Name: 神経疾患におけるリピドミクスとトランスクリプトミクス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学ぶ神経疾患におけるリピドミクスとトランスクリプトミクスのモジュール式プロトコル。マウス脳組織と血漿を用いて、脂質とRNAの同時抽出・定量解析を行い、炎症と神経活動に関与する脂質シグナリングの分子メカニズムを解明する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この記事は、エルメリンダ・ロマッツォ博士に捧げます。この原稿の完成中に、エルメリンダ・ロマッツォ博士が亡くなりました。彼女は科学への情熱と、有意義な研究目的を果たすためのチームワークへの無私の関与の具現化です。彼女は常に人間のより大きな幸福に有意義に貢献することを夢見ていました。彼女の善良な性質は、科学と生命の激しい道によって決して損なわれませんでした。彼女は私たちの心の中で、そして永遠に、かけがえのない存在であり続けるでしょう。
Julia M. Postは、ヨハネス・グーテンベルク大学マインツの大学医療センターのFocus Program for Translational Neuroscience(FTN)から資金提供を受け、現在はLBへのSPP-2225 EXITプロジェクトから資金提供を受けています。これらの研究のための部分的な資金は、リピドミクスコアファシリティ、生理化学研究所、およびヨハネスグーテンベルク大学マインツの大学医療センターから(LBへの)壁内資金によって提供されました。

<ol><li>Aronica, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammatory+targets+and+treatments+for+epilepsy+validated+in+experimental+models%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammatory targets and treatments for epilepsy validated in experimental models.</a> Epilepsia. 58, 27-38 (2017).</li>
<li>Lerner, R., Post, J., Loch, S., Lutz, B., Bindila, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+brain+and+peripheral+plasticity+of+the+lipidome+in+acute+kainic+acid-induced+epileptic+seizures+in+mice+via+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Targeting brain and peripheral plasticity of the lipidome in acute kainic acid-induced epileptic seizures in mice via quantitative mass spectrometry.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (2), 255-267 (2017).</li>
<li>Schuhmann, K., Almeida, R., Baumert, M., Herzog, R., Bornstein, S. R., Shevchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+lipidomics+on+a+LTQ+Orbitrap+mass+spectrometer+by+successive+switching+between+acquisition+polarity+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes.</a> Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).</li>
<li>Puppolo, M., Varma, D., Jansen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+analytical+methods+for+eicosanoids+in+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%3A+Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">A review of analytical methods for eicosanoids in brain tissue.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 964, 50-64 (2014).</li>
<li>Blewett, A. J., Varma, D., Gilles, T., Libonati, J. R., Jansen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+high-performance+liquid+chromatography-electrospray+mass+spectrometry+method+for+the+simultaneous+determination+of+23+eicosanoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry method for the simultaneous determination of 23 eicosanoids.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 46 (4), 653-662 (2008).</li>
<li>Lerner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+lipidomic+and+transcriptomic+profiling+in+mouse+brain+punches+of+acute+epileptic+seizure+model+compared+to+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls.</a> Journal of Lipid Research. 59, 283-297 (2017).</li>
<li>Lerner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+lipidomic+and+transcriptomic+profiling+in+mouse+brain+punches+of+acute+epileptic+seizure+model+compared+to+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls.</a> Journal of Lipid Research. , 1-48 (2018).</li>
<li>Lévesque, M., Avoli, M., Bernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+temporal+lobe+epilepsy+following+systemic+chemoconvulsant+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 260, (2016).</li>
<li>Eyo, U. B., Murugan, M., Wu, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia-Neuron+Communication+in+Epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia-Neuron Communication in Epilepsy.</a> Glia. 65 (1), 5-18 (2017).</li>
<li>Zhu, J., Zheng, X. Y., Zhang, H. L., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kainic+acid-induced+neurodegenerative+model%3A+Potentials+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Kainic acid-induced neurodegenerative model: Potentials and limitations.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 457079(2011).</li>
<li>Park, S. H., Sim, Y. B., Kim, C. H., Lee, J. K., Lee, J. H., Suh, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+%CE%B1-CGRP+in+the+regulation+of+neurotoxic+responses+induced+by+kainic+acid+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Role of α-CGRP in the regulation of neurotoxic responses induced by kainic acid in mice.</a> Peptides. 44, 158-162 (2013).</li>
<li>Lerner, R., Cuadrado, D. P., Post, J. M., Lutz, B., Bindila, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+lipidomic+and+transcriptional+changes+of+prophylactic+PEA+administration+in+control+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Broad lipidomic and transcriptional changes of prophylactic PEA administration in control mice.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 527(2019).</li>
<li>Post, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiepileptogenic+Effect+of+Subchronic+Palmitoylethanolamide+Treatment+in+a+Mouse+Model+of+Acute+Epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Antiepileptogenic Effect of Subchronic Palmitoylethanolamide Treatment in a Mouse Model of Acute Epilepsy.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, (2018).</li>
<li>Schauwecker, P. E., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+determinants+of+susceptibility+to+excitotoxic+cell+death%3A+Implications+for+gene+targeting+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genetic determinants of susceptibility to excitotoxic cell death: Implications for gene targeting approaches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (8), 4103-4108 (2002).</li>
<li>Monory, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Endocannabinoid+System+Controls+Key+Epileptogenic+Circuits+in+the+Hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Endocannabinoid System Controls Key Epileptogenic Circuits in the Hippocampus.</a> Neuron. 51 (4), 455-466 (2006).</li>
<li>Konsman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">The mouse Brain in Stereotaxic Coordinates.</a> Psychoneuroendocrinology. 28 (6), (2003).</li>
<li>Spijker, S. Dissection of Rondent Brain Regions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpijker%2C+S+%22Neuroproteomics%22">Neuroproteomics</a>. Li, K. W. 57, 13-27 (2011).</li>
<li>Gross, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+lipidomics+through+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">The evolution of lipidomics through space and time.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (8), 731-739 (2017).</li>
<li>Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+advances+in+shotgun+lipidomics+for+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine.</a> Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).</li>
<li>Abbott, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+high-throughput+lipid+extraction+method+for+the+analysis+of+human+brain+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">An improved high-throughput lipid extraction method for the analysis of human brain lipids.</a> Lipids. 48 (3), 307-318 (2013).</li>
<li>Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+extraction+by+methyl-tert-butyl+ether+for+high-throughput+lipidomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics.</a> Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).</li>
</ol>

