Name: 不活性 X 染色体上の Mecp2 の薬理学的再活性化のための非ランダムマウスモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 学ぶ不活性X染色体上のMecp2の薬理学的再活性化法。マウス脳内でXi再活性化を定量化し、Rett症候群などのX連鎖疾患治療研究に応用可能な非ランダムマウスモデルの構築手法を解説します。

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著者は、試薬を提供するためのアントニオ・ Bedalov に感謝します。バージニア大学 cryosectioning の組織体のコアバージニア大学フローサイトメトリーはフローサイトメトリー分析のコアです。キリスト教の青とジェノタイピングの技術支援のための Saloni シン。この作品は、Z.Z. へのダブルフー研究助成金によってサポートされていました, そして、バージニア大学-バージニア工科種子基金賞とハートウェル財団個々のバイオメディカル研究賞を S.B. にパイロットプロジェクトプログラム賞を受賞しました

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<li>Bhatnagar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+pharmacological+reactivation+of+the+mammalian+inactive+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12591-12598 (2014).</li>
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<li>Przanowski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+reactivation+of+inactive+X-linked+Mecp2+in+cerebral+cortical+neurons+of+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+Natlional+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Pharmacological reactivation of inactive X-linked Mecp2 in cerebral cortical neurons of living mice.</a> Proceedings of Natlional Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7991-7996 (2018).</li>
<li>Borensztein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xist-dependent+imprinted+X+inactivation+and+the+early+developmental+consequences+of+its+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Xist-dependent imprinted X inactivation and the early developmental consequences of its failure.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (3), 226-233 (2017).</li>
<li>Jensen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+histological+staining+and+fluorescence+using+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ.</a> Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).</li>
<li>Cseke, L. J., Talley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PCR-based+genotyping+method+to+distinguish+between+wild-type+and+ornamental+varieties+of+Imperata+cylindrica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A PCR-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of Imperata cylindrica.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li>
</ol>

作者は何も開示することはありません。

以前は、哺乳動物雌細胞において Xi 結合遺伝子のサイレンシングに選択的に必要とされている XCIFs が、12を同定した。さらに、マウス線維芽細胞株、マウス皮質ニューロン、およびヒト線維芽細胞における Xi-結合Mecp2を効率的に再活性化する PDPK1 の ACVR1 や下流エフェクターなど、XCIFs を標的とする強力な低分子阻害剤を最適化しました。RTT の患者から導かれるライン。これらの結果は、Xi の再活性化が X 結合疾患患者の遺伝子欠損を救出するための妥当な治療アプローチであることを示唆している。しかし、in vivo の実現性は決定されたままである。最近、XCIF 阻害剤は、 Mecp2の非ランダムXistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2マウスモデルが生成されたインビボにおいて Xi −結合した発現を再活性化することが示された。
XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfpモデルの魅力的な特徴はいくつかの理由の Xi-リンク...

