCherry フォーカスの最大強度と ImageJ で各 KGB80 胞子の 3 D 画像の強度を評価します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
KGB80 germinosome の擬似広視野画像を分析します。
	<ol>
<li>KGB80 胞子の統合された信号強度として 7 スタックの平均強度値を使用します。同一の設定を使用してバック グラウンドひずみ PS4150 イメージングによるバック グラウンド強度を決定します。背景と明確に区別している場合 germinosome 巣として個々 の KGB80 の胞子の輝点を考えてください。</li>
		<li>ソフトウェアの起源 9.0 と意義を決定するため一方通行 ANOVA テストを適用します。P 値を考慮した < 0.05 として統計的に重要な。スピアマンの順位相関係数18を使用して、逆流性食道炎 GFP と GerKB mCherry の巣数の相関は、信号強度の測定を評価します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germination+of+spores+of+Bacillus+species%3A+what+we+know+and+do+not+know%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).</li>
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<li>Strahl, H., Bürmann, F., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin+homologue+MreB+organizes+the+bacterial+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li>
<li>Strahl, H., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+potential+is+important+for+bacterial+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Membrane potential is important for bacterial cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).</li>
<li>Swarge, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22One-Pot%22+sample+processing+methodfor+proteome-wide+analysis+of+microbial+cells+and+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">"One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores.</a> Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169(2018).</li>
</ol>

利害の対立が宣言されていません。

提示されたプロトコルには、FM4-64 B. 枯草菌芽胞をステンド胞子形成、スライドの準備、画像形成プロセスの解析のための標準 3D SIM プロシージャが含まれています。さらに、プロトコルが変更された SIMcheck (ImageJ) について説明します-3 D イメージング蛍光レポーターの付いた菌胞子 germinosomes の SIM 顕微鏡のためのプロセスを支援します。後者の手順では、拡張されたコントラストと薄暗いこの部分構造を観察することができました。2 つの画像処理手順を結合することによって発芽過程のメカニズムの理解のための私達の基礎を向上させる、同じ SIM 顕微鏡と同じ胞子の離散構造を可視化することが可能です。〜 100 の水平解像度で動作する手順メモ nm と 200 〜 250 の軸解像度 nm。これは、グリフィス7で使用される差動干渉の対照 (DIC) 広視野顕微鏡のアプローチよりも優れています。時間分解 germinosome 発芽の開始時に外観の解析目的次のステップになります。残念ながら、SIM 顕微鏡は、原則として互換性ラ...

注文 Bacillales と Clostridiales の胞子は休眠代謝と過酷な除染体制に非常に抵抗力があるが、彼らは発芽する、しない限り、人間1に有害な影響を引き起こすことはできません。枯草菌(枯草) 胞子の栄養 germinant トリガー発芽、開始イベント、germinant 受容体 (GRs) 胞子の内膜 (IM) に位置する germinant のバインディングです。その後、GRs は IM にもある SpoVA チャネル蛋白質に信号を変換します。これは、結果、胞子コア ピリジン-2, 6-ジカルボン酸 (ジピコリン酸; exchange の発症DPA;胞子コア乾燥重量の 20% を構成する) SpoVA チャネル経由で水のため。その後、DPA リリース トリガー皮質ペプチドグリカン加水分解の活性化、追加吸水2,3,4に従います。これらのイベントは、コート層、その後破断伸長の発症に機械的ストレスにつながる、そして最後に、生長します。ただし、発芽過程の分子の正確な詳細はまだ遠くから解決されています。
胞子の発芽についての主要な質問にかかわる周囲の IM SpoVA チャネル蛋白質と同様に、IM の発芽タンパク質脂質の生物物理プロパティ。この主不動 IM 脂質二分子膜は胞子コアまたは細胞細胞質5,6で彼らの行動を出すいくつかの毒性の化学防腐剤を含む多くの小さい分子の主な関門です。IM の脂質二重膜は、モバイル IM5脂質の大部分はあるもののゲル状態の可能性が高いです。胞子の IM も大幅な拡大5の可能性があります。したがって、IM の表面積増加 1.6 追加膜の合成することがなく発芽し、この膜の特性低透磁率および脂質不動5,6の損失と一緒に伴われます。
B. 枯草菌胞子のサイズが小さいと発芽蛋白質の比較的低い豊かさが課題を提起発芽蛋白の活性化と胞子の IM 脂質の組織の分子の詳細は学習の魅力的なテーマが、顕微鏡解析。B. 枯草菌芽胞の足場蛋白質逆流性食道炎整理ゲラ、B と K GRs のための 3 つの GR サブユニット (A、B および C) グリフィスら落射蛍光顕微鏡証拠を魅力的な発芽蛋白質に溶ける蛍光レポーターを使用して示唆しています。クラスター7。彼らは発芽蛋白質のこのクラスターの 'germinosome' という言葉し、~ 300 nm 大 IM タンパク質巣8として構造を説明しました。胞子の発芽の開始、時に巣最終的に変更に大きな蛍光 germinosome 分散蛍光パターンと > L-バリン8で 1 h の胞子でこのパターンを表示する胞子人口の 75% が発芽しました。上記の使用紙平均統計的検出力を得るために、イメージング中に観測された低蛍光信号のハードルを克服するための連続した蛍光画像の数十からの画像であることに注意してください。細菌の胞子のこれらの構造のこの可視化された古典的な顕微鏡ツールとも単胞子の巣量評価と技術的に実現可能なものの端になかったより詳細な局在この方法で可能です。
ここでは、詳細な可視化を取得する構造化照明顕微鏡 (SIM) の使用とその IM 脂質ドメイン9のと同様、枯草胞子で germinosome(s) の定量化を紹介します。プロトコルには、ImageJ10、11,12だけでなく、胞子形成、スライドの準備および SIMcheck (v1.0、imageJ プラグイン) による画像解析手順も含まれています。