著者らは利益相反がないと宣言しています。

ここで説明する神経リピドミーおよびトランスクリプトーム方法論は、脳および末梢器官におけるあらゆる疾患または健康な発達を高および低空間分解能で調査するための実行可能な手段である。最適化された血漿サンプリングおよび取り扱い手順により、組織リピドミクスおよびトランスクリプトミクスのために屠殺されたのと同じ動物から血漿リピドミクス分析を行うこともできるため、組織血液分子相関およびバイオマーカー発見の信頼性が向上する。3つのプロトコルまたはそれらの組み合わせのいずれかの適用による広範なデータセットの提供は、文脈(動物モデル実験)内の神経学的疾患だけでなく、実験モデルコンテキスト全体および実験モデルコンテキスト間でも調査する価値がある。さらに、サンプリング、処理、分子分析の高度な標準化により、分子データの再現性が高くなり、研究や研究室内および研究や研究室内の分子変化を確実に参照できます。
しかし、これを達成するためには、定義された研究目標に対して最大の読み出し可能性を提供する実験計画のセットアップが重要です。実験群間の分子変化の信頼できる比較を達成するためには、動物の変動性と脂質レベルの生物学...

近年の脂質の機能の進歩と神経疾患の発症・進行における脂質の役割は、新たな治療標的や疾患メカニズム解明の新たな研究開発の場を切り拓いています1。質量分析イメージングや高度な質量分析プロファイリングなどの現代の分子イメージング技術によって強調された、異なる脳領域における脂質組成の文書化された違いは、脂質調査のパラダイムを全脳から機能的に別個の脳領域へとシフトさせる。脂質組成が異なる脳領域で変化するという事実は、機能的に異なる脳領域にわたる脳の侮辱または刺激に応答して、膜脂質感受性および下流脂質シグナル伝達の両方の新しい概念化を促す。したがって、脂質プロトコルは、より高い空間分解能の検出および定量化のための低組織量の課題に対処するための新しい開発を必要とし、同時に、細胞膜およびシグナル伝達経路の複数の脂質成分の分析を必要とする。また、それらのレベルおよび機能の調節に関与する酵素、脂質リガンド、および受容体の決定は、神経学的疾患において影響を受けるシグナル伝達経路を解明し、病態生理学的文脈における新しい機構的研究を導くために最も重要である。
脳の空間分解能の向上に加えて、新しい神経リピドミーアプローチの開発に挑戦する2つの大きな困難があります。第1に、脂質シグナル伝達分子は、典型的には、膜構成脂質と比較して非常に低い存在量のものである。第2に、リピドームは高い構造的不均一性を示し、単一の分析アプローチを用いて解剖することは困難である。したがって、抽出および分析方法は、異なる脂質カテゴリーに合わせて調整され、異なる組織サンプルで一般的に実行されます。2.ショットガンリピドミクス法3 膜脂質の広範なプロファイルを迅速に明らかにするための優れたツールであり、標的化された発見および定量化質量分析法によってもたらされる感度および選択性の増加は、i)炎症性脂質およびii)エンドカンナビノイド(eCB)、アミノ酸結合脂質などのニューロン活性の調節に関与する脂質を含む、低豊富シグナル伝達脂質の調査に利用され、 等。4,5.神経学的疾患モデルの脳領域において生じる細胞膜およびシグナル伝達レベルの両方における脂質変化を包含するために、典型的には、脂質抽出および分析は、別個の組織試料において、別個の動物バッチから、または異なる半球から得られ、またはより大きな組織領域を複数の断片に解剖することによって行われる。酵素受容体のmRNAレベルも興味深い場合、それらの調査は通常、別個の組織サンプルの調達を必要とする。例えば、膜脂質、内因性カンナビノイド、およびmRNAの調査には、3つの異なる組織サンプル(例えば、2つの脂質抽出方法(膜脂質およびシグナル伝達脂質)のための2つのサンプル、およびその後の2つの脂質分析方法およびmRNA分析のための1つのサンプル)が必要である。炎症性脂質および内因性カンナビノイドの調査には、それぞれ2つの異なる組織サンプル、抽出方法、および分析方法が必要です。別の例は、脳パンチまたはレーザー微小解剖サンプル中のmRNAおよび脂質カテゴリーの調査であり、その結果、脳(サブ)領域ごとに2つのサンプルを調達するために2つの異なる動物が必要である。このような場合、結果の実質的な程度の変動性および/または再現性の悪さが、生物学的変動性および/または組織の不均一性に起因することが多い。特に脳内で高い空間分解能で起こる多分子分析のこれらの実用的な限界に導かれて、1)LC/MRMによる炎症性脂質(例えば、エイコサノイド(eiCs))およびeCBなどのニューロン活動の調節に関与する脂質の共抽出および共分析を含む3モジュールのニューロリピドミクスプロトコルが設計されました。2;2)リン脂質(PL)とeCBの共抽出とその後のマルチスキャンLC/MRMおよび前駆体/中性損失スキャン分析2;3)膜(リン)脂質およびeCBならびにmRNAの二重抽出、その後のLC/MRMおよびqPCRまたはRNAシーケンシング分析6.神経学的疾患および関心のある脳領域において対処されるべき生物学的問題に応じて、第1および第2のプロトコル、または第1および第3のプロトコルの組み合わせを、約4mgの重さの組織について同じ組織標本に適用することができる。第1および第3のプロトコールは、2mg前後の組織に対して独立して適用することができる。第2のプロトコルは、わずか0.5mgの重さの組織に適用することができる。選択された神経リピドームプロトコルモジュールに関係なく、組織サンプリングおよび前分析処理、脳単離および領域解剖、ならびに動物モデルを犠牲にする手順は、プロトコルの3つのモジュールすべてについて標準化され、同一である。神経学的疾患の調査では、疾患の病理学的結果に関連する末梢器官も常に収集され、これらのモジュラープロトコルを使用して分析されます。さらに、血漿リピドミクスのために血液が定期的にサンプリングされ、将来の翻訳アプリケーションの観点から神経学的疾患の読み出しツールとして機能します。ここで提示されたモジュラーリピドミクスプロトコルは非常に汎用性が高く、より大きな組織量に拡張可能であり、事実上あらゆる組織タイプおよび疾患に容易に適用可能である。モジュラープロトコル(図1)神経学的疾患において、外傷性脳損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、またはてんかんなどの神経学的障害の発症および進行の任意の標準化されたげっ歯類モデルが許容される。
これらのプロトコルは、ヒト側頭葉てんかん(TLE)8,9,10,11に類似しているため、前臨床試験で広く使用されているてんかんのカイニン酸(KA)誘導マウスモデルにおけるてんかんの急性期における組織リピドームおよび/またはトランスクリプトームの変化の研究に広く適用されている2,7。これらのプロトコールを用いて、パルミトイルエタノールアミド(PEA)12,13などの薬物の治療可能性を、てんかんの同じマウスモデルにおいて評価した。この研究では、脳および末梢における高分解能および低空間分解能での脂質およびmRNAの変化、最大急性発作強度の時点(発作誘発後60分)、およびKA発作誘発後の4つの異なる時点(20分、60分、120分、および180分)におけるPEAによる亜慢性および急性治療時、てんかんの急性期をカバーする時間窓が同定された。未処理のKA注射マウス、急性および亜慢性PEA処置マウス、ならびにビヒクルおよびPEAビヒクル対照マウスの血漿、脳、および末梢器官を、各時点で収集し12、13、およびこの分子分析を用いて調査した。分子データは、急性てんかん期の進行およびそれを緩和するPEAの可能性を解明するために、発作スコアリングによって得られた行動表現型、ならびに神経変性プロセスに関する免疫組織化学由来のデータと相関していた。