X 染色体不活性化 (XCI) は、女性1の x 染色体の1つのコピーをサイレンシングすることによって x 結合遺伝子発現のバランスをとった投薬補償のプロセスである。その結果、不活性 X 染色体 (Xi) は、ヒストン H3-リジン 27 trimethylation (H3K27me3) およびヒストン H2A ユビキチン化 (H2Aub) のような、DNA メチル化および阻害ヒストン修飾を含む heterochromatin の特徴的な特徴を蓄積する2. x 染色体サイレンシングのマスターレギュレータは x 不活性化センター (Xic) 領域、約100− 500 kb であり、x 染色体の計数および対形成、不活化のための x 染色体の無作為な選択、および開始およびX 染色体3に沿ったサイレンシングの広がり。X 不活性化のプロセスは、染色体全体のサイレンシングを仲介し、X 染色体4の三次元構造を改造するために、 cisで Xi を覆う x 不活性特異的転写物 (Xist) によって開始される。最近、いくつかのプロテオームおよび遺伝スクリーンは、 Xist相互作用タンパク質5、6、7、8、9などの XCI の追加のレギュレータを同定した,10,11,12.例えば、以前の研究では偏りのないゲノム全体の RNA 干渉スクリーンを用いて、13のトランス作用性 XCI 因子 (XCIFs)12を同定した。実施、XCIFs はXist発現を調節し、したがって、XCIFs 機能を妨害すると、欠損 XCI12が生じる。この分野における最近の進歩によって、XCI を開始し維持するために必要な分子機械についての重要性が理解されています。
XCI レギュレータの同定と XCI におけるそれらのメカニズムの理解は、レット症候群 (RTT)13、14などの X 結合されたヒト疾患に直接関連する。RTT は、主として女児15に影響を及ぼす X 結合メチル CpG 結合タンパク質 2 (MECP2) におけるヘテロ接合突然変異によって引き起こされる稀な神経発達障害である。MECP2は X 染色体上に位置しているため、50% の細胞が野生型を発現し、~ 50% の変異型MECP2を発現しているMECP2欠損症に対して RTT 女児がヘテロ接合である。注目すべきことに、RTT 突然変異細胞は、Xi 上でMecp2の休眠であるが野生型のコピーを提供し、活性化されればこの疾患の症状を緩和する可能性がある機能遺伝子の供給源を与える。RTT に加えて、いくつかの他の X 結合されたヒト疾患があり、そのために、Xi の再活性化は、DDX3X 症候群などの潜在的な治療的アプローチを表す。
XCIFs の阻害は、3-ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ− 1 (PDPK1)、およびアクチビン A 受容体タイプ 1 (ACVR1)、短いヘアピン RNA (shRNA) または小分子インヒビターによって、再活性化 Xi −連結遺伝子12による。Xi 結合遺伝子の薬理学的再活性化は、マウス線維芽細胞株、成体マウス皮質ニューロン、マウス胚性線維芽細胞、および RTT 患者12に由来する線維芽細胞株を含む様々な ex インビボモデルにおいて観察される。しかしながら、Xi 結合遺伝子の薬理学的再活性化がインビボで実現可能であるかどうかは、未だ実証されていない。1つの制限要因は、再活性化 Xi からの遺伝子の発現を正確に測定するための効果的な動物モデルの欠如である。この目的のために、 XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfpマウスモデルは、母体 X 染色体16に Mecp2 でヘテロ接合欠失に起因する全ての細胞において Xi に遺伝的に標識されたXistを運ぶことを生成している。このモデルを用いて、Xi からのMecp2の発現は、生きているマウスの脳内の XCIFs 阻害剤による処置に続いて定量された。ここで、 XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2マウスモデルの生成および免疫蛍光ベースのアッセイを用いた皮質ニューロンにおける Xi 再活性化を定量する方法論が記載されている。

