ヒトニューロンのレンチウイルス媒介性形質導入を用いたタウ凝集を研究するための in Vitro モデル
2019年5月23日
このプロトコルは、ヒトの神経細胞培養が変異型ヒトタウのためのコーディングをコードするレンチを用いて形質導入される手順を詳述する。形質導入培養物は、タウ凝集体および関連する病理を表示する。
このプロトコルでは、ヒトタウオパチーのインビトロモデルを詳述する。この方法は、薬物スクリーニングおよび疾患メカニズム研究に有用であり得る材料の必要性を満たす。この技術の主な利点は、細胞培養パラダイムが動物研究と比較してタウ毒性および潜在的タウ治療薬のより迅速な評価を可能にすることであるこの手順を開始するには、培養プレートの基基膜マトリックスコーティングを摂氏4度で解凍する。
1ミリリットルのアリコートを作り、マイナス20度またはマイナス70度で保存します。次に、1ミリリットル当たり10マイクログラムの濃度で滅菌PBS中の塩基性線維芽細胞増殖因子を再構成する。10マイクロリットルのアリコートを作り、摂氏4度で保管してください。
その後、グルタミンとDMEM-F12の新しい未開封の500ミリリットルのボトルを設定します。B27の10ミリリットル、N2の5ミリリットル、および5ミリリットルのペニシリンストレプトマイシンを加えて、神経幹細胞培地を調製する。50ミリリットルのNSC培地を円錐チューブに入れ、調製したbFGFの10マイクロリットルを加えます。
このNSCプラスbFGFメディアを摂氏4度で保管してください。まず、冷凍庫から細胞培養プレート用の凍結基質膜マトリックスコーティングのアリコートを取り除き、摂氏4度で解凍できるようにします。ペニシリンストレプトマイシンを含むDMEM-F12培地の5ミリリットルに解凍された基質膜マトリックスコーティングの385マイクロリットルを追加します。
細胞が凍結したNSCストックから解凍されている場合は、冷凍庫から冷凍細胞のバイアルを取り出し、バイアルを水中で前後に動かして摂氏37度に加熱した水浴で温めます。この後、バイアルに70%エタノールを吹き付けます。次いで細胞培養フードの下で、ペニシリンストレプトマイシンを含むDMEM-F12培地の約10ミリリットルに細胞を移す。
室温で5分間1,000倍gの遠心分離機。その後、メディアを吸引し、NSCメディアの細胞を再中断します。NSC培地で細胞を希釈して、使用されている細胞培養容器に適した播種密度を得る。
NSC培地に懸濁された十分な細胞を加えて、基質膜マトリックスコーティングされた培養皿を播種する。彼らは75〜80%コンフルエントになるまで5%の二酸化炭素で摂氏37度で細胞を成長させ、一日おきにメディアを変更してください。レンチウイルスでニューロンをトランスデュースするには、細胞あたり340,000のトランスデューティユニットのタンターカウントを使用してください。
細胞培養培地中の導入単位を必要な濃度まで希釈し、細胞に加えます。レンチウイルスを添加した2日後、bFGFを含まない新鮮な培地で細胞を1回洗浄する。bFGFを使用しない培地で5%の二酸化炭素で37°Cで細胞を培養し続けます。
細胞を転移後約8週間維持し、細胞培養培地を1日おきに変更するようにしてください。細胞を日常的に可視化し、生存率を確保するために、軽い顕微鏡を使用してください。トランスダクション後、培養物をよく無菌に保つために蓋を保つように培養器から培養皿を取り除きます。
514ナノメートルの励起と527ナノメートルの放出フィルターで10Xの目的の下で細胞を視覚化するために生細胞のイメージ投射が可能な蛍光顕微鏡を使用しなさい。本研究では、タウ-RDLM-YFPレンチウイルスを導入したニューロンがYFPで蛍光的にタグ付けされている。RDLM導入培養物は、伝達後の凝集体を表示することが分かる。
これらのインクルージョンはチオフラビンに陽性染色する。神経細胞分化は、培養中のニューロン特異的マーカーβ-チューブリンIIIの免疫標識によって確認される。蛍光タグ付き二次抗体は、YFPと重ならない励起発光スペクトルを持つ必要があることを覚えておくことが重要です。
黄色の蛍光タウ凝集体は染色がない場合には見えますが、蛍光シグナルが細胞の破片ではなく凝集タウであることを確認するために、イメージングにも使用する必要があります。タウ過剰発現細胞の生成後、多くの神経細胞の健康およびタウ凝集の評価が行われる。例えば、これらの細胞は軸索変性を示すことがわかりました。
細胞培養研究に加えて、この方法を用い、病原性外生タウを調べた。
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概要
本研究では、変異型ヒトtauをコードするレンチウイルス構築物を神経細胞培養系に導入することにより、ヒトタウオパチーのin vitroモデルを構築するプロトコルについて概説します。このモデルを用いることで、従来の動物実験と比較して、tauの毒性および潜在的な治療薬の迅速な評価が可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- タウオパチー
背景
- ヒトのタウオパチーは、タウタンパク質の凝集を特徴とする神経変性疾患である。
- 従来のモデルは期間が長くなることが多く、必ずしもヒトの病理を反映しているとは限らない。
- 本プロトコルでは、細胞培養を用いた、より迅速かつ特異的な評価パラダイムを提示する。
- 本手法は、タウタンパク質の相互作用を研究する際における動物モデルの限界を解消するものである。
研究目的
- tau病理の研究に向けたヒト神経細胞培養モデルを構築すること。
- tau関連疾患の薬剤スクリーニングを支援すること。
- 神経変性におけるtauの役割の理解を促進すること。
使用された手法
- 使用されているプラットフォームは、ヒト神経細胞培養システムである。
- 生物学的モデルは、レンチウイルスベクターを用いて変異型tauを導入したヒト神経細胞で構成されている。
- 本文中にマルチオミクスワークフローに関する記載はない。
- 細胞は形質導入後、定期的な培地交換を行いながら約8週間維持される。
- tau凝集の可視化には、光学顕微鏡および蛍光顕微鏡が用いられている。
主要な結果