<table><tbody><tr><td>12(S)-HETE</td><td>Biomol</td><td>Cay10007248-25</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>12(S)-HETE-d8</td><td>Biomol</td><td>Cay334570-25</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>1200 series LC System</td><td>Agilent</td><td></td><td>Instrumentation/LCMS</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td>Instrumentation/qPCR</td></tr><tr><td>5(S)-HETE-d8</td><td>Biomol</td><td>Cay 334230</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>ABI7300 リアルタイム PCR サイクラー</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>Instrumentation/qPCR</td></tr><tr><td>アセトニトリル LC-MS Chroma Solv</td><td>Honeywell</td><td>9814920</td><td>溶剤/LCMS</td></tr><tr><td>琥珀色 エッペンドルフチューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td>サンプル調製</td></tr><tr><td>Analyst 1.6.2 ソフトウェア</td><td>AB SCIEX, ダルムシュタット</td><td></td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>分析天びん</td><td>メトラー・トレド</td><td></td><td>計装/サンプル調製</td></tr><tr><td>Arachidonic Acid-d8 MS Standard</td><td>Biomol</td><td>Cay-10007277</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>Bessmann Tissue Pulverizer</td><td>Spectrum Laboratories, Inc. (ブレダ、オランダ)</td><td></td><td>装置/サンプル調製</td></tr><tr><td>Bino</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Microscopy</td></tr><tr><td>cleaved Caspase 3 antibody</td><td>Cellsignaling</td><td>9661S</td><td>Microscopy Cryostat</td></tr><tr><td>, Leica CM3050 S</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>Instrumentation/Sample prep.</td></tr><tr><td>CTC HTC PAL オートサンプラー</td><td>CTC Analytics AG</td><td></td><td>Instrumentation/LCMS</td></tr><tr><td>Dumont Curved Forceps Dumoxel #7</td><td>FST</td><td>11271-30</td><td>Surgical Tools</td></tr><tr><td>Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2)</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td>Surgical Tools</td></tr><tr><td>EDTA 1000 A R&ouml;hrchen</td><td>Kabe Labortechnik</td><td>078001</td><td>サンプル調製</td></tr><tr><td>EP-1 EconoPump</td><td>BioRAD</td><td>700BR07757</td><td>装置/サンプル調製</td></tr><tr><td>ファイン鉗子ミラーフィニッシュ</td><td>FST</td><td>11412-11</td><td>手術器具</td></tr><tr><td>細かい虹彩はさみ まっすぐで鋭い</td><td>FST</td><td>14094-11</td><td>手術器具</td></tr><tr><td>細かいはさみ 炭化タングステンストレート</td><td>FST</td><td>14568-09</td><td>手術器具</td></tr><tr><td>虹彩へら</td><td>FST</td><td>10094-13</td><td>手術器具</td></tr><tr><td>カイニン酸</td><td>Abcam</td><td>ab120100</td><td>てんかん薬</td></tr><tr><td>脂質表示ソフトウェア</td><td>AB SCIEX, ダルムシュタット</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア LPC 17:0</td><td>アヴァニス ポラリス</td><td>855676P</td><td>脂質標準</td></tr><tr><td>LPC 18:0</td><td>アヴァニス ポラリス</td><td>855775P</td><td>脂質</td></tr><tr><td>標準 ルナ 2,5&micro;m C18(2)- HAST 100A LCカラム</td><td>Phenomenex</td><td>00D-4446-B0</td><td>計装/LCMS</td></tr><tr><td>拡大ランプ</td><td>Maul GmbH</td><td></td><td>計装/サンプル調製.</td></tr><tr><td>メタノール LC-MS Chroma Solv 99.9%</td><td>Honeywell</td><td>9814920</td><td>Solvent/LCMS</td></tr><tr><td>Motic Camara</td><td>Motic</td><td></td><td>Microscopy</td></tr><tr><td>MTBE</td><td>Honeywell</td><td>34875-1L</td><td>Solvent/</td></tr><tr><td>LCMS MultiQuant 3.0 quantitation software package</td><td>AB SCIEX, Darmstadt</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>インスツルメンテーション/qPCR</td></tr><tr><td>PA 16:0-18:1</td><td>アバニスポラリス</td><td>840857P</td><td>脂質標準</td></tr><tr><td>PA 