イオン交換クロマトグラフィー (IEX) 蛋白質の分離とキャラクタリゼーションの多角度光散乱 (MALS) に結合

このプロトコルは、生命科学研究および医薬品開発における結果の一貫性と完全性に不可欠な、タンパク質の品質管理と特性評価、品質管理のための新しい方法であるイオン交換CALを提示します。イオン交換MALSは、タンパク質の純度、オリゴマー状態、均質性、同一性、同一性、構造構造、翻訳後修飾、およびその他の特性を決定します。測定は非破壊的であり、ほぼ生理学的緩衝条件下で溶液中で行われる。

この方法は、タンパク質またはペプチドのモル質量、オリゴマー状態、および結合の程度、例えば糖タンパク質を正確に決定する。膜タンパク質にも適用できる。IEXは、表面電荷によって高分子を分離します。

アニオン交換、AIEX、および陽イオン交換、CIEX、マトリックスは、それぞれ負および正に帯電した変異体に結合する。比較的近い質量または形状を共有するタンパク質集団間の細かい分離により、IEX-MALSは、混合物サンプル中の個々のタンパク質状態のモル質量を決定する。まず、0.1マイクロメートルのフィルターを使用して、洗浄および溶出バッファーを含むすべての試薬をフィルター処理します。

乾燥フィルターから微粒子を除去するために、最初の50〜100ミリリットルのバッファーを廃棄物ボトルにフィルターします。水を濾過して十分に洗浄し、ほこりが入るのを防ぐためにキャップされた清潔で無菌のボトルで、残りのバッファーをろ過します。pH-8 Trisバッファーと50ミリモルクロリドナトリウムを使用して、BSAサンプルを1ミリリットル当たり6ミリグラムに希釈し、pHとイオン強度がイオン交換カラムに結合できるようにします。

注射器を使用して、良質のMALS分析を達成するために、少なくとも0.3〜0.5ミリグラムのBSAを1ミリリットルのカラムに注入します。イオン交換 MALS 実験を開始するには、MALS ソフトウェアで [新規] を開き、メソッドから実験を行い、光散乱システム メソッド フォルダからオンラインメソッドを選択します。DLS モジュールが使用可能で、DLS データを取得する場合は、光散乱の 「QELS を使用する」サブフォルダーからオンライン方式を選択します。

パラメータを設定するには、[設定]セクションで、[汎用ポンプ]セクションの実行の流量を、FPLCで使用される流量を毎分1.5ミリリットルに設定します。[ソルベント]セクションで、バッファ パラメータを入力または確認します。インジェクタセクションの下に、BSA としてタンパク質名を入力し、屈折率増分を 1 グラムあたり 0.185 ミリリットル、波長 280 ナノメートルの UV の絶滅係数を 1 センチメートル当たり 0.66 リットルとして入力します。

[サンプル] タブで、タンパク質サンプルの濃度を 1 ミリリットル当たり 6 ミリグラムと入力し、サンプル量を 170 マイクロリットルとして挿入します。[手順] セクションの [基本コレクション] タブで、[自動挿入時にトリガー] チェック ボックスをオンにし、勾配が最終的な値に達した後、データ収集が少なくとも 5 分間継続されるように、実行の継続時間を 70 ミリリットルに設定します。次に、FPLC ソフトウェアで、メソッド エディタ タブで新しい実験を作成します。

最初の実験では塩またはpHの線形勾配を作成し、最適化された方法では、原稿に従ってより具体的なグラデーションまたは段階的なプログラムを作成します。MALS ソフトウェアでデータ収集をトリガーする方法にパルス信号を含めます。次いで、ポンプバルブを開き、0.5モルの水酸化ナトリウムで洗浄し、強く結合した不純物を除去し、続いて中和緩衝液洗浄を行う。

次いで、TrisバッファpH 8、洗浄バッファ付きのAバルブ、溶出バッファ付きBバルブでカラムを洗浄します。低塩濃度の洗浄バッファーをカラムをすすくう最終洗浄として使用し、カラムマトリックスへのタンパク質の結合を可能にする。サンプル注入前、洗浄後、溶出終了時に、光散乱基線を安定化して低ノイズと完全に純粋な希釈を保証する必要があります。

シリンジを使用して、タンパク質サンプルをループに入れる。まず、実行ボタンをクリックして MALS ソフトウェアで実験を開始し、次に FPLC ソフトウェアで実験を開始します。データは、MALS検出器を介してFPLC機器からパルス信号を受信した後に収集されます。

