Name: ヒトニューロンのレンチウイルス媒介性形質導入を用いたタウ凝集を研究するための in Vitro モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: 学ぶレンチウイルス媒介性形質導入を用いたヒトニューロン培養モデルによるタウ凝集のin vitro解析法。動物実験より迅速にタウ毒性と治療薬を評価し、神経変性疾患のメカニズム解明と創薬スクリーニングに応用可能です。

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著者たちは、タウコンストラクトを提供するために、テキサス大学南西部で PHF と CP13 抗体とマルク・ダイヤモンドを供給するために、アルバート・アインシュタイン医科大学のピーター・デイビス博士に感謝したいと思います。この研究は、アルツハイマー病協会 (NIRG-14-322164) から S.H.Y. とカリフォルニア再生医療研究所 (TB1-01193) からの助成金によって支持されました P.R.

1. 培地および試薬の調製
<ol><li>4° c で培養プレート用の基底膜マトリックスコーティングを解凍します (基底膜マトリックスがウォームアップすることを許可しないか、固化します)。1 mL アリコートを作り、-20 ° c または-70 ° c で保存します。</li>
	<li>塩基性線維芽細胞成長因子 (bFGF) を滅菌リン緩衝生理食塩水 (PBS) に10μ g/mL で再構成し、10μ l のアリコートを作ります。4° c で保管してください。</li>
	<li>新しい、未開封の 500 mL ボトルの DMEM/F12 をグルタミンで、B27 (10ml)、N2 (5ml)、およびペニシリン-ストレプトマイシン (5ml) を添加する。この神経幹細胞 (NSC) 培地の 50 mL を円錐形のチューブに置き、10μ l (2 μ g/mL の最終) bFGF を加えます。NSC (+) の bFGF 媒体を4° c で保存します。</li>
	<li>(-) BFGF メディアを作るには、ステップ1.3 で説明したのと同じレシピを使用しますが、bFGF は追加しません。このメディアは、ニューロンと NSCs を区別し、分化後のニューロンの文化を維持するために使用されます。.</li>
</ol>2. レンチウイルスコンストラクト
注:レンチウイルスコンストラクトの作業を開始する前に、ラボがバイオセーフティレベル 2 (BSL) エージェントを使用することが承認されていることを確認してください。さらに、レンチウイルスベクターを使用する場合は、BSL 培養フード、個人用保護具 (PPE)、および廃棄方法を用いる必要があります。
<ol><li>好ましい供給源からレンチウイルスに包装されたタウ構造物を得る (構築情報についてはサンダース et al.10参照)。</li>
</ol>3. ヒト神経幹細胞の培養
注:NSCs は通常100000–150000細胞/cm2 で播種され、最も商業的に入手可能な NSCs は 1 x 106 細胞/バイアルとして販売されています。このプロトコルは、10cm の細胞培養皿に最適化されています (ただし、他のサイズの食器を使用することができます)。したがって、市販の NSCs が使用されている場合、NSCs は、10 cm の料理をシードするのに十分な細胞をもたらすために、最初に6ウェルディッシュで培養されることによって拡大される必要があるかもしれません。このプロトコルはまた、様々な細胞培養皿のサイズに適合させることができる (しかし、これらのプロトコルは他の場所で利用可能であるように継代 NSCs のための命令を含まない11,12)。
<ol><li>
細胞培養プレートの調製のために、細胞培養プレート用の凍結された基底膜マトリクスコーティングの1アリコートを除去し、それが4° c で解凍することを可能にする (アリコートは、細胞が播種される前日に一晩4° c に置くことができる)。385μ l の基底膜マトリックスコーティングを 5ml/F12 培地 + ペニシリン-ストレプトマイシンに添加する。 注: 5 mL の DMEM/F12 メディア + ペニシリン・ストレプトマイシンは、10cm の皿にコートするのに十分である (この基底膜マトリックスコーティング溶液の1ml は、6ウェルディッシュの1つの井戸を被覆するのに十分である)。あるいは、細胞が固定され、用い、またはチオフラビンのために染色する場合、ガラス上の培養細胞は24ウェル培養皿にカバースリップ。<ol>