17:0-14:1</td><td>アバニスポラリス</td><td>LM-1404</td><td>脂質標準</td></tr><tr><td>パルミトイルエタノールアミド</td><td>バイオモール</td><td>Cay90350-100</td><td>脂質標準パル</td></tr><tr><td>ミトイルエタノールアミド-d5</td><td>バイオモール</td><td>Cay9000573-5</td><td>脂質標準</td></tr><tr><td>PC 16:0-18:1</td><td>アバニスポラリス</td><td>850457P</td><td>脂質標準</td></tr><tr><td>PC 16:0-18:1</td><td>アバニスポラリス</td><td>850457P</td><td>脂質標準</td></tr><tr><td>PC 17:0-14:1</td><td>アバニスポラリス</td><td>LM-1004</td>脂質<td>標準</td></tr><tr><td>PE 16:0-18:1</td><td>アバニスポラリス</td><td>850757P</td><td>脂質標準</td></tr><tr><td>PE 17:0-14:1</td><td>アバニスポラリス</td><td>LM-1104</td>脂質<td>標準</td></tr><tr><td>PG 16:0-18:1</td> ア<td>バニスポラリス</td><td>840457P</td><td>脂質標準</td></tr><tr><td>PG 17:0-14:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>LM-1204</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>PI 17:0-14:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>LM-1504</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>Precelleys 24</td><td>Peqlab</td><td></td><td>機器/サンプル調製。</td></tr><tr><td>Precellys Keramik-K&uuml;ゲルヒェン</td><td>Peqlab</td><td>91-pcs-ck14p</td><td>サンプル調製。</td></tr><tr><td>Precellys Stahlkugeln 2,8mm</td><td>Peqlab</td><td>91-PCS-MK28P</td><td>サンプル調製。</td></tr><tr><td>Precellys-keramik-kit 1,4 mm</td><td>VWR</td><td>91-PCS-CK14</td><td>サンプル調製。</td></tr><tr><td>プロスタグランジンD2</td><td>Biomol</td><td>Cay 12010</td><td>脂質標準</td></tr><tr><td>プロスタグランジンD2-d4</td><td>Biomol</td><td>Cay 312010</td><td>脂質標準</td></tr><tr><td>プロスタグランジンE2</td><td>Biomol</td><td>Cay10007211-1</td><td>脂質標準</td></tr><tr><td>プロスタグランジンE2-d9</td><td>Biomol</td><td>Cay10581-50</td><td>脂質標準</td></tr><tr><td>PS 17:0-14:1</td><td>アヴァニスポラリス</td><td>LM-1304</td><td>脂質標準</td></tr><tr><td>Qトラップ5500トリプル四重極リニアイオントラップ MS</td><td>AB SCIEX</td><td></td> AU111609004 <td>装置/LCMS</td></tr><tr><td>リアルタイムPCRシステム</td><td>アプリケーション バイオシステム</td><td></td><td>装置/qPCR</td></tr><tr><td>レゾルビン D1</td><td>Biomol</td><td>Cay10012554-11</td><td>脂質標準</td></tr><tr><td>Rneasy ミニキット - RNAase-Free DNase Set (50)</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>Sample Prep.</td></tr><tr><td>警備員 プレカラム</td><td>フェノメネックス</td><td></td><td>計装/LCMS</td></tr><tr><td>シャンドン カバープレート</td><td>サーモフィッシャー</td><td>72110017</td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>シャンドン スライドラックと蓋</td><td>サーモフィッシャー</td><td>73310017</td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>SM 18:0</td><td>アヴァニス ポラリス</td><td>860586P</td><td>脂質標準</td></tr><tr><td>SM d18:1/12:0</td><td>アバニス ポラリス</td><td>LM-2312</td><td>脂質標準</td></tr><tr><td>標準鉗子ストレートスムース</td><td>FST</td><td>11016-17</td><td>外科用ツール</td></tr><tr><td>外科用はさみToughCut標準パターン</td><td></td><td>FST14130-17</td><td>外科用ツール</td></tr><tr><td>T3000サーモサイクラー</td><td>バイオメトラ</td><td></td><td>インスツルメンテーション/ qPCR</td></tr><tr><td>トロンボキサンB2</td>バイオ<td>モール</td><td>Cay19030-5</td>脂質<td>標準トロン</td></tr><tr><td>ボキサンB2-D4</td>バイオ<td>モル</td><td>Cay319030-25</td><td>脂質標準</td></tr><tr><td>Tissue Lyser II</td><td>Qiagen/ Retsch</td><td>12120240804</td><td>装置/サンプル調製</td></tr><tr><td>Tissue Tek</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td>顕微鏡<td>検査</td></tr><tr><td>Toluidinblau</td><td>Roth</td><td>0300.2</td>顕微鏡<td>検査</td></tr><tr><td>Vapotherm</td><td>Barkey</td><td>4004734</td><td>Instrumentation/Sample prep.</td></tr><tr><td>Wasser LC-MS Chroma Solv</td><td>VWR</td><td>9814920</td><td>溶剤/LCMS</td></tr></tbody></table>