<table><tbody><tr><td>空気乾燥ガラススライドMenzel</td><td>Gl&auml;ser</td><td>630-2870</td><td></td></tr><tr><td>APO TIRF N20R8 100&times; 油対物レンズ (NA=1.49)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B. subtilis PS4150 (PS832 &Delta;gerE::spc, & デルタ;cotE::tet)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer フラスコ 1 L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z567868</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer フラスコ 250 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z723088</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres カルボン酸修飾マイクロスフェア</td><td>Invitrogen, 0.1 &mu;m</td><td>F8803</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>F34653</td><td></td></tr><tr><td>Histodenz nonionic density gradient medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2158</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera</td><td>Andor Technology</td><td></td><td>https://imagej.net/Welcome</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブ 1.5 mL</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>3451PK</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡イメージングソフトウェア</td><td>ニコン</td><td>NIS-Element AR 4.51.01</td><td></td></tr><tr><td>ミリQ 超高純度デミネリル水</td><td>ミリポア</td><td>ミリキューム IQ 7003</td><td></td></tr><tr><td>ニコン エクリプス Ti 顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレン スクリューキャップ ボトル 180 mL</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>75003800</td><td></td></tr><tr><td>精密カバースリップ</td><td>Paul Marienfeld</td><td>117650</td><td></td></tr><tr><td>丸底チューブ 15 mL</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td></td><td>Nunc TM</td></tr><tr><td>スクリューキャップチューブ 50 mL</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td>Nunc TM</td></tr></tbody></table>

germinosomes と枯草菌胞子の内部の膜の可視化

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

胞子のサイズが小さく、発芽蛋白質の比較的低い豊かな落射蛍光顕微鏡を用いた顕微鏡分析の難しさを引き起こします。超解像 3次元構造化照明顕微鏡法 (3 D SIM) は、このハードルを克服し、枯草菌(枯草) 胞子の発芽の過程の分子の詳細を明らかにする有望なツールです。ここでは、変更された SIMcheck (ImageJ) の使用を述べる-アシスタント 3 D イメージング プロセスと枯草胞子 germinosomes、発芽蛋白質のクラスターの SIM 顕微鏡蛍光レポーター蛋白質。FM4 64枯草胞子膜の汚損のため (スタンダード) 3 D SIM イメージング手順を提案する.これらの手順を使用して、我々 は germinosome のローカリゼーションのための卓越した解像度を得られるし、示す > 休眠胞子は胞子形成培最小限モップの後得られた枯草KGB80 の 80% ある逆流性食道炎 GFP と GerKB mCherry の 1 つまたは 2 つ巣。明るい巣も観察した FM4 64 ステンド胞子 3 D シム画像可能性があります異なる流動性の内膜脂質ドメインが存在することを示唆しています。更なる研究の共局在を評価し、このように内部胞子膜の菌発芽蛋白質の組織の最適な概観を得るダブル レポーター蛋白質膜色素と germinosome 手順をラベリングを使用するが可能。

現在のプロトコルは細菌の胞子の SIM 顕微鏡イメージング手順を示します。胞子形成とスライドの準備手順は、イメージングの前に図 1に示すように、行われました。イメージングおよび分析手順が適用された後で、両方の点心 (発芽タンパク質を標識蛍光タンパク質) と明るい (脂溶性プローブ染色 IM) 胞子サンプル次のテキストのよう。
B. 枯草菌芽胞の germinosomes の局在
逆流性食道炎と GerKB のレベルは、胞子、あたり 3,500 〜 と 〜 700 の分子が、それぞれに報告された豊富な胞子形成培地19の準備の胞子からの抽出物の西部のしみの分析に基づきます。KGB...