<li>メディアとマトリックスコーティングは、以前と同じように冷たくし、培養皿に加えます。培養皿に基底膜マトリックスコーティングを加えて、1時間のインキュベーター (37 ° c で) に食器を置きます。最適なコーティングのために、1時間以上またはそれ以下のために基底膜マトリクスをインキュベートしないでください。1時間後、細胞培養皿から基底膜マトリックスコーティングを吸引する。これは、メッキの準備ができている NSCs と一致することを確認してください。 注:セルが凍結在庫から解凍されていない場合は、ステップ3.2 をスキップし、ステップ3.3 に進みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>細胞が冷凍 NSC 株から解凍されている場合は、凍結した細胞のバイアルを取り、水の中に前後にバイアルを移動させることにより、37° c に加熱された水浴中で温めます。解凍したら、70% のエタノールでバイアルをスプレーし、細胞培養フードに入れます。細胞を ~ 10ml の DMEM/F12 + ペニシリン-ストレプトマイシン培地に移し、室温で5分間 1000 x gでチューブを遠心分離する。メディアを吸引し、再懸濁でセルを再除去します。</li>
	<li>NSC メディアの細胞を希釈して、使用されている細胞培養容器に適した播種密度を得ます。 注:例えば、NSCs が6ウェルプレートにめっきされている場合、6ウェル培養皿の1つには 9 cm2の表面積があり、90万 ~ 135万の細胞が播種する必要があります。したがって、100万細胞を含む1つのバイアルは、2 mL の培地に再懸濁し、6ウェルディッシュの単一ウェルに添加することができる。</li>
	<li>NSC メディアに懸濁した十分な細胞を加えて、基底膜マトリックスコーティング培養皿 (10万細胞/cm2) を播種し、1日おきにメディアを交換する (凍結したストックを使用する場合は、メッキの翌日から1日おきにメディアを交換する)。彼らは 75% – 80% のコンフルエントになるまで細胞を成長させます。 注:セルは、おそらくめっき後すぐに 75%-80% の合流に達するであろうが、凍結した株が使用される場合、これはより長い時間がかかることがあります。</li>
	<li>NSCs が 75% – 80% のコンフルエントである場合、NSC (+) bFGF 媒体を除去し、NSC (-) bFGF 媒体に置き換えることによってニューロン分化を開始する。この培地中の細胞を培養する (1 日おきにメディアを交換する) 場合は、少なくとも4週間。 注:細胞は、bFGF の撤退の後、数日間分裂し続けます。したがって、細胞は90〜 100% の合流に達する可能性があります。4週間培養した後、細胞はニューロンの運命を達成し、レンチウイルスの治療の準備が整います。</li>
</ol>4. ニューロン培養の形質導入と維持
<ol><li>レンチウイルスでニューロンを形質導入するには、3.4 x 105 transducible 単位/細胞 (100% コンフルエントな 10 cm ディッシュに ~ 1000万ニューロンが含まれる) を使用します。細胞培養培地中で必要な濃度に transducible 単位を希釈し、それらを細胞に加える (細胞培養皿のための通常の培地を使用する)。レンチウイルスを加えた2日後、細胞1x を新鮮な (-) bFGF 培地 (レンチウイルスなし) で洗い、(-) bFGF 培地でいつものように培養を続ける。</li>
	<li>後レンチウイルス治療のために、細胞培養培地 ([−] bFGF 培地) を1日おきに変化させることによって形質導入ニューロンをフィードする。形質導入後〜8週間の間、細胞を維持する。細胞を光学顕微鏡下で定期的に可視化し、生存率を確保します。 注:Sparseness または樹状破損は、細胞がもはや生存可能でないという兆候である。</li>
</ol>5. 細胞のイメージング
<ol><li>
生細胞イメージング
	<ol>