神経疾患におけるリピドミクスとトランスクリプトミクス

Lipidomics and Transcriptomics in Neurological Diseases

脂質は、神経学的疾患を助長する脳の侮辱または刺激に対する主要なインターフェースとして機能し、疾患の発症および進行を強調することができる様々なシグナル伝達またはリガンド機能を有する脂質の合成のための貯蔵庫である。多くの場合、未症候性レベルで変化する脂質は、薬物標的およびバイオマーカーの新たな供給源である。多くの神経学的疾患は、神経炎症、神経変性、および神経細胞興奮性を共通の特徴として示し、部分的には特定の脂質シグナル伝達系によって調節される。様々な脂質の合成の相互依存性および相互関係は、神経学的文脈の共通性および特異性を導き出し、疾患の発症および進行の機構的側面の解明を促進するために、多脂質、多酵素、および多受容体分析を促す。脂質の役割を異なる脳領域に帰属させることは、神経学的疾患に関連する脂質分子表現型および形態の決定を前進させる。
ここでは、膜脂質および下流脂質シグナルの分析に適したモジュラープロトコルを、その機能の根底にある酵素およびメディエーターのmRNAとともに、特定の神経学的疾患および/または状態に関連する個別の脳領域から抽出する。正確な比較リピドミープロファイリングを確実にするために、ワークフローと操作基準は、i)関心領域の脳サンプリングと解剖、ii)複数の脂質シグナルと膜脂質の共抽出、iii)二重脂質/mRNA抽出、iv)液体クロマトグラフィー多重反応モニタリング(LC / MRM)による定量、およびv)標準mRNAプロファイリングのために最適化され標準化されました。このワークフローは、機能的に離散的な脳サブ領域のサンプリング(すなわち、脳パンチングによる)によって得られる低組織量に対して順応性であり、したがって、組織の不均一性および/または動物の変動性による多分子分析におけるバイアスを防止する。神経疾患の末梢結果を明らかにし、神経学的疾患状態の翻訳分子読み出しを確立するために、末梢器官サンプリング、プロセシング、およびその後のリピドミクス分析、ならびに血漿リピドミクスも追求され、記述される。このプロトコルは、急性てんかんマウスモデルで実証される。

記載されたプロトコルのセットは、動物モデルの選択、サンプリングの経路、抽出およびプロファイリングの方法など、目的に固有の方法で異なるレベルで組み合わせることができる(図1)。
急性てんかん発作状態の経時変化に伴う脳および末梢の脂質レベル変化を決定し、PEAの潜在的な抗てんかん効果13 および脳および末梢のリピドーム変化への影響を解明するために、3つの実験動物群をビヒクル、急性てんかんを誘導するKA、抗てんかん薬候補としてPEAで処理した。PEAは、KA注射の前にi.p.を介して投与された(例えば、急性治療のための単一のPEA注射および亜慢性治療のための2つのPEA注射)。治療後5日目の多重分子解析および/または免疫組織化学染色を目的として、必要に応じて動物実験を繰り返した(図2)。</p...

この記事では、炎症およびニューロン活性の根底にある脂質、膜脂質、下流メッセンジャー、および脂質機能の根底にあるmRNAコード酵素/受容体を標的とする神経疾患マウスモデルにおける組織リピドミクスおよびトランスクリプトミクス、および血漿リピドミクスのためのモジュラープロトコルを提示する。サンプリング、サンプル処理、抽出、および定量の手順が概説されています。

Lipids serve as the primary interface to brain insults or stimuli conducive to neurological diseases and are a reservoir for the synthesis of lipids with ...