イオン交換 MALS がスタンドアロン方式ではなく連続フロー モードで手動で実行される場合は、前述のとおり、実行と命令のパラメータを同じに適用します。最終的な方法を検証して実行したら、サンプルではなくバッファをロードして、空白の注入を使用してまったく同じ方法を実行します。自動注入パルスとブランクランの勾配との間のタイミングが、サンプル実行のタイミングと同じである事が重要です。

解析を開始するには、MALS ソフトウェアの「手順」セクションで、「脱呼吸」タブと「標準」レベルを使用してクロマトグラムを滑らかにします。ノイズが多い場合は、レベルを[ヘビー]に設定します。ベースラインビューで、LS、UV、RI検出器を含むすべての信号のベースラインを定義します。

ピークビューで、解析のピークを定義します。各ピーク下のタンパク質の RI インクリメント値 dn/dc および UV の絶滅係数の正しい値を確認します。[光散乱からのモル質量と半径]ビューで、Zimm モデルと適合度 0 を使用して、モル質量と半径を解析します。

QELS が使用可能な場合は、QUELS ビューから Rh の下で、相関関数の Rh 値と適合の質を観察します。塩濃度の上昇により、イオン交換MALSの実行中にRI信号が大きく変化します。ブランクインジェクションからベースラインシグナルを差し引くには、タンパク質とブランクイオン交換MALS実験の両方を開きます。

タンパク質実験名を右クリックし、[適用方法]を選択して、ファイルダイアログからベースライン減算フォルダを選択します。標準モル質量分析のオンライン方法を選択します。ベースライン減算ビューで、「空白をインポート」をクリックして、空白の実行のシグナルをインポートします。

[インストゥルメント]で、減算する検出器をすべてチェックします。BSA モノマーでイオン交換 MALS システムをキャリブレーションするには、手順と構成ビューでピークを調整します。正規化ビューで、正規化を実行するには Rg 値として 3.0 ナノメートルを入力します。

次に、[同じ設定]タブの[帯域の広がり]でピークを選択し、[フィットを実行]ボタンを使用して、UV信号とLS信号をRI信号に一致させます。結果のグラフは、結果フィッティングビューに表示されます。グラフを右クリックし、[編集]を選択して[詳細]ボタンをクリックして、軸スケールやその他のグラフパラメータを変更します。

表示オプションを追加するには、[EASI グラフ]タブを選択し、[表示]ドロップダウン メニューのウィンドウの上部で、[モル質量]、[Rh Q.All]の各結果(モル質量、半径、純度レベルなど)を選択し、[結果]セクションの下のレポート ビューで使用できます。[レポート デザイナー] ボタンを使用して、レポートに結果やパラメーターを追加します。本実験では、BSAをイオン交換用MALSで、アニオン交換分析カラムを用いて分析した。

クロマトグラムは、280ナノメートルで紫外線を表示し、光散乱を90度の角度で、屈折率、および導電率曲線を各ピークのモル質量と共に表示した。75ミリモルから350ミリモルの塩化ナトリウムまでの30カラムの体積からなる広い線形勾配は、二量体および高いオリゴマーからBSAモノマーを分離した。下流のMALS分析の結果、計算された単量体モル質量は66.8キロダルトン、計算された二量モル質量は130キロダルトンであった。

溶出したピークでの緩衝伝導率に基づいて、勾配を別のプログラムに変更し、175ミリモル塩化ナトリウムの長いステップ、続いて175ミリモルから500ミリモル塩化ナトリウムまでの線形勾配を行った。新しい勾配は解像度を大幅に改善し、BSAモノマーと高オリゴマー種との間に優れた分離を生み出した。200ミリモルと250ミリモルの塩化ナトリウムの段階的なプログラムは、高オリゴマー種にも焦点を当てるために適用されました。

BSAモノマー、ダイマー、トリマーの間で優れた分離が得られました。この手順に従って、質量分析、SDS-PAGE活性および安定性試験などの方法を、イオン交換によって分離された各バリアントに対して実行して、それぞれを同定し、さらに特徴付けることができる。イオン交換MALSは、SEC-MALSでは完全に分析できないサンプルにMALS分析の力を拡張することを発見しました。

電荷による分離は、SECで一貫性を持つ異なる種を解決します。