<li>形質導入後 (4 日後にレンチウイルスを添加した後)、生細胞画像化が可能な蛍光顕微鏡下で YFP シグナルを観察する。インキュベーターから細胞培養皿を取り出し、培養皿の上に蓋を保つことによって、培養ウェルが無菌のままであることを確認します。~ 514 nm の励起波長と〜 527 nm の発光フィルタを用いて、10倍の対物レンズで細胞を視覚化します。 注:凝集体は、通常、レンチウイルスの適用後6〜8日に形質導入された細胞培養物において可視である。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
固定細胞染色 (β-チューブリン III 標識およびチオフラビン染色)
	<ol>
<li>細胞をパラホルムアルデヒド (PFA) で固定するために、ガラスカバースリップ上で増殖させた形質導入ニューロンから培養培地を除去する。細胞1x を PBS で洗浄し、洗浄を外し、4% PFA (PBS で希釈) を室温にて20分間カバースリップに 300 ~ 500 μ l (24 ウェルプレートを使用する場合) を添加します。PFA を取り外し、カバースリップ2x を PBS で洗浄します。</li>
		<li>PBS、3% ウシ血清アルブミン (BSA)、および 0.3% トリトン X-100 からなるブロッキング溶液を調製します。井戸に 300-500 μ l の溶液を加え、カバースリップを4° c で2時間インキュベートします。2時間後、一次抗体 (1:500 の抗体濃度で) をブロッキング溶液に希釈し、各ウェルに300〜500μ l の一次抗体溶液を加えます。4° c で一晩ロッキングまたは回転プラットフォーム (低速) にプレートを置きます。</li>
		<li>翌日、一次抗体溶液を除去し、PBS でそれぞれ5分間カバースリップ3x を洗浄する。ブロッキングバッファー溶液 (1: 1000 の濃度) で二次抗体を希釈し、各ウェルに二次抗体溶液を加えます。YFP シグナルと重ならない蛍光タグ (CY-3 など) を使用して、適切な二次抗体を選択します。ロッキングまたは回転プラットフォーム上で、細胞を2時間室温でインキュベートします。2時間後、2次抗体溶液を除去し、カバースリップ3x を PBS でそれぞれ10分間洗浄する。</li>
		<li>カバースリップをダブル脱イオン水 (DDW) で10分間洗浄し、DDW を 50% エタノールで10分間希釈して300μ l/0.015% のチオフラビンを加えます。チオフラビン溶液を除去し、カバースリップ2倍を 50% エタノールで4分間洗浄し、その後に1つ4分間30% のエタノールと2回の洗浄を 30% のエタノールで5分間洗浄します。取り付け前に、カバースリップ1x を DDW で洗ってください。 注:ステップ5.2.4 で説明されるチオフラビン染色は任意である。</li>
		<li>ガラススライドにカバースリップを取り付けるには、ガラススライドの "+" 側にマウントメディアを1滴入れます。ガラスカバースリップを含むウェルからすべての液体を除去し、微細な鉗子を使用して慎重にガラスカバースリップを除去し、どの側が培養細胞を持っているかを追跡します。</li>
		<li>余分な水分を除去するために、キムワイプに対してカバースリップの端をそっと押します。それでも細かい鉗子でカバースリップをつかんで、カバースリップの端を取り付けメディアに (マウントメディアのドロップの方に向いているセル側で) タッチしてから、マウントメディアにカバースリップをそっと置きます (培養細胞を取付けに入れるカバースリップとガラススライドの間に挟むように、メディアを挟みます)。マウントメディアをイメージング前に30分間硬化させます。スライドは、将来の使用のために-20 ° c で保存することができます。</li>
		<li>蛍光顕微鏡と適切な励起/発光スペクトル (YFP = ~ 514/527 nm、CY-3 = ~ 555/568 nm、およびチオフラビン S = ~ 390/426 nm) を用いて細胞を画像する。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. オプションの方法
<ol><li>2日ごとに、文化から条件付きメディアを収集し、-20 ° c でそれを保存して、培養物によって放出されたタウ種を分析します。</li>
</ol>