このモジュラープロトコルにより、構造的およびシグナル伝達脂質、および/またはRNAによってレンダリングされた複数の分子事象を、控えめな組織領域および血液中で探索することが可能になり、サンプル試料あたりの定量的および定性的データ出力が改善されます。この方法は、任意の実験モデルに適用可能であり、ヒト組織標本および血液にも適用することができる。手順を実演するのは、技術者のクラウディア・シュヴィッター、大学院生のジュリア・ポスト、そして私のグループのポスドクであるライッサ・ラーナーです。開始するには、急性および予防的に治療されたカイニン酸誘発てんかんを有するマウスの以前に単離された、全体、凍結された脳を採取する。クライオスタットの取り付けシステムに脳を取り付けます。厚さを50マイクロメートルに設定し、関心領域の近くでトリムモードで脳をスライスします。関心領域に近づいたら、厚さを 18 ~ 20 マイクロメートルに設定します。関心のある部分領域を局在化するために、トルイジンブルーを用いて脳スライスを染色する。顕微鏡を使用して染色されたスライスを検査してパンチする関心領域を特定し、マウスアトラスを基準として使用して適切な脳解剖学的領域を見つけます。サンプルコアラーを使用して、直径0.8〜1.0ミリメートルのパンチを採取します。エンドカンナビノイドとエイコサノイドの共抽出用のパンチを、チューブあたり7つの予冷スチールボールを備えた予冷された2ミリリットルのアンバーチューブに移します。リン脂質とエンドカンナビノイドの共抽出、二重脂質とRNAの共抽出の場合は、セラミックビーズでパンチを2ミリリットルのRNaseフリー抽出チューブに移します。冷蔵室で凍結パンチの重量を量り、すぐに抽出を進めるか、摂氏80度で凍結します。脳片、パンチ、または組織粉末サンプルからエンドカンナビノイドおよびエイコサノイドの液液脂質共抽出を行うには、組織サンプルおよび7つの鋼球を含む抽出チューブを氷上に置く。内部標準物質を含む600マイクロリットルの氷冷MTBEおよび50マイクロリットルのアセトニトリル水を加える。400マイクロリットルの0.1モルのギ酸を加えた後、組織溶解剤を使用して30秒〜1分間均質化する。このホモジネートを摂氏4度で5,000倍gで15分間遠心分離する。それを摂氏80度で10分間冷凍庫に入れて、水性下相を凍結させ、上部有機相の移動を容易にする。上部有機相を新しい1.5ミリリットルのアンバーチューブに移し、摂氏37度で穏やかな窒素流下で10分間蒸発させた後、さらなる分析のために50マイクロリットルのアセトニトリル水で再構成する。水相を摂氏20度または80度に保存して、さらなるタンパク質含有量分析を行う。血漿サンプルからエンドカンナビノイドとエイコサノイドを共抽出するには、凍結した血漿サンプルを氷の上に置き、完全に解凍させます。800マイクロリットルのMTBEおよび50マイクロリットルのアセトニトリル水を加え、参照血漿サンプルを使用したスパイク用に最適化された内部標準を含む。600マイクロリットルの0.1モルのギ酸を加え、摂氏4度で2分間渦を加える。サンプルを4, 000倍gで4°Cで15分間遠心分離する。有機相を新しいチューブに移す。摂氏37度の穏やかな窒素気流下で蒸発させ、液体クロマトグラフィーの多重反応モニタリング分析のために50マイクロリットルのアセトニトリル水で再構成します。脳領域、パンチ、または他の組織粉末サンプルからリン脂質およびエンドカンナビノイドの共抽出を行うには、組織サンプルおよびセラミックビーズを含む抽出チューブを氷上に置く。800マイクロリットルのメチルtert−ブチルエーテルおよびメタノール混合物および内部標準物質を含む10マイクロリットルのメタノールを加える。