- 導入された培養細胞ではタウ凝集体が認められ、チオフラビン染色によって確認されました。
- 神経分化は、beta-tubulin IIIの免疫染色によって検証されました。
- 観察の結果、タウ過剰発現細胞において軸索変性が認められました。
- 本研究は、タウに関連する神経細胞の健康状態を評価するためのモデルとして、本手法が有用であることを示しています。
結論
- 本研究では、タウオパチーの探索およびタウ毒性の評価のための、信頼性の高いin vitroアプローチを実証します。
- 開発されたモデルは、潜在的なタウ治療薬の試験への道を開くものです。
- 得られた知見は、タウ凝集と神経変性の背後にあるメカニズムの理解を深めることができます。
よくある質問
産業上の重要性
このin vitroヒトニューロンモデルは、tau凝集および神経毒性を迅速に評価するためのヒトに即したシステムを提供することで、tauオパチー研究における重要な課題を解決します。本モデルは、tauを標的とした治療薬の初期段階におけるターゲットバリデーションおよびメカニズム的なリスク低減を可能にし、長期にわたる動物実験への依存度を下げます。また、神経変性疾患プログラムにおけるリード化合物の同定や前臨床段階でのトリアージにおいて、予測の信頼性を向上させます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： ヒトニューロンにおける病原性tau変異体を解析し、治療標的の検証および凝集メカニズムを解明する。
- 運用の価値： 軸索の長さやリソソーム体積の変化などの定量的リードアウトを通じて、機能的な標的検証を可能にする。
- 予測的価値： ヒト特有のtau病理および毒性プロファイルをモデル化することで、ポートフォリオの選別（トリアージ）を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備： 化合物スクリーニングのために、YFPおよびチオフラビン染色で検出可能な標準化された蛍光タグ付きtau凝集体を作製します。
- 定量的出力： 用量反応アッセイの従属変数として、凝集負荷および神経毒性表現型の測定を可能にします。
- スケーラビリティ： レンチウイルス導入により、ハイコンテントスクリーニングに適した疾患関連神経細胞培養の一貫したスケーラブルな調製が可能です。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性：病原性tau変異体を発現するヒトニューロンを用いて、アルツハイマー病および関連するtauオパチーの初期イベントをモデル化します。
- トランスレーショナルな連続性：作用機序研究のためのヒト細胞システムを提供することで、基礎研究と前臨床研究を橋渡しします。
- リスク調整後の意思決定：チオフラビン陽性の凝集塊とニューライト変性を呈するシステムにおいて、tau標的化化合物の評価を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
このモデルは、ターゲットバリデーションからリード化合物の同定、そして前臨床有効性試験に至る創薬のコンティニュアムに適合しており、tauモジュレーターの反復的なデザイン・合成・評価サイクル（design-make-test cycles）を支援します。
- 探索生物学： 凝集および毒性マーカーのライブセルイメージングを通じて、tau変異体の仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング： 化合物ライブラリーの評価に向け、標準化された導入および凝集表現型を持つ、アッセイ準備済みの培養細胞を提供します。
- 分析： 統計的比較のために、蛍光凝集負荷、軸索長、リソソーム体積を含む定量的な従属変数を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ： 還元主義的なシステムでヒトtau病理をモデル化することにより、前臨床検証へと繋げます。
- エンタープライズ再利用： 複数のプロジェクトにわたり、複数のtau構築物、阻害剤、または遺伝子編集アプローチをテストするための再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：病原性変異体を用いてヒトのタウオパチーをモデル化し、チオフラビン陽性によって凝集塊を検証することで、ターゲットへの信頼性を高める。
- 運用的価値：定義済みの培地、導入プロトコル、および8週間の培養タイムラインを備えた、費用対効果が高く再現性のあるシステムを提供する。
- 戦略的価値：ヒトに関連する神経毒性および有効性に関する早期データを提供することで、go/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：凝集および神経突起変性のリードアウトに基づいた、リスク調整済みのタウ治療薬の開発推進を可能にする。
実施上の注意点
- 神経細胞培養、レンチウイルス導入、および蛍光顕微鏡観察の専門知識が必要です。
- ヒト神経幹細胞、レンチウイルスベクター、および適切なフィルターセットを備えたイメージング装置へのアクセスが必須となります。
- 施設間で導入力価（340,000 TU/cell）および培地組成の標準化が必要です。
- tau-RDLM-YFP以外の異なるtau変異体やレポーター構築物を使用する場合、適応に関する検討が必要となります。
- 8週間の培養期間による制限、および凝集体形成効率に潜在的な変動があることが制限要因となります。
バイオファーマFAQ
Chapters in this video
0:04
Title
0:27
Preparation of Media and Reagents
1:41
Culturing Human Neural Stem Cells
3:12
Transduction and Maintenance of Neuronal Cultures
4:05
Live-cell Imaging
4:32
Results: Analysis of Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons
5:22
Conclusion