<ol><li>Rojas, J. C., Boxer, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+disease+in+2015%3A+Targeting+tauopathies+for+therapeutic+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (2), 74-76 (2016).</li>
<li>Kadavath, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+stabilizes+microtubules+by+binding+at+the+interface+between+tubulin+heterodimers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).</li>
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<li>Yuan, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+marker+signatures+for+the+isolation+of+neural+stem+cells%2C+glia+and+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells.</a> PLOS ONE. 6 (3), e17540(2011).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging human neural stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e263(2007).</li>
<li>Lathuiliere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motifs+in+the+tau+protein+that+control+binding+to+microtubules+and+aggregation+determine+pathological+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Motifs in the tau protein that control binding to microtubules and aggregation determine pathological effects.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13556(2017).</li>
<li>Asai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+microglia+and+inhibition+of+exosome+synthesis+halt+tau+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Depletion of microglia and inhibition of exosome synthesis halt tau propagation.</a> Nature Neuroscience. 18 (11), 1584-1593 (2015).</li>
</ol>

作者は何も開示することはありません。

このプロトコルは、銀染色陽性凝集体およびチオフラビン陽性脱落もつれ (NFTs) を呈するヒトタウオパチーの in vitro モデルの生成を記述する。さらに、形質導入細胞は、形態学的欠陥、減少したシナプス形成、および増加したリソソーム容積のようなタウ誘発病理を表示する。このプロトコルの主な利点は、薬物スクリーニング研究のためだけでなく、タウ毒性の分析のために使用することができる神経タウオパチーのアクセス可能で費用対効果の高いモデルを提供することです。このモデルは、ヒトタウオパチー細胞株がまだ広く利用可能ではなく、マウス由来ニューロンからのトランスジェニックタウの使用は、動物の繁殖を必要とし、ニューロンの違いにより制限されているように、神経変性研究の材料の必要性を満たします種間の特性。
上記に加え、この手順を成功させるための重要な手順がいくつかあります。まず、ウイルス力価が低すぎる場合、培養物が凝集体を形成しないため、正しいウイルス力価が使用されていることを確認します。第2に、NSC 培養物が適切に維持され、かつ約 80% の合流点を超えないことを確認してください。NSCs の過剰...

微小管関連タンパクタウの病理学的凝集は、AD、前頭認知症 (FTD)、ピック病、および進行性の神経性麻痺 (PSP)1を含む多くの変性疾患の決定的な特徴である。Nondiseased 状態では、タウは神経軸索2に結合して微小管フィラメントを安定化させる。しかし、タウの疾患関連 hyperphosphorylation は、タウの凝集を促進します, 微小管からの解離, ニューロン毒性3.凝集したタウの毒性作用は、コリン作動性4および glutamatergic 受容体5の異常な活性化を伴うことがあり、細胞内カルシウムの調節不全をもたらし、最終的に、細胞死をもたらす。動物モデルにおいて、脳タウの減少は、AD マウス6における病理を改善し、反復性の軽度トラウマ的脳損傷7のマウスモデルである。
取り付け証拠は、マウス由来タウの構造および結合親和性がヒト由来タウとは異なること、およびマウスタウがヒトタウオパチー8のモデル化に適さないことを実証する。しかしながら、ヒト細胞タウオパチーモデルは、広く市販されていない。本研究の全体的な目的は、ヒトニューロンが変異型ヒトタウ構築物9を含むレンチウイルス由来ベクターで形質導入されるタウ凝集の in vitro モデルを記述することである。YFP レポーターに融合した P301L および V337M 突然変異を保有するタウ繰り返しドメインについてのタウレンチコンストラクトを生じさせるτ凝集体 (τ-RDLM-YFP) に対して、制御構築物は野生型 (Wt) タウのコードを YFP レポーター (タウ− Wt − YFP) に融合させた。この方法を用いて形質導入したニューロン培養は、nontransduced 培養よりも約9倍多くのタウを発現する。タウの発現量は、タウ-RDLM-YFP-YFP 形質細胞との間でほぼ等しいですが、タウ-RDLM-YFP ディスプレイで形質導入されたニューロンのみが凝集します。RDLM-YFP 染色によって形質導入された培養物は、チオフラビンのためにポジティブに、軸索長さおよびシナプス密度の減少を表示する。したがって、この細胞モデルは、インビトロでタウ凝集を研究するための有用なツールとなり得る。