次に、25マイクロモルのテトラヒドロリプスタチン/ URB597および50マイクログラム/BHTを含む200マイクロリットルの0.1%ギ酸を加える。組織ホモジナイザーでホモジナイズした後、5,000倍gおよび4°Cで15分間遠心分離する。上部有機相を新しいチューブに移し、摂氏37度の穏やかな窒素流下で蒸発させ、この脂質抽出物を90マイクロリットルのメタノールで再構成する。すぐに進行する場合は、脂質抽出物のアリコートに10%の水を加え、リン脂質分析のためにLC/MSに10マイクロリットルを注入する。さらなるエンドカンナビノイド分析のために、次のステップに進みます。脂質抽出物のアリコートを取り、蒸発乾固させ、アセトニトリル水中で再構成する。組織サンプルからのRNAおよび脂質の二重抽出およびリン脂質およびエンドカンナビノイドの共抽出を行うには、組織粉末アリコートまたは脳房を摂氏4度で融解する。セラミックビーズで抽出チューブに組織を追加します。次に、600マイクロリットルのRLT緩衝液を200マイクロリットルのクロロホルムとともに加える。リン脂質とエンドカンナビノイドの共抽出では、10マイクロリットルの内部標準混合物でサンプルをスパイクし、20秒間高速で均質化します。均質化されたサンプルを新しい遠沈管に移し、全速力で摂氏4度で5分間遠心分離して相分離を可能にします。標準キットを使用してRNA抽出のために上相を新鮮なチューブに移す。抽出したRNAを50マイクロリットルのRNaseフリー水で溶出し、摂氏80度で保存する。脂質抽出のために、800マイクロリットルのMTBE/メタノールおよび200マイクロリットルの0.1%ギ酸をクロロホルム含有下の相に加える。摂氏4度で45分間渦を巻き起こす。上部有機相を新しいチューブに移す。摂氏37度の穏やかな窒素の流れの下でそれを蒸発させる。さらにLC/MS分析を行うには、サンプルを90マイクロリットルのメタノールで再構成し、20度または80°Cで保存するか、すぐに分析に進みます。さらなるエンドカンナビノイド分析のために、次のステップに進みます。脂質抽出物のアリコートを取り、蒸発乾固させ、アセトニトリル水中で再構成する。次に、エンドカンナビノイド分析のためにLC / MSに20マイクロリットルを注入する。急性てんかん発作のカイニン酸誘導は、注射後1時間の最大発作強度をもたらした。エンドカンナビノイドおよびエイコサノイド、ならびにリン脂質およびエンドカンナビノイドのリピドミープロファイリングは、カイニン酸誘発てんかんマウスおよび対照における大脳皮質、線条体、視床領域、海馬、視床下部、小脳ならびに心臓および肺組織にわたる脂質レベルの変化を示す。マウス脳パンチの定量的プロファイリングのためのリン脂質およびエンドカンナビノイドおよびRNAの二重抽出後、視床下部、側底側扁桃体、および腹側および背側海馬における脂質の定量的分布を分析した。脂質シグナル伝達に関与する内因性酵素および受容体の相対的発現レベル、ならびに脳活動のためのマーカーを、カイニン酸誘発てんかん発作に供したマウス由来の異なる脳領域および部分領域におけるmRNAレベルで調査した対照。カイニン酸誘発てんかんは、主に海馬のCA1、CA3、およびヒルス領域においてNeuNシグナルの大規模な損失を引き起こし、対照生理食塩水注射マウスと比較してカスパーゼ-3シグナルによって示されるアポトーシス事象を伴った。亜慢性パルミトイルエタノールアミドによる処理後、ニューロン核タンパク質シグナルは顕著に保存され、CASP3シグナルはほとんど検出できなかった。脳のパンチングと控えめな脳領域の解剖は非常に困難であり、複数のコホートにわたって一貫したサンプリングを得るためには細かいスキルが必要です。したがって、検査臓器での練習と脳の形態に関する十分な知識を強くお勧めします。