枯草菌胞子の内膜で 'germinosomes' の germinant 受容体蛋白質クラスター。超解像顕微鏡と蛍光レポーターのタンパク質を使用して germinosomes を視覚化するプロトコルについて述べる。プロトコルはまた、FM4 64 膜色素で染色が優先的に胞子内膜ドメインを識別します。

Germinosomes と枯草菌胞子の内部の膜の可視化

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

超解像構造照明顕微鏡、3D-SIMは、胞毛膜における発芽受容体クラスターの蛍光レポータータンパク質の可視化のための革新的な技術です。これらの手順を用いて、発芽性局在および胞毛内膜脂質ドメインの卓越した分解能が達成できる。この技術は、博士課程の学生フアン・ウェンと私たちの研究室の科学修士レイモンド・パスマンによって実証されます。手順を開始する前に、穏やかに揺れる水浴で30分間、1モル塩酸を含む高精度のカバーリップを洗浄し、続いて超純粋なタイプ1水で2、5分の洗浄を行います。2回目の洗浄後、カバーリップを約3分間100%エタノールに入れてから、カバーリップを乾燥させて透明度を確認します。その後、きれいなガラス顕微鏡は、スライドを乾燥させ、その明瞭さを検証する前に、1分間70%エタノールでスライドします。蛍光微小球および胞子イメージングの場合、最初のプレウォーム2スライドは、70°Cの加熱ブロック上で数秒間、70度の摂氏65マイクロリットルの液滴をスライドの1つに添加した。他のスライドを上に置き、スライド間にアガロースを広げます。5分後、スライドの1つを取り出し、乾燥アガロースを1センチのセクションに切ります。8番目の蛍光微小球または胞子に0.4マイクロリットルの無菌、超純粋なタイプ1水を1回10回加え、カバースリップを使用してパッチに高精度のカバースリップを置き、スライドのパッチをカバースリップ表面にスライドさせます。その後、65マイクロリットル、1.5 x 1.6センチメートルのジーンフレームを乾燥スライドに固定し、カバースリップをフレームに置き、フレームのすべての角を閉じます。サンプルのイメージングのために、スライドを100Xの油性目的を備えた構造化された照明顕微鏡に置き、100ナノメートルの蛍光微小球に焦点を当てます。画像のぼかしを最小限に抑える対称点広がり関数が得られるまで、100xの目的で補正リングを調整し、約10の丸い蛍光微小球を有する視野を選択します。指定された励起波長(この場合は561および488ナノメートル)に対してグレーティングフォーカス調整を適用し、透過光で胞子に焦点を当てる前に画像解析ソフトウェアのガイドとして適用する。各画像に対して 20 ミリ秒の露出を持つ 16x 平均モードで、透過光画像をキャプチャします。次に、3D-SIM照明モードで胞子の蛍光画像を生で3D構造の照明顕微鏡を撮影します。スライスの再構成のために、構造化照明パッドタブシートの[Param]をクリックして、N-SIMスライス再構築ウィンドウを開きます。推奨される指示に従い、適切なコントロールをクリックして、照明変調コントラストを auto に設定し、高解像度ノイズ抑制を 1 に設定し、フォーカスブラーの非表示を開始点として 0.05 に設定します。次に、[スライスの再構築] をクリックしてイメージを再構築し、再構築後に表示される高速フーリエ変換画像と再構築スコアによって、再構築された画像の品質を評価します。0.1 から 5 までの高解像度ノイズを調整し、フォーカスブラーの除去を 0.01 から 0.5 に調整して、最適なパラメータ設定を取得します。次に、[適用] をクリックして変更を適用します。[閉じる] をクリックしてウィンドウを閉じます。FM4-64染色PS4150胞子の生画像を開きます。次に、[スライスの再構築] をクリックしてスライスの再構築を実行し、再構築したイメージを保存します。KGB80 geminosome の 3D-SIM 生画像を疑似ワイドフィールド画像に変換するには、ImageJ SIMcheck プラグインを左クリックして、生データ SI と疑似ワイドフィールドを選択します。蛍光擬広視野画像での発芽分析のために、各反転透過画像で約25個の胞子をランダムに選択し、約350個の胞子が選択された。次にImageJを使用して、各胞子群で表される蛍光シグナルの最大強度と、各3D胞子像の積分強度を評価します。KGB80の生殖細胞の擬似広視野画像を解析するには、7つのスタックの平均積分強度値をKGB80胞毛の統合信号強度として使用する。次に、同一の設定を用いてPS4150バックグラウンド株を画像化して背景強度を決定し、個々のKGB80胞子の蛍光スポットを、背景と明確に区別できる場合は発芽性病巣とみなします。この代表的な実験では、GerD-GFP蛍光胞子の2つの病巣が異なるスタックに現れ、3つの総GerD-GFP病巣がコプラスZ3スタックで観察された。ここでは、胞状D-GFP焦点が胞毛内に1つだけある胞状の胞状が観察された。合計で、胞子の約40〜50%がそれぞれ2つまたは1つのGerD-GFPおよびGerKB-mCherryクラスターを有していた。GerD-GFP足場タンパク質の積分強度は異なる集団間で異なっていましたが、GerKB-mCherryの積分強度は異なる集団で同じでした。胞子が複数の病巣を有すると、GerD-GFPおよびGerKB-mCherry病巣の最大蛍光強度は減少する傾向があり、ゲルミノソーム病巣とみなされるすべての明るいスポットの最大蛍光は、PS4150胞子の最大自発蛍光よりも高かった。特に、発芽病巣に似た明るいFM4-64スポットは、無傷および脱コーティングされたPS4150胞子の両方に現れ、これらの明るいFM4-64スポットが内膜のゲルミノソームタンパク質のクラスタリングに関与する可能性があることを示唆している。アガロースに胞子を追加し、フレームにアガロースを配置するには、これらのミニ材料のための継続的かつ慎重な流体の動きが必要です。KGB80の生殖細胞の3D-SIM生画像を疑似広視野画像に変換し、その解釈には胞毛生物学に関する専門知識が必要です。当社の構造化照明顕微鏡法は、異なる細菌や他のバンド材料における低い豊富なタンパク質または薄暗い蛍光レポーターのイメージングに適用することができます。発芽体の組織は、バチルス発芽タンパク質および特異的膜ドメインの共局在化を評価するために二重標識手順を用いて研究することが可能になりました。