<table><tbody><tr><td>10 cm培養皿</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12556002</td><td></td></tr><tr><td>15 mLチューブ</td><td>バイオパイオニア</td><td>CNT-15</td><td></td></tr><tr><td>16%パラホルムアルデヒド</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー50-980-487</td><td></td></tr><tr><td>24ウェル培養プレート</td><td>サーモフィッシャー</td><td>930186</td><td></td></tr><tr><td>50 mLチューブ</td><td>バイオパイオニア</td><td>CNT-50</td><td></td></tr><tr><td>スプレーボトル</td><td>入り70%エタノール各種ソース</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>B27 サプリメント</td><td>サーモフィッシャー</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>基底膜マトリックス(マトリゲル)</td><td>コーニング</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>ベーシック FGF</td><td>バイオパイオニア</td><td>HRP-0011</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養インキュベーター</td><td>各種ソース</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>各種ソース</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 グルタミン入り培地</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>エタノール(濃度50%以上)</td> <td>各種ソース</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>蛍光標識二次抗体</td><td>各種ソース、実験依存</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>各種ソース</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>1254581</td><td></td></tr><tr><td>スライドガラス</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>ヒト神経幹細胞</td><td>各種ソース</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>レンチウイルスベクター</td><td>各種ソース</td><td>カスタムオーダー</td><td></td></tr><tr><td>封入剤</td><td>サーモフィッシャー</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>N2 サプリメント</td><td>サーモフィッシャー</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン・ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>サーモフィッシャー</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>一次抗体</td><td>各種ソース、実験依存</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ロッキングまたは回転プラットフォーム</td><td>各種ソース</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>滅菌細胞培養フード</td><td>さまざまなソース</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>チオフラビン S</td><td>Σ</td><td>T1892-25G</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>サーモフィッシャー</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>さまざまなソース</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒトニューロンのレンチウイルス媒介性形質導入を用いたタウ凝集を研究するための in vitro モデル

An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons

タンパク質タウの異常な凝集は、アルツハイマー病 (AD) を含む多数の神経変性疾患に関与する pathogenically である。タウオパチーのマウスモデルは、凝集したタウの神経毒性メカニズムを調査するための貴重な資源を提供しているが、種族間の生理学的差異のために、マウス脳は人間の状態をモデリングします。細胞培養法の進歩は、インビトロでヒトニューロン培養を実験用にアクセス可能にし、neurotherapeutics の開発を支援した。しかしながら、ヒト神経細胞培養物の適応にもかかわらず、ヒトタウオパチーのインビトロモデルは未だ広く利用可能ではない。この議定書は、ヒトニューロンを pathogenically 変異体が黄色蛍光タンパク質 (YFP) レポーターに融合させるコードであるレンチウイルス由来のベクターで形質導入したタウ凝集体の細胞モデルを記述している。形質導入された培養物は、チオフラビンに対してポジティブに染色し、軸索長さの減少およびリソソーム体積の増加などの神経毒性のマーカーを表示するタウ凝集体を生成する。この手順は、人間のタウオパチーを研究するための有用で費用対効果の高いモデルかもしれません。

タウ-RDLM-YFP に形質導入されたニューロンを YFP で蛍光タグ付けし、RDLM 形質導入培養後に凝集体を表示した。これらの介在物はチオフラビンに対して陽性に染まった (図 1)。図 1に示すように、このプロトコルはチオフラビン陽性タウ凝集体を表示するニューロン培養を生成する。初期実験では、ニューロン特異的マーカーβ-チューブリン III を培養液に付加ことによってニューロン分化を確認することが推奨される。重要なことに、蛍光タグ付き二次抗体は、YPF (Cy3 など) とオーバーラップしない励起/発光スペクトルを持っている必要があります。黄色蛍光タウ凝集体は染色がない状態で可視になりますが、蛍光シグナルが細胞破片ではなく、凝集していることを確認するために、チオフラビンをイメージングにも使用する必要があります。さらに、図 1の例には、dapi の励起/発光がチオフラビンのそれと重なるように細胞核を標識する DAPI 染色は含まれていない。代替核染色剤は、...

このプロトコルは、ヒトの神経細胞培養が変異型ヒトタウのためのコーディングをコードするレンチを用いて形質導入される手順を詳述する。形質導入培養物は、タウ凝集体および関連する病理を表示する。

ヒトニューロンのレンチウイルス媒介性形質導入を用いたタウ凝集を研究するための in Vitro モデル

Aberrant aggregation of the protein tau is pathogenically involved in a number of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD). ...