lipidomics-and-transcriptomics-in-neurological-diseases

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ミクログリアは中枢神経系の防衛と免疫監視の最初の行を提供するマクロファージを常駐しています。...

ノーマルCNSのリアルタイムPCRによると神経炎症時のミクログリアにおけるマイクロRNAの検出

私たちはここからmRNAおよび代謝物の抽出および精製するための手順について説明し...

転写産物および代謝物からの精製<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ヘッド

高品質の総RNAは、70%エタノールでAzure Bで脊髄部を染色した後、レーザー捕捉マイクロ解剖によってマウス脊髄運動ニューロンの細胞体から調製された。3,000~4,000個の運動ニューロンから十分なRNA(約40~60...

レーザー捕捉マイクロ解離によるマウス脊髄運動ニューロン細胞体からの転写解析のためのRNAの生成

このプロトコルは、in vivoでのCNSサンプルのtranslatomeを研究するためにポリリボソーム分画の本質的な変更を示している。これは、結合したRNA画分をリボソームへの全RNAの単離と比較を通じて翻訳と転写制御の全体的な評価が可能になります。...

ポリリボソーム画によって中枢神経系Translatomeの生体尋問中

我々は、高スループット、多重化を説明、およびプロテオミクス脳脊髄液（CSF）の臨床翻訳のための潜在的に開発されたアッセイをターゲットに。テストでは、このようなアポリポタンパク質Eバリアント（E2、E3およびE4）などの神経変性のための潜在的なマーカーおよびリスク要因を、定量、およびそれらの対立遺伝子の発現を測定することができます。...

神経変性のバイオマーカーおよびアポリポタンパク質Eアイソフォームの状態を定量化するために高スループット、多重化およびターゲットプロテオームCSFアッセイ

このプロトコルは、臨床サンプルからのタンパク質の多重反応モニタリング(MRM)のための三重四重極質量分析計の使用を導入することを目的としています。我々は、サンプル調製から臨床サンプルのデータ分析に始まる体系的なワークフローを提供し、必要な予防措置をすべて講じています。...

ヒト脳組織からのタンパク質の多発反応モニタリングを用いた定量的プロテオミクスワークフロー

このプロトコルの目的は、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)質量分析イメージングを使用して、 ショウジョウバエ 脳などの小組織における脂質および代謝産物分析のための適切なサンプル調製に関する詳細なガイダンスを提供することです。...

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化質量分析イメージングを用いた ショウジョウバエ 脳における迅速な脂質分析のためのサンプル調製

DeepOmicsAEは、深層学習手法(オートエンコーダー)の適用を中心としたワークフローで、マルチオミクスデータの次元を縮小し、オミクスデータの多層化を表す予測モデルとシグナリングモジュールの基盤を提供します。...

DeepOmicsAE:プロテオミクス、メタボロミクス、臨床データの深層学習解析によるアルツハイマー病のシグナル伝達モジュールの表現

この研究では、アルツハイマー病(AD)患者33人の単一核トランスクリプトームを解析し、グリア細胞における性特異的なDEGを明らかにしました。機能強化解析では、シナプス、神経、およびホルモン関連の経路が強調されました。主要な遺伝子、すなわちNLGN4Yとその調節因子が特定され、性別特異的ADの潜在的な治療候補が提案されました。...

グリアトランスクリプトームプロファイルに基づくアルツハイマー病の性別特異性のためのバイオマーカー同定

ここでは、神経疾患のマイクロRNA(miRNA)バイオマーカーの供給源として、最小限の新鮮凍結脳組織切片と利用可能な高速遠心分離法、およびサイズ排除クロマトグラフィーを組み合わせたプロトコルを確立します。...

新鮮凍結ヒト脳切片から放出される小さな細胞外小胞におけるマイクロRNAカーゴの力の利用 

学ぶ神経疾患におけるリピドミクスとトランスクリプトミクスのモジュール式プロトコル。マウス脳組織と血漿を用いて、脂質とRNAの同時抽出・定量解析を行い、炎症と神経活動に関与する脂質シグナリングの分子メカニズムを解明する。

神経疾患におけるリピドミクスとトランスクリプトミクス

さらに動画を探す