<table><tbody><tr><td>MICE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mecp2tm3.1Bird</td><td>ジャクソン研究所</td><td>#014610</td><td></td></tr><tr><td>B6;129-Xist (tm5Sado)</td><td>提供:Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>試薬</td> 22x22 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mm カバースリップ</td><td>FISHERfinest (Fisher Scientific)</td><td>125488</td><td></td></tr><tr><td>32% パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡 Sciences</td><td>15714-S</td><td></td></tr><tr><td>50 ml syringe</td><td>Medline Industries</td><td>NPMJD50LZ</td><td></td></tr><tr><td>60mm培養皿</td><td>CellStar</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD </td><td>BioLegend</td><td>420403</td><td></td></tr><tr><td>塩化アンモニウム (NH4Cl)</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>A661-3</td><td></td></tr><tr><td>抗GFP-AlexaFluor647</td><td>Invitrogen</td><td>A-31852</td><td></td></tr><tr><td>抗MAP2</td><td>Aves Labs</td><td>MAP</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Promega</td><td>R396D</td><td></td></tr><tr><td>ブプレノルフィン SR</td><td>Zoopharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クエン酸 </td><td>Sigma</td><td>C-1857</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>フィッシャー バイオ試薬</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ修正イーグル培地 (DMEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>VWR ライフサイエンス</td><td>89510-198</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>スライドガラス</td><td></td><td>Fisherbrand22-034-486</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗鶏FITC標識二次抗体</td><td>Aves Labs</td><td>F-1005</td><td></td></tr><tr><td>GSK650394</td><td>ApexBio</td><td>B1051</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトン10&mu;l シリンジ </td><td>ハミルトン シグマ-アルドリッチ</td><td>28615-U</td><td></td></tr><tr><td>ハンクの平衡塩溶液 (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>ケタセット</td><td>NDC 0856-2013-01</td><td></td></tr><tr><td>大型鈍器/鈍い湾曲ハサミ</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>14519-14</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>ケイマン ケミカルズ</td><td>11802</td><td></td></tr><tr><td>ロジキサノール</td><td>シグマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1343517塩化マグネシウム(MgCl2)</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>M35-212</td><td></td></tr><tr><td>メチルセルロース</td><td>シグマ</td><td>M0262-100G</td><td></td></tr><tr><td>封入剤、DAPI</td><td>ベクタシールド</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>ニードルチップ付き、26 GA x 1.25 "</td><td>PrecisionGlide</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>眼科軟膏</td><td>リフレッシュラクリルーブ</td><td>93468</td><td></td></tr><tr><td>最適な切断温度(O.C.T.) </td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR mix</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン (Pen/Strep)</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 pH 7.4 (PBS)</td><td>Corning Cellgro</td><td>46-103-CM</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P330-500</td><td></td></tr><tr><td>メスブレード</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>浅いガラスまたはプラスチックトレイ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>の皮膚接着剤/組織接着剤</td><td>3M Vetbond</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>CAS 26628-22-8</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>S642-212</td><td></td></tr><tr><td>標準止血鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>標準ピンセット</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>ストレートアイリスハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP220-1</td><td></td></tr>トリス<tr><td>ベース</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP152-5</td><td></td></tr>トリ<tr><td>トンX-100</td>フィ<td>ッシャーバイオ試薬</td><td>BP151-500</td><td></td></tr>トリ<tr><td>プシンEDTA</td><td>ギブコ</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn</td><td>NDC: 59399-111-50</td><td></td></tr><tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioObserver ライブセル顕微鏡 </td><td>Zeiss</td><td>Zeiss AxioObserver</td><td></td></tr><tr><td>0.45mm バリ</td><td>IDEAL MicroDrill</td><td>67-1000</td><td></td></tr><tr><td>BD FACScalibur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>機ガラスホモジナイザー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞培養インキュベーター</td><td>Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i 13-998-213</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica 3050S research cryostat </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>定位プラットフォーム </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>サーモサイクラー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>タイマー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター オプティマ L-100 XP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス(37&ordm;C)</td><td>フィッシャーサイエンティフィックアイソテンプ2239</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

不活性 x 染色体上の mecp2 の薬理学的再活性化のための非ランダムマウスモデル

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

X 染色体不活性化 (XCI) は、雌の 1 X 染色体のランダムサイレンシングで、男女間の遺伝子投薬バランスを達成する。その結果、全ての雌は X 結合遺伝子発現に対してヘテロ接合である。XCI の主要な調節因子の1つはXistであり、XCI の開始と維持に不可欠である。これまでの研究では、13のトランス作用 X 染色体の不活化因子 (XCIFs) を、大規模な機能喪失遺伝的スクリーンを用いて同定した。ACVR1 や PDPK1 などの XCIFs の阻害は、短ヘアピン RNA または低分子インヒビターを用いて、培養細胞において活性化 X 染色体結合遺伝子である。しかしインビボで不活性 X 染色体を再活性化することの実現可能性および忍容性は決定されないままである。この目的のために、 XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfpマウスモデルは、1つの X 染色体上のXCIの欠失により非ランダム Xist で生成されました。このモデルを用いて、不活性 X 再活性化の程度を、XCIF 阻害剤による処置後のマウス脳に定量した。最近発表された結果は、初めて、生きているマウス脳の皮質ニューロンにおける不活性 X 染色体からの XCIFs の薬理学的阻害をMecp2したことを示す。