このプロトコルでは、ヒトタウオパチーのインビトロモデルを詳述する。この方法は、薬物スクリーニングおよび疾患メカニズム研究に有用であり得る材料の必要性を満たす。この技術の主な利点は、細胞培養パラダイムが動物研究と比較してタウ毒性および潜在的タウ治療薬のより迅速な評価を可能にすることであるこの手順を開始するには、培養プレートの基基膜マトリックスコーティングを摂氏4度で解凍する。1ミリリットルのアリコートを作り、マイナス20度またはマイナス70度で保存します。次に、1ミリリットル当たり10マイクログラムの濃度で滅菌PBS中の塩基性線維芽細胞増殖因子を再構成する。10マイクロリットルのアリコートを作り、摂氏4度で保管してください。その後、グルタミンとDMEM-F12の新しい未開封の500ミリリットルのボトルを設定します。B27の10ミリリットル、N2の5ミリリットル、および5ミリリットルのペニシリンストレプトマイシンを加えて、神経幹細胞培地を調製する。50ミリリットルのNSC培地を円錐チューブに入れ、調製したbFGFの10マイクロリットルを加えます。このNSCプラスbFGFメディアを摂氏4度で保管してください。まず、冷凍庫から細胞培養プレート用の凍結基質膜マトリックスコーティングのアリコートを取り除き、摂氏4度で解凍できるようにします。ペニシリンストレプトマイシンを含むDMEM-F12培地の5ミリリットルに解凍された基質膜マトリックスコーティングの385マイクロリットルを追加します。細胞が凍結したNSCストックから解凍されている場合は、冷凍庫から冷凍細胞のバイアルを取り出し、バイアルを水中で前後に動かして摂氏37度に加熱した水浴で温めます。この後、バイアルに70%エタノールを吹き付けます。次いで細胞培養フードの下で、ペニシリンストレプトマイシンを含むDMEM-F12培地の約10ミリリットルに細胞を移す。室温で5分間1,000倍gの遠心分離機。その後、メディアを吸引し、NSCメディアの細胞を再中断します。NSC培地で細胞を希釈して、使用されている細胞培養容器に適した播種密度を得る。NSC培地に懸濁された十分な細胞を加えて、基質膜マトリックスコーティングされた培養皿を播種する。彼らは75〜80%コンフルエントになるまで5%の二酸化炭素で摂氏37度で細胞を成長させ、一日おきにメディアを変更してください。レンチウイルスでニューロンをトランスデュースするには、細胞あたり340,000のトランスデューティユニットのタンターカウントを使用してください。細胞培養培地中の導入単位を必要な濃度まで希釈し、細胞に加えます。レンチウイルスを添加した2日後、bFGFを含まない新鮮な培地で細胞を1回洗浄する。bFGFを使用しない培地で5%の二酸化炭素で37°Cで細胞を培養し続けます。細胞を転移後約8週間維持し、細胞培養培地を1日おきに変更するようにしてください。細胞を日常的に可視化し、生存率を確保するために、軽い顕微鏡を使用してください。トランスダクション後、培養物をよく無菌に保つために蓋を保つように培養器から培養皿を取り除きます。514ナノメートルの励起と527ナノメートルの放出フィルターで10Xの目的の下で細胞を視覚化するために生細胞のイメージ投射が可能な蛍光顕微鏡を使用しなさい。本研究では、タウ-RDLM-YFPレンチウイルスを導入したニューロンがYFPで蛍光的にタグ付けされている。RDLM導入培養物は、伝達後の凝集体を表示することが分かる。これらのインクルージョンはチオフラビンに陽性染色する。神経細胞分化は、培養中のニューロン特異的マーカーβ-チューブリンIIIの免疫標識によって確認される。蛍光タグ付き二次抗体は、YFPと重ならない励起発光スペクトルを持つ必要があることを覚えておくことが重要です。黄色の蛍光タウ凝集体は染色がない場合には見えますが、蛍光シグナルが細胞の破片ではなく凝集タウであることを確認するために、イメージングにも使用する必要があります。タウ過剰発現細胞の生成後、多くの神経細胞の健康およびタウ凝集の評価が行われる。例えば、これらの細胞は軸索変性を示すことがわかりました。細胞培養研究に加えて、この方法を用い、病原性外生タウを調べた。

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Neuroscience

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このビデオでは、pH感受性蛍光標識タウ凝集体を用いてマウスミクログリアによるタウの取り込みを定量化する細胞ベースのアッセイを紹介しています。これを蛍光活性化セルソーティングで分析し、定量的評価を行っています。...