visualization-germinosomes-inner-membrane-bacillus-subtilis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

このプロトコルは、自動化された蛍光タイムラプス顕微鏡を用いて時間の異なる細菌の単セルの動作を監視するためにステップバイステップ手順を提供します。さらに、我々は、顕微鏡画像を分析する方法のガイドラインを提供します。...

の生細胞イメージング枯草菌と肺炎球菌自動タイムラプス顕微鏡を使用して

出典: Figueroa、DM、 et al. 抗菌ペプチド局在を特徴付けるための細菌スフェロプラストとプロトプラストの生産と可視化 J. Vis. 経験。 (2018年)このビデオでは、グラム陽性菌Bacillus...

グラム陽性菌Bacillus megateriumからのプロトプラストの生成

出典: Wen、J.、Pasman、 他、 枯 草菌 胞子におけるゲルミノソームと内膜の視覚化。 J.Vis.エクスプション。...

細菌胞子の内膜における発芽タンパク質の可視化

ここでは、細菌の胞子発芽中に還元糖の存在を検出するための比色分析法について説明します。...

細菌胞子の発芽中に皮質断片を検出

このプロトコルは追跡による活力パラメーターと枯草菌胞子を低圧プラズマ治療後復活で DNA 修復プロセスの監視の関連性を評価するために必要な重要な連続した手順を示しています蛍光標識された DNA...

有害な効果の低圧プラズマ滅菌を使用して住んでいる携帯顕微鏡枯草菌胞子の生存に調査

例として枯草菌を使用して個々...

枯草菌の単一細胞マイクロ流体解析

細菌細胞のイメージングは、大きな高分子機械の機能を決定する静的および動的プロセスの定義に焦点を当てた新しいシステム生物学アプローチです。ここでは、定量的ライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の統合により、レジオネラ菌型肺炎球体系IV型分泌系のアーキテクチャと機能を研究しています。...

レジオネラ肺球菌ドット/Icm分泌系の空間的特徴を解決するためのライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の適用

微胞子虫寄生虫ネマトシダ・パリシイによるCaenorhabditis...

微胞子虫感染症の カエノラブディティス・エレガンス モデルにおける遺伝性免疫の研究

このプロトコルは、フローサイトメトリーとカウントビーズを使用して、エチジウムブロマイドで標識された細菌胞子を定量化することに焦点を当てています。この方法は、無傷の胞子の表面におけるタンパク質の共有結合を分析するのにも効率的です。...

フローサイトメトリーにおける 枯草菌 胞子の計数と標識解析の改善

そのまま孤立ランゲンドルフ灌流マウス心臓における本論文では詳細解剖の手順を、楽器のセットアップ、および実験条件膜電位の光学マッピング（VM）の間と細胞内カルシウムトランジェント（CAT）。...

マウスの心臓の活動電位およびカルシウムトランジェントの光学的マッピング

学ぶ 枯草菌胞子におけるgerminosomeと内膜ドメインの可視化法。超高解像度構造照明顕微鏡（3D-SIM）を用いて、発芽受容体クラスターの局在を詳細に解析する手法を解説します。

Germinosomes と枯草菌胞子の内部の膜の可視化

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