XistΔの実現可能性を示すために、 Mecp2/Xist: xi 再活性化研究のための Mecp2-gfp マウスモデルは、XCIF 阻害剤を媒介とする xi-結合Mecp2-gfpの再活性化をマウス胚線維芽細胞 (MEFs) で試験した。女性 MEFs は、第3項に記載されているように 15.5 XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp胚の日から単離した (図 1a)。女性 XistΔの遺伝子型: Mecp2/Xist: Mecp2 MEFs は、前述したようにジェノタイピング− PCR によって確認された (図 1b)、および FACS ベースのアッセイ (図 1c)。MEFs は、DMSO または2つの薬剤 LDN193189 および GSK650394 (それぞれ0.5 μ m および2.5 μ m) ...

ここでは、非ランダム X 染色体の不活化を伴う生存可能な雌マウスモデルを生成するためのプロトコルについて述べる、すなわち、母親-継承された X 染色体は、細胞の 100% で不活性である。我々はまた、インビボにおける不活性 X 染色体の薬理学的再活性化の可能性、忍容性及び安全性を試験するプロトコールについて述べる。

不活性 X 染色体上の Mecp2 の薬理学的再活性化のための非ランダムマウスモデル

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

このプロトコルは、生きているマウスの脳内の非アクティブなXリンクMecp2染色体の再活性化をテストし、定量するための非ランダムマウスモデルを生成するために使用することができる。このモデルは、DDX3X症候群などの他のX結合疾患モデルにおけるXi再活性化を研究するために容易に変更することができる。私はサンチータ・バトナガルの研究室のポストドクターで、ゼミング・ジェンと一緒に手順をデモンストレーションします。まず、麻酔付きマウスを立体的なプラットフォームに配置し、切開器をスナッテの一口バーに引っ掛けます。マウスの頭部をレベル平面に保ちながら、鼻クランプを締めます。耳を固定して保つために外耳道の尾部に到達するために耳棒の高さを調整します。その後、局所防腐剤と70%エタノールの交互ワイプで頭部を消毒します。マウスの準備ができたら、無菌メスを使用して、メス中に0.75センチメートルの水平切開を行います。0.45ミリメートルのバリを使用して、矢状縫合糸と頭頂骨のおよそ中央にあるラムドイド縫合糸から2ミリメートルの左右の皮質半球の上に2つの対称的な穴を掘削します。10マイクロリットルのシリンジを立体的プラットフォームにしっかりと取り付け、10マイクロリットルの新しい化学インヒビターをシリンジにロードします。針を頭蓋骨に垂直に保ちながら、針を最初のバリ穴に進めます。針が頭蓋骨を横断するとき、定位デジタルディスプレイ上の座標をゼロにし、2.5ミリメートルの深さに達するまで針の先端を進めます。針0.5ミリメートルを2ミリメートルの深さまで引き出し、1分間にわたって溶液の10マイクロリットルの体積全体をゆっくりと注入します。すべての阻害剤が送達された後、針を引き出す前に、さらに1分間脳内に針を残します。制御としてのみ車両を使用して第2バリ穴への注入を繰り返し、切開部の皮膚を閉じます。次に、マウスを立体性装置から37°Cの加熱パッドに移し、完全に回復するまでモニタリングします。用量レジメンの終わりに、マウスを解剖パッドに固定する。はさみと鉗子を使用して、胸部のすぐ下の内壁と腹壁を通して横切りを行います。慎重に横隔膜から肝臓を分離し、胸膜腔を露出させるために胸部の全長に沿って横隔膜を切断します。はさみを使用して左心室の後部端に切開し、すぐに2分間にわたって約15ミリリットルのPBSで右心室を注入します。正常な灌流は、肝臓の色が赤から淡いピンクに変化します。すべてのPBSが配信されたら、2分間にわたってPBSで約10ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドで心臓を浸透させます。頭を収穫した後、頭皮に中線切開を行い、頭蓋骨を露出させるためにはさみを使用します。目に向かって頭蓋骨の横切開の作成を容易にするために、角筋マグナムにハサミの1つの先端を置きます。頭蓋骨の反対側に同様の切開を行い、はさみの端を可能な限り表面的に保ち、目とマウスの鼻の上の頭蓋骨の領域を切断します。鉗子を使用して脳半球から頭蓋骨を優しく剥がし、へらを使って脳を高めます。頭蓋神経線維を慎重に解剖し、頭蓋を頭蓋骨に固定し、脳をプラスチック皿に入れます。その後、小脳と嗅球を切除します。脳組織の切片を得るために、最初に一晩摂氏4度でPBSで4%パラホルムアルデヒドで満たされた15ミリリットルのチューブで脳を固定する。翌朝、脳組織を洗浄ごとに新鮮なPBSで摂氏4度で少なくとも3回5分間リンスする。最後の洗浄後、各半球の前部をはさみと鉗子で取り出し、サンプルをラベル付きのクライオモールドの前面に下に置きます。10ミリメートルのプラスチックペトリ皿でサンプルを液体窒素で凍結し、マイナス80°Cの貯蔵を行う前に、最適な切断温度媒体に各組織を沈めます。Xi再活性化を決定するには、5〜6マイクロメートルの脳組織切片を100°Cの熱ブロックに5分間抗原検索溶液に浸す。インキュベーションの最後に、スライドをブロッキング溶液に浸す前に、洗浄ごとに新鮮なPBSで室温で4回の5分間の洗浄でスライドを洗います。室温で20分後、スライドを洗浄ごとに新鮮な洗浄バッファーで5分間3回洗浄します。一晩摂氏4度で適切な一次抗体で組織サンプルを染色する。コントラストと明るさを調整して、マウス脳半球を治療した薬物および車両の両方に対するGFP陽性細胞の数を定量化できるように、蛍光顕微鏡上のスライドを画像化します。非非活性X染色体再活性化研究のための非ランダムX染色体不活性化マウスモデルの実現可能性を実証するために、雌のトランスジェニックマウス胚性線維芽細胞の遺伝子型を、遺伝子型PCRおよびフローサイトメトリーによって確認した。PCRによって評価されるように、GFPタグ付きメチレンCPG結合タンパク質2遺伝子またはMECP2の発現は、薬物によって再活性化されたが、車両治療では再活性化されなかった。非ランダムX染色体不活性化マウスモデル胚性線維芽細胞はまた、薬物後に核GFPを発現したが、マウス胚性線維芽細胞における不活性化X染色体結合MECP2を再活性化するX染色体不活性化因子阻害剤を示す車両治療は発現しなかった。薬物治療は、脳半球を注入した薬物中の細胞の約30%で不活性化X染色体MECP2-GFPを再活性化する一方、車両注入半球では再活性化は検出されない。微小管関連タンパク質2つの陽性ニューロンは、不活性化X染色体MECP2-GFP発現を示す薬物処理半球においてもGFP陽性である。薬物レジメンは、インビボでの試験前にインビトロで用量と治療を最適化するように、低分子阻害剤の標的と有効性に依存する。非ランダムマウスモデルは、個別に、または組み合わせて異なる薬物をテストするために利用することができる。実際、我々および他の人々はいくつかの薬剤可能なX染色体不活性化因子を同定した。

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遺伝学

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学ぶ不活性X染色体上のMecp2の薬理学的再活性化法。マウス脳内でXi再活性化を定量化し、Rett症候群などのX連鎖疾患治療研究に応用可能な非ランダムマウスモデルの構築手法を解説します。

不活性 X 染色体上の Mecp2 の薬理学的再活性化のための非ランダムマウスモデル

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