ミクログリアによるタウタンパク質の取り込みを評価するための細胞ベースのアッセイ

このビデオでは、黄色蛍光タンパク質(YFP)でタグ付けされた変異型ヒトタウタンパク質をコードするレンチウイルスをヒト神経細胞に形質導入し、タンパク質凝集を研究するプロセスを示しています。ウイルスの侵入から変異型タウの発現までのステップを概説し、ニューロンに目に見える細胞質タウ凝集体が形成されるまでのステップを概説しています。...

タウタンパク質凝集解析のためのヒトニューロンのレンチウイルス媒介形質導入

非修飾および高リン酸化タウタンパク質は、高リン酸化依存速い凝集速度論を明らかに二つのインビトロ凝集アッセイに使用した。これらのアッセイは、アルツハイマー病の進行の基礎となる原線維を形成する過リン酸化タウの性向を調節することができる化合物のための将来のスクリーンのための道を開く。...

高リン酸化タウタンパク質を用いたインビトロ凝集アッセイにおいて

タンパク質凝集体の細胞間移動、またはプロテオパシーシードは、神経変性疾患の病理進行の根底にある可能性があります。ここでは、組換えサンプルまたは生物学的サンプルからの播種活性を特異的かつ高感度に検出することを可能にする新しいFRETフローサイトメトリーアッセイについて説明します。...

FRETフローサイトメトリーでProteopathic播種活動の高感度検出

このプロトコルの目的は、生体内でα-シヌクレインの形成を複製するセルベースのシステムを集約を提供することです。細胞内の α-シヌクレイン介在物は一次ニューロンに内面化することによって播かれ、伝搬の外因性投与罹患 α-シヌクレイン遺伝子組換えマウスから隔離されたネイティブのミクロソームによる...

線維形成の強力な細胞モデルとして α-シヌクレインのミクロソーム関連付けられた集計一次ニューロンの外因性投与

本稿で説明したタウ凝集アッセイは、生体内でタウの折りたたみと集計の予想される機能を模倣します。...

体外タウ蛋白と創薬スクリーニングの集計を勉強するための試金

ここより反タウ抗体の作用のメカニズムを特徴付けるため治験ツールの作成目的とミクログリアによるタウ摂取量を定量的に評価する細胞に基づく試金を記述します。...

タウの抗体を介したミクログリアによってクリアランスを勉強するセルベースのアッセイ

タウは、細胞質に存在する神経タンパク質であり、そこで微小管を結合し、核の中で、アルツハイマー病関連遺伝子の変調を含む非伝統的な機能を発揮する。ここでは、細胞質タウからの干渉を排除しながら核タウの機能を調べる方法について述べる。...

疾患関連遺伝子の発現を調べるツールとしてのタウ小細胞局在の変調

パーキンソン病の病態を研究・理解するためには、α-シヌクレインの in vivo...

ヒト化酵母モデルを用いたα-シヌクレインの毒性と凝集の研究法

ここでは、初代海馬げっ歯類ニューロンのトランスフェクションと生細胞共焦点イメージングを組み合わせて、軸索輸送に対する病理学的タンパク質誘発性の影響を解析し、これらの影響を媒介する機構経路を特定する方法を示します。...

生細胞イメージングを使用して、初代海馬ニューロンの軸索輸送に対する病理学的タンパク質の影響を測定する

ポリグルタミン脊髄小脳失調症は、CAG増殖によって凝集しやすいタンパク質が生成されることによって引き起こされます。本プロトコルは、ベクター産生、立体誘導、包有物およびニューロンマーカー喪失の解析を記述し、神経変性疾患のメカニズムを調査し、標的治療を評価するための制御されたプラットフォームを提供します。...

レンチウイルス誘発性紋体形体病理をポリグルタミン脊髄小脳運動失調症の前臨床モデルとして

学ぶレンチウイルス媒介性形質導入を用いたヒトニューロン培養モデルによるタウ凝集のin vitro解析法。動物実験より迅速にタウ毒性と治療薬を評価し、神経変性疾患のメカニズム解明と創薬スクリーニングに応用可能です。

ヒトニューロンのレンチウイルス媒介性形質導入を用いたタウ凝集を研究するための in Vitro